Конъюгированные с жирной кислотой производные gnrh пролонгированного действия и фармацевтические композиции, содержащие их
Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая конъюгированное с жирной кислотой производное гонадотропин-рилизинг-гормона (GnRH) пролонгированного действия или его фармацевтически приемлемая соль для введения субъекту и фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения заболевания, зависимого от половых гормонов, содержащая вышеуказанное конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH. В одном из вариантов реализации изобретения конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH содержит жирную кислоту, выбранную из лауриновой или арахидиновой кислоты, и содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11. Изобретение расширяет арсенал средств для предупреждения или лечения заболеваний, зависимых от половых гормонов. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 12 ил., 8 табл., 6 пр.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к новым конъюгированным с жирной кислотой производным гонадотропин-рилизинг-гормона (GnRH) пролонгированного действия и фармацевтическим композициям, содержащим их.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В целом, гонадотропин-рилизинг-гормон (GnRH) или рилизинг-гормон лютеинизирующего гормона представляет собой нейрогормон гипоталамуса и является отдельным типом нейроэндокринного пептида. В частности, GnRH синтезируется в терминальных нейроваскулярных клетках гипоталамуса и действует на гонадотропные клетки передней доли гипофиза, стимулируя синтез и высвобождение лютеинизирующего гормона (LH) или фолликулостимулирующего гормона (FSH), оба из которых являются гонадотропинами. Лютеинизирующие гормоны или фолликулостимулирующие гормоны, синтез и высвобождение которых контролируются GnRH, играют роль в контроле мужских и женских половых гормонов и созревании репродуктивных клеток.
Известно, что хотя при нормальных концентрациях GnRH оказывает действие в виде стимуляции секреции гонадотропина или овуляции, при высоких концентрациях он оказывает антагонистическое ингибирующее действие, которое является противоположным. Высокая доза GnRH может применяться для лечения рака предстательной железы или рака молочной железы, которые представляют собой гормонозависимые опухоли, а также эндометриоза, фибромиомы матки, преждевременного полового созревания центрального генеза и аденомиоза и т.д. Также широко известно, что GnRH или производные GnRH можно применять при лечении различных заболеваний, зависимых от половых гормонов (Kumar P. и Sharma A, J Hum Reprod Sci, 2014; 7(3): стр. 170-174).
Что касается коммерчески доступных терапевтических средств, содержащих GnRH, существуют продукты с замедленным высвобождением, предназначенные для инъекции через один или три месяца, которые представлены в форме биоразлагаемых многоядерных запасающих микрокапсул (PLGA или PLA), содержащих агонист GnRH. В частности, продукт с замедленным высвобождением, содержащий производное GnRH, является коммерчески доступным под торговым названием депо-препарат Lupron®. Этот коммерческий продукт содержит микросферы из PLGA [сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты] в качестве ингредиента, обеспечивающего замедленное высвобождение, и производное GnRH, представляющее собой лейпролида ацетат, в качестве активного ингредиента. Вследствие применения биоразлагаемого полимера депо-препарат Lupron® следует вводить внутримышечно или подкожно в большой дозе. Причем это сопровождается болью или повреждением ткани в месте инъекции, и в нем в течение нескольких месяцев сохраняется уплотнение с периодически наблюдаемыми случаями воспаления, поскольку биоразлагаемые полимеры не полностью всасываются даже через один месяц. Что касается депо-препарата Lupron®, эти недостатки обусловлены тем фактом, что его вводят после того, как добавляют биоразлагаемый полимер и физически смешивают с производным GnRH. Когда биоразлагаемый полимер физически смешивают с производным GnRH, производное GnRH окружено слоями биоразлагаемого полимера. По мере in vivo разложения биоразлагаемого полимера, окружающего производное GnRH, производное GnRH высвобождается, обеспечивая фармакологический эффект. В то же время, поскольку биоразлагаемый полимер смешивают физически, имеется побочное действие, заключающееся в том, что в процессе разложения биоразлагаемый полимер остается in vivo в течение длительного периода времени.
Хотя для преодоления этих недостатков депо-препарата Lupron® были дополнительно разработаны другие продукты, включая Eligard®, они все еще имеют недостатки с точки зрения начального высвобождения лекарственного средства, низкой стабильности лекарственного средства в фазе смешанного раствора и т.д. Таким образом, остается потребность в разработке составов или лекарственных форм, которые обеспечат возможность поддержания высоких уровней GnRH в крови в течение продолжительного периода времени.
