Экспресс-метод определения чувствительности грамотрицательных бактерий к бактериофагам

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа быстрого определения чувствительности грамотрицательных палочковидных бактерий к бактериофагам с помощью устройства, обеспечивающего выращивание бактерий совместно с бактериофагами в лунках с плотной питательной средой. Экспресс-метод определения чувствительности грамотрицательных бактерий к соответствующим бактериофагам предусматривает расчет коэффициента по формуле

где K - количество микроколоний в поле зрения контрольного образца, В - количество микроколоний в поле зрения образца с бактериофагом, а о степени чувствительности бактерии к бактариофагу судят по значению коэффициента, причем, если значение коеффициента k больше или равно 10, исследуемый микроорганизм считают чувствительным к бактериофагу, если значение k лежит в интервале от 2 до 10, исследуемый микроорганизм считают слабо чувствительным к бактериофагу, при значении k меньше 2, исследуемый микроорганизм считают не чувствительным к бактериофагу. Изобретение позволяет ускорить определения чувствительности грамотрицательных палочковидных бактерий к бактериофагам и уже через 2,5-3 часа судить об отношении бактериального штамма к бактериофагам. 1 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к области микробиологии и касается способа быстрого определения чувствительности грамотрицательных палочковидных бактерий к бактериофагам с помощью устройства, обеспечивающего выращивание бактерий совместно с бактериофагами в лунках с плотной питательной средой.

Бактериальные инфекции, в том числе связанные с оказанием медицинской помощи (ИСМП), представляют собой актуальную проблему современного здравоохранения, занимающую десятое место среди причин смертности населения. В настоящее время во всем мире отмечается глобальная тенденция к росту устойчивости бактерий к антибактериальным препаратам, а разработка новых препаратов идет крайне медленными темпами. Если эта тенденция продолжится, то перечень средств для борьбы с устойчивыми микроорганизмами может быть исчерпан, что приведет к тяжелым последствиям (Rhee С, Kadri SS, Dekker JP, et al. Prevalence of Antibiotic-Resistant Pathogens in Culture-Proven Sepsis and Outcomes Associated With Inadequate and Broad-Spectrum Empiric Antibiotic Use. JAMA Netw Open. 2020;3(4):e202899. Published 2020 Apr 1. DOI: 10.1001/jamanetworkopen.2020.2899). Наибольшую обеспокоенность вызывает дальнейшее распространение в стационарах возбудителей бактериальных осложнений новой коронавирусной инфекции COVID-19 (Bengoechea J A, Bamford CG. SARS-CoV-2, bacterial co-infections, and AMR: the deadly trio in COVID-19? EMBO Mol Med. 2020; 12(7):e 12560. DOI: 10.15252/emmm.202012560). Пот данным ряда авторов наиболее частым возбудителем бактериальных осложнений при COVID-19 являются грамотрицательные палочки, особенно Klebsiella pneumoniae. Они часто обладают множественной устойчивостью к антибиотикам. По некоторым данным доля резистентных штаммов может достигать 95%. По данным AMRmap - Российской онлайн платформы анализа данных резистентности к антимикробным препаратам, - резистентность российских штаммов является одной из самых высоких в мире. Поэтому необходимо вести научно-исследовательские работы для создания новых средств лечения, эффективных против инфекций с множественной лекарственной устойчивостью.

Оказание качественной медицинской помощи всецело зависит от эпидемиологической безопасности организации лечебно-диагностического процесса (Национальная концепция профилактики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.11.2011) // Справочно-правовая система «Консультант Плюс»: [Электронный ресурс] /Компания «Консультант Плюс»). Поэтому приоритетным является разработка и применение дополнительных средств борьбы с инфекционными заболеваниями, в том числе бактериофагов.

После некоторого ослабления интереса к бактериофагам в эпоху успешного применения антибиотиков медицинское сообщество вновь обратило свой взор на альтернативный антимикробный препарат. Распоряжением правительства РФ 25 сентября 2017 г. принята «Стратегия предупреждения распространения антимикробной резистентности в РФ на период до 2030 года», в которой указывается на необходимость «разработки и внедрения биологических лекарственных препаратов, в том числе препаратов на основе бактериофагов; разработки регламентов применения бактериофагов в различных областях здравоохранения, ветеринарии и растениеводстве; усовершенствования методов профилактики и лечения инфекционных заболеваний с помощью бактериофагов путем поэтапного введения препаратов бактериофагов в отраслевые стандарты в качестве противомикробных средств». В настоящее время медицинская промышленность России производит ряд бактериофаговых препаратов против ряда патогенных и условно-патогенных возбудителей инфекций. Для более быстрого выбора эффективных терапевтических фагов в качестве альтернативного антибактериального препарата необходимо в самые коротки сроки определить чувствительность выделенных культур микроорганизмов к предполагаемым к использованию бактериофагам. Однако стандартное время данного исследования (16-24 часа) слишком велико для быстрого принятия решения о выборе препарата для терапии. В связи с этим особого внимания заслуживает разработка экспресс-методов определения чувствительности бактерий к фагам. Неоспоримым преимуществом экспрессных методов определения чувствительности к бактериофагам является возможность значительного ускорения процесса назначения лечения, особенно в тех случаях, когда возбудитель инфекции устойчив к антибиотикам и единственной альтернативой может быть использование бактериофагов.