Существующие продукты с замедленным высвобождением GnRH, которые предназначены для медленного высвобождения GnRH в кровь, содержат дополнительные ингредиенты, обеспечивающие замедленное высвобождение, для высвобождения активного ингредиента в течение продолжительного периода времени. Соответственно, общая доза продуктов увеличивается, что приводит к таким проблемам, как боль, остаточные ощущения в месте инъекции, низкая стабильность лекарственного средства и т.д. В частности, среди пациентов, которые проходили лечение существующими продуктами (лейпролида ацетат), не менее 23-30% пациентов жаловались на боль в местах инъекции (Lee PA et al., J. Clin, Endocrinol Metab, 2014).
В то же время в патенте США № 9694051 раскрыто, что конъюгированный пептид адреномедуллина, где с лизином (Lys) в N-концевых областях некоторых пептидов адреномедуллина конъюгирован алкильный фрагмент, характеризуется увеличением периода полужизни в крови. Хотя вследствие конъюгирования алкильного фрагмента с N-концевой областью пептида наблюдается увеличение периода полужизни пептида в крови, данный пептид весьма отличается от GnRH с точки зрения функции и последовательности. Кроме того, данный пептид отличается от GnRH тем, что концевой аминокислотный остаток пептида, с которым конъюгирован алкильный фрагмент, представляет собой лизин.
При таких обстоятельствах автор настоящего изобретения приложил усилия для разработки состава пролонгированного действия на основе GnRH, в котором GnRH сам по себе характеризуется продолжительным периодом полужизни in vivo и повышенной биодоступностью, в отличие от существующих составов с замедленным высвобождением, которые имеют недостатки, обусловленные дополнительными ингредиентами или структурой составов для замедленного высвобождения и т.д. В частности, конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH пролонгированного действия получали путем конъюгирования жирной кислоты с производным GnRH, что предназначено для увеличения периода полужизни GnRH in vivo и превращения конъюгата в солевую форму. Было обнаружено, что конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH пролонгированного действия проявляет превосходную биодоступность и продолжительный период полужизни in vivo, поддерживается на высоком уровне в крови и оказывает терапевтическое действие на заболевания, зависимые от половых гормонов, или сдерживает половое созревание, что привело к настоящему изобретению.
Конъюгированные с жирной кислотой производные GnRH пролонгированного действия согласно настоящему изобретению и фармацевтическую композицию, содержащую их, можно применять для предупреждения и лечения различных заболеваний, зависимых от половых гормонов, или для сдерживания полового созревания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
Принимая во внимание вышеупомянутые проблемы с существующими составами с замедленным высвобождением, целью настоящего изобретения является разработка состава пролонгированного действия на основе GnRH, характеризующегося повышенной биодоступностью и собственным периодом полужизни GnRH in vivo, который составляет от 2 до 4 минут в циркулирующей крови. Таким образом, задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы обеспечить конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH пролонгированного действия, характеризующееся легкостью введения и улучшенной эффективностью, а также фармацевтическую композицию, содержащую его.
Приведшее к настоящему изобретению тщательное изучение, проведенное автором настоящего изобретения в отношении производного GnRH с повышенной биодоступностью и увеличенным периодом полужизни GnRH самого по себе in vivo, который в природной форме характеризуется периодом полужизни в циркулирующей крови, составляющим от 2 до 4 мин, привело к обнаружению того, что конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH пролонгированного действия, которое представляет собой производное GnRH с конъюгированной с ним жирной кислотой, и его фармацевтически приемлемая соль обладают улучшенной эффективностью и увеличенным периодом полужизни in vivo.
Используемый в данном документе термин «улучшенная эффективность» конъюгированного с жирной кислотой производного GnRH пролонгированного действия означает, что при одинаковой концентрации с природным GnRH оно оказывает более сильное терапевтическое действие на заболевания, связанные с половыми гормонами. Например, это означает, что конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH пролонгированного действия проявляет более сильные цитотоксические эффекты в отношении рака предстательной железы или рака молочной железы при введении в той же дозе, что и природный GnRH или коммерчески доступное производное GnRH.
При нормальных концентрациях GnRH оказывает действие в виде стимуляции высвобождения гонадотропинов или овуляции, в то время как при высоких концентрациях он оказывает антагонистическое ингибирующее действие, которое является противоположным. Соответственно, высокие концентрации GnRH подавляют прогрессирование заболеваний, усугубляемых половыми гормонами, или являются эффективными для облегчения и лечения заболеваний, зависимых от половых гормонов.
Далее в данном документе будет представлено подробное описание производного GnRH; конъюгированного с жирной кислотой производного GnRH пролонгированного действия, которое предусматривает производное GnRH с конъюгированной с ним жирной кислотой, или его фармацевтически приемлемой соли, а также содержащих их фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.
1. Конъюгированные с жирной кислотой производные GnRH пролонгированного действия
Аспект настоящего изобретения относится к конъюгированному с жирной кислотой производному GnRH пролонгированного действия, которое представляет собой производное гонадотропин-рилизинг-гормона (GnRH) с конъюгированной с ним жирной кислотой, или его фармацевтически приемлемой соли.
Используемый в данном документе термин «гонадотропин-рилизинг гормон (GnRH)» относится к гормону, синтезируемому в терминальных нейроваскулярных клетках гипоталамуса, и он действует на гонадотропные клетки передней доли гипофиза, стимулируя синтез и высвобождение лютеинизирующего гормона (LH) или фолликулостимулирующего гормона (FSH), оба из которых являются гонадотропинами. Последовательность GnRH у разных видов может отличаться. Природный GnRH млекопитающих может иметь следующую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1.
[Последовательность GnRH млекопитающих]
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly (SEQ ID NO: 1).
Используемый в данном документе термин «производное GnRH» относится к веществу, которое по структуре является аналогичным GnRH, но может действовать иным образом in vivo. На ранней стадии после введения производное GnRH, в частности соответствующее агонисту GnRH, связывается с рецептором GnRH, стимулируя in vivo синтез и секрецию фолликулостимулирующего гормона (FSH) и лютеинизирующего гормона (LH) на определенном уровне. Однако длительное поддержание концентрации производного GnRH in vivo приводит к истощению гонадотропинов и снижению количества рецепторов GnRH, что приводит к противоположному действию (т.е. антагонистическому действию), заключающемуся в том, что синтез и секреция FSH и LH, наоборот, подавляются. Следовательно, благодаря таким эффектам производные GnRH могут применяться для предупреждения или лечения заболеваний, зависимых от половых гормонов, и для сдерживания полового созревания.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения производное GnRH является агонистом GnRH, который может быть выбран из группы, состоящей из лейпролида, гозерелина, трипторелина, нафарелина, бусерелина, гистрелина, деслорелина, метерелина, гонадорелина и их модифицированных производных.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения производное GnRH имеет последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% гомологией с существующими агонистами GnRH.
В частности, производное GnRH по настоящему изобретению может иметь последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% гомологией с природным GnRH, лейпролидом, гозерелином, трипторелином, нафарелином, бусерелином, гистрелином, деслорелином, метерелином или гонадорелином, и, более конкретно, последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% гомологией с GnRH (SEQ ID NO: 1) или лейпролидом (SEQ ID NO: 2).
В варианте осуществления настоящего изобретения производное GnRH представляет собой модифицированный лейпролид, где первая аминокислота лейпролида, представляющая собой глутаминовую кислоту, замещена другой аминокислотой, более конкретно, глутамином.
В варианте осуществления настоящего изобретения производное GnRH может содержать или состоять из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-11.
В варианте осуществления настоящего изобретения производное GnRH может означать производное, имеющее дополнительную модификацию в существующем GnRH или производном GnRH.
В частности, производное GnRH в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения может представлять собой конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH пролонгированного действия, которое представляет собой производное GnRH с конъюгированной с ним жирной кислотой, или его фармацевтически приемлемую соль. Более конкретно, жирная кислота может быть конъюгирована с амино-концом производного GnRH.
В варианте осуществления настоящего изобретения жирная кислота может представлять собой насыщенную или ненасыщенную C6-C30жирную кислоту, которая может иметь линейную или разветвленную структуру. В варианте осуществления настоящего изобретения конкретные примеры жирной кислоты включают без ограничения капроновую кислоту, энантовую кислоту, каприловую кислоту, пеларгоновую кислоту, каприновую кислоту, ундециловую кислоту, лауриновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, арахидиновую кислоту, бегеновую кислоту, лигноцериновую кислоту, церотиновую кислоту, миристолеиновую кислоту, пальмитолеиновую кислоту, линоленовую кислоту, альфа-линоленовую кислоту (ALA), эйкозапентаеновую кислоту (EPA), докозагексаеновую кислоту (DHA), линолевую кислоту (LA), гамма-линолевую кислоту (GLA), дигомо-гамма-линолевую кислоту (DGLA), арахидоновую кислоту (AA), олеиновую кислоту, вакценовую кислоту, элаидиновую кислоту, эйкозановую кислоту, эруковую кислоту и нервоновую кислоту. При условии, что достигается цель настоящего изобретения, без ограничений может использоваться любая жирная кислота. Лауриновая кислота, также имеющая систематическое название додекановая кислота, представляет собой насыщенную жирную кислоту с неразветвленной цепью из 12 атомов углерода и существующую в природе как компонент триглицеридов. Ее структура является стабильной, и она встречается в качестве одного из главных компонентов человеческого грудного молока. Точка плавления данной жирной кислоты составляет 43,8°C, и при комнатной температуре она представляет собой белое твердое вещество.