В настоящее время рядом исследователей описаны современные методы исследования чувствительности бактерий к фагам. Так, предложен способ постановки и учета результатов чувствительности к бактериофагам в иммунологических планшетах (Negm, AC, Sandulescu О, Рора М, et al. Experimental approach for bacteriophage susceptibility testing of planktonic and sessile bacterial populations - Study protocol. Germs. 2014;4(4):92-96. Published 2014 Dec 1. doi:10.11599/germs.2014.1062). Такой способ постановки удобен в реализации, однако он занимает, как и в классических методах исследования (Национальная ассоциация специалистов по контролю инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (НП «НАСКИ») - Федеральные клинические рекомендации «Рациональное применение бактериофагов в лечебной и противоэпидемической практике», 2014 г. ), 18-24 часа.

К более быстрым методам исследования чувствительности бактерий к бактериофагам относится когерентная флуктуационная нефелометрия (Экспресс-диагностика чувствительности проблемных микроорганизмов к бактериофагам с использованием отечественного когерентного флуктуационного нефелометра / В.В. Щелкова, Е.В. Русанова, А.С.Гурьев [и др.] // Проблемы медицинской микологии. - 2020. - Т. 22. - №3. - С. 152). Однако этот метод позволяет получить результат не ранее чем через 6 часов.

Более быструю оценку восприимчивости Staphylococcus aureus к стафилококковому бактериофагу удавалось получить за 3 часа с помощью безлинзового визуализирующего устройства (Perlemoine Р, Marcoux PR, Picard Е, Hadji Е, Zelsmann М, Mugnier G, Marchet A, Resch G, O'Connell L, Lacot E. Phage susceptibility testing and infectious titer determination through wide-field lensless monitoring of phage plaque growth. PLoS One. 2021 Mar 23;16(3):e0248917. doi: 10.1371/journal.pone.0248917. PMID: 33755710; PMCID: PMC7987195). Однако описанная методика на позволяет осуществлять подобные исследования без специального устройства, компьютерной программы, связанной с ним, и самое главное - не предлагает критериев оценки чувствительности и резистентности бактерий к фагу. Таким образом, оно не может быть воспроизведено в рутинной практике бактериолога.

Также описана экспрессная методика оценки эффективности специфических бактериофагов на культуре клеток (Захарова Ю. А., Федотова О. С, Шмелева Н. А. Новый способ оценки специфической активности бактериофага с использованием клеточной культуры ЛЭЧ-3 // Медицинский алфавит. Серия «Обозрение». - 2019. - Т. 3. - 32 (407). - С. 16-18), позволяющая получить результат через 3 часа. Однако для постановки этого метода необходимы специальные диплоидные клетки легкого эмбриона человека (ЛЭЧ - 3), которые должны быть стандартизированы и поддерживаться в определенных условиях. Это также неудобно для использования в рутинной практике бактериологической лаборатории.

Изобретение направлено на разработку экспрессного определения чувствительности грамотрицательных бактерий к бактериофагам. При этом сокращено время определения чувствительности, что способствует более быстрому назначению терапии, и количества реагентов, используемых для постановки метода, что делает этот способ более экономически выгодным.

Экспресс-метод определения чувствительности грамотрицательных бактерий к бактериофагам предусматривает внесение в питательную среду инокулята бактерии и исследуемые жидкие препараты бактериофагов. Через 2,5-3 часа нахождения исследуемого образца при температуре 36,8+0,2°С его рассматривают под микроскопом с увеличением не менее 400 крат. Затем подсчитывают в поле зрения микроскопа количество выросших микроколоний грамотрицательных бактерий, которое сравнивают с количеством микроколоний в образце без бактериофага. Далее рассчитывают коэффициент, по значению которого судят о степени чувствительности бактерии к бактариофагу. Коеффициент рассчитывают по формуле:

где K - количество микроколоний в поле зрения контрольного образца, В - количество микроколоний в поле зрения образца с бактериофагом, а о степени чувствительности бактерии к бактариофагу судят по значению коэффициента, причем, если значение коэффициента k больше или равно 10, исследуемый микроорганизм считают чувствительным к бактериофагу, если значение k лежит в интервале от 2 до 10, исследуемый микроорганизм считают слабо чувствительным к бактериофагу, при значении к меньше 2, исследуемый микроорганизм считают не чувствительным к бактериофагу.

Пограничные значения коэффициентов получены путем сопоставления с результатами исследования чувствительности к бактериофагам, полученными с использованием классического метода (Федеральные клинические рекомендации «Рациональное применение бактериофагов в лечебной и противоэпидемической практике», (2014 г.)).

Время выращивания бактерий определено эмпирическим путем, так как в течение этого времени вырастает достаточное количество микроколоний. Температура инкубации является стандартной при такого рода исследованиях.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фигуре 1 представлен вид слайда с культурами бактерий и бактериофагами.

Изобретение реализуется следующим образом: слайд FAST®, который представляет из себя пластиковую рамку с 16-ю сквозными отверстиями размерами 6x6x2 мм (2 ряда по 8 в каждом ряду) располагается в стерильной чашке Петри (рис. 1); лунки заполняются питательным агаром (температура 45°С), приготовленным из сухой среды промышленного производства в соответствии с инструкцией изготовителя; после застывания и подсушивания поверхности агара в лунки закапывается по 1 капле (25 мкл) инокулята бактерии в концентрации 1,5⋅108 КОЕ/мл (как и при определении чувствительности к АБП в соответствии с МУК 4.12.1890-04), приготовленный на физиологическом растворе NaCl; через несколько минут после подсыхания культуры на ее поверхность наносят по капле исследуемые жидкие препараты бактериофагов, предварительно промаркировав лунки (при этом одна или две лунки остаются свободными от бактериофагов, так как они будут служить контролями при подсчете колоний); чашка Петри накрывается крышкой и ставится в термостат на 3 часа при температуре 37°С; после этого чашка достается из термостата, крышка открывается, нижняя часть чашки вместе со слайдом устанавливается под объектив микроскопа с увеличением в 40 раз (таким образом, при увеличении окуляра в 10 раз достигается увеличение в 400 раз) и производится фокусировка над лункой с контролем культуры; подсчитывается количество микроколоний изучаемых бактерий в поле зрения, о чем производится запись; далее объектив перемещается к лунке с бактериофагом, производится подсчет микроколоний в поле зрения; рассчитывается коэффициент по формуле:

где k - коэффициент, K - количество микроколоний в поле зрения контрольного образца, В - количество микроколоний в поле зрения образца с бактериофагом.

В зависимости от полученных результатов в заключении указывается степень чувствительности конкретного микроорганизма к действию конкретного бактериофага:

1) k больше или равно 10 - исследуемый микроорганизм чувствителен к бактериофагу;

2) k больше или равно 2, но менее 10 - исследуемый микроорганизм слабо чувствителен к бактериофагу;

3) k менее 2 - исследуемый микроорганизм не чувствителен к бактериофагу.

В случае, если В равно 0, считаем, что этот показатель равен 1, и штамм признается чувствительным к бактериофагу.

Примеры, подтверждающие результаты от реализации способа, представлены в таблицах 1 и 2.

При подсчете микроколоний необходимо иметь в виду, что учету подлежат только сформировавшиеся микроколонии; отдельно лежащие бактериальные клетки не

учитываются, как клетки, не имеющие возможности выжить и/иди сформировать колонию.

Все проведенные эксперименты сверяли с классическим методом определения чувствительности к бактериофагам согласно Федеральным клиническим рекомендациям «Рациональное применение бактериофагов в лечебной и противоэпидемической практике», (2014 г, зудьтате уже через 2,5-3 часа можно судить об отношении бактериального штамма к бактериофагам. Этот способ не требует дополнительного оснащения, легко выполним в бактериологической лаборатории любого уровня. Он позволит получать результат в 6-8 раз быстрее, чем при использовании классической методики, что в свою очередь позволит своевременно назначить пациенту адекватную терапию, а значит, улучшить его состояние здоровья.

Экспресс-метод определения чувствительности грамотрицательных бактерий к бактериофагам, предусматривающий внесение в питательную среду инокулята бактерии и исследуемые жидкие препараты бактериофагов, отличающийся тем, что через 2,5-3 часа нахождения исследуемого образца при температуре 36,8±0,2°С его рассматривают под микроскопом с увеличением не менее 400 крат с последующим подсчетом в поле зрения микроскопа количества выросших микроколоний грамотрицательных бактерий, которое сравнивают с количеством микроколоний в образце без бактериофага, и рассчитывают коэффициент по формуле

где K - количество микроколоний в поле зрения контрольного образца, В - количество микроколоний в поле зрения образца с бактериофагом, а о степени чувствительности бактерии к бактариофагу судят по значению коэффициента, причем, если значение коеффициента k больше или равно 10, исследуемый микроорганизм считают чувствительным к бактериофагу, если значение k лежит в интервале от 2 до 10, исследуемый микроорганизм считают слабо чувствительным к бактериофагу, при значении k меньше 2, исследуемый микроорганизм считают не чувствительным к бактериофагу.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая антитело против CD147 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которое активирует сигнальную трансдукцию посредством CD147 (варианты), противоопухолевую композицию, содержащую вышеуказанное антитело, где опухоль представляет собой опухоль, экспрессирующую CD147, способ лечения опухоли, экспрессирующей CD147, и применение антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, или композиции для лечения опухоли, где опухоль является опухолью, экспрессирующей CD147.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для персонализированного комбинированного лечения немелкоклеточного рака легкого II-III стадии. Выполняют радикальную анатомическую резекцию с медиастинальной ипсилатеральной лимфодиссекцией с интраоперационной лучевой терапией с разовой дозой РОД 10,0 Гр.

Изобретение относится к охране окружающей среды, а именно способам определения степени загрязнения природных и сточных вод лигнинными веществами в зоне влияния целлюлозно-бумажных производств, и может быть использовано при анализе сточных вод. Способ определения массовой концентрации лигнинных веществ в природных, сточных и очищенных сточных водах целлюлозно-бумажных предприятий включает отбор пробы воды, измерение оптической плотности и определение концентрации лигнинных веществ по калибровочному графику для стандартного образца.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования ранних рецидивов светлоклеточной карциномы тела матки. Определяют относительную экспрессию генов CDKN2A, L1CAM, ERBB2 и UBE2C в опухолевой ткани по отношению к нормальной ткани эндометрия методом ПЦР в реальном времени.

Изобретение относится к исследованию работы двигателя внутреннего сгорания (ДВС) со сжатием воздуха и с самовоспламенением и анализу влияния моторных топлив различного компонентного, углеводородного, фракционного состава на процесс сгорания в поршневом ДВС с помощью тепловых средств, в частности по снятым развернутым индикаторным диаграммам, и может быть использовано во всех лабораториях, имеющих моторные стенды и проводящих исследования различных видов топлива для поршневых ДВС.

Изобретение относится к биотестированию токсичности природных, сточных вод, водных растворов и водных вытяжек из отходов. Раскрыт способ экспонирования тест-организмов при биотестировании водных сред, выполняемый на пробах, помещенных в светопрозрачные емкости и размещенных по окружности во вращающуюся кассету, которая установлена наклонно в климатической камере, при этом емкости с пробами загружают в кассету, а скорость вращения кассеты составляет для тест-организмов – водоросль Chlorella vulgaris 40-50 об/мин, водоросль Dunaliella tertiolecta 25-30 об/мин, рачки Artemia salina L.

Изобретение относится к медицине, а именно к внутренним болезням, и может быть использовано для прогнозирования развития плоскостопия у молодых лиц. Проводят выделение ДНК из периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции, генотипирование методом ПЦР локуса rs226794 гена ADAMTS5 и локуса rs1470527 гена BMP5.
Изобретение относится к медицине, лечебной физкультуре и физиотерапии, методам проведения лечебной физкультуры у пациентов после перенесенных респираторно-вирусных инфекций, осложненных двухсторонней пневмонией, и может быть использовано на начальных этапах медицинской реабилитации в лечебно-профилактических учреждениях и санаторно-курортных организациях.

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии и микробиологии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития обострения хронического гингивита у пациентов, перенесших новую коронавирусную инфекцию. Оценивают наличие видов микроорганизмов, выделенных из десневого желобка: Streptococcus oralis, Neisseria elongata, Streptococcus intermedius, Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium durum, Neisseria subflava, Neisseria flavescens, Streptococcus sanguinis, Streptococcus mitis, Streptococcus gordonii, Veillonella parvula – 1 группа и Haemophilus parainfluenzae – 2 группа.
Изобретение относится к области медицины, в частности к детской оториноларингологии, аллергологии, клинической фармакологии, может быть использовано в практике врачей - педиатров, оториноларингологов, аллергологов, семейных врачей, клинических фармакологов для прогнозирования аллергического ринита в послеоперационном периоде эндоскопической аденотомии у детей с гипертрофией глоточной миндалины.
Наркология
Наверх