Используемый в данном документе термин «пальмитиновая кислота» обозначает углеводородную цепь с карбоксильной группой, которая представляет собой гидрофобную неразветвленную насыщенную жирную кислоту с 16 атомами углерода и имеет одну карбоксильную группу (-COOH).
Используемый в данном документе термин «арахидиновая кислота» или «эйкозановая кислота» обозначает насыщенную жирную кислоту с неразветвленной цепью из 20 атомов углерода. Ее точка плавления составляет 75,5°C, и при комнатной температуре она представляет собой белое твердое вещество.
Благодаря конъюгации с пальмитиновой кислотой производное GnRH пролонгированного действия согласно варианту осуществления настоящего изобретения имеет следующие преимущества: i) улучшенную реабсорбцию в почках и эффективность накопления в жире; ii) защитный эффект, обусловленный повышением связывания с белками сыворотки крови; iii) задержку почечного клиренса в результате повышенной гидрофобности серий аналогов и iv) увеличение времени высвобождения и фармацевтической эффективности в результате прикрепления к липидным мембранам или биологическим мембранам.
Эмульсия дексаметазона пальмитата, в которой пальмитиновая кислота конъюгирована с дексаметазоном, как известно, проявляет противовоспалительный эффект, который в 5,6 раза превышает таковой у дексаметазона отдельно при такой же дозе (Peng et al., Drug Development and Industrial Pharmacy, 2010: 36(12)). Примерами коммерчески доступных продуктов пролонгированного действия, которые составлены путем конъюгации с жирными кислотами, являются INVEGA TRINZA®, где с жирной кислотой конъюгирован палиперидон, и Lipotalon®, где с жирной кислотой конъюгирован дексаметазон.
Известно, что при конъюгировании пальмитиновой кислоты с гормонами или ферментами период полужизни in vivo у гормонов или ферментов увеличивается вследствие вышеуказанного механизма. Однако их растворимость в воде может быть значительно снижена вследствие повышенной гидрофобности молекулы. Кроме того, это может быть причиной межмолекулярной агрегации в водной среде или образования внутримолекулярных гидрофобных связей в гидрофобных участках белка. Следовательно, после конъюгирования белков с жирной кислотой, такой как пальмитиновая кислота, могут наблюдаться такие недостатки, как снижение стабильности состава, биодоступности и активности белка.
В связи с этим существует необходимость в соответствующей стратегии получения составов для увеличения периода полужизни in vivo у белков путем конъюгации с жирной кислотой, при этом не снижая эффективность конкретного белка и не вызывая агрегацию белка.
Предусматривается, что используемый в данном документе термин «фармацевтически приемлемая соль» охватывает все фармацевтически приемлемые соли, которые могут применяться с целью увеличения стабильности, растворимости в воде, биодоступности и т.д., конъюгированного с жирной кислотой производного GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения, но не ограничивается ими.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтически приемлемая соль может быть выбрана из группы, состоящей из неорганических кислот, органических кислот, солей аммония, солей щелочных металлов и солей щелочноземельных металлов. В другом варианте осуществления фармацевтически приемлемая соль может быть выбрана из группы, состоящей из гидрохлорида, гидробромида, фосфата, метафосфата, нитрата, сульфата, ацетата, сульфоната, бензоата, цитрата, этансульфоната, фумарата, лактата, малеата, малата, сукцината, тартрата, натриевой соли, кальциевой соли, калиевой соли и магниевой соли.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH по настоящему изобретению может включать или может состоять из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4-11, где с амино-концом производного GnRH может быть конъюгирована лауриновая кислота, пальмитиновая кислота или арахидиновая кислота, и фармацевтически приемлемая соль может представлять собой натриевую соль или ацетат.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH может содержать или может состоять из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 3 или 4, где с амино-концом производного GnRH может быть конъюгирована лауриновая кислота, и фармацевтически приемлемая соль может представлять собой ацетат.
В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное GnRH может содержать или может состоять из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 9 или 10, где с амино-концом производного GnRH может быть конъюгирована арахидиновая кислота, и фармацевтически приемлемая соль может представлять собой ацетат.
2. Фармацевтические композиции, содержащие конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH
Аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH пролонгированного действия согласно варианту осуществления настоящего изобретения в качестве активного ингредиента.
В варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция может дополнительно содержать циклодекстрин. При этом циклодекстрин может представлять собой α-циклодекстрин, β-циклодекстрин или γ-циклодекстрин и, в частности, может представлять собой метил-β-циклодекстрин. Однако может использоваться любой циклодекстрин при условии, что достигается цель настоящего изобретения.
В варианте осуществления настоящего изобретения конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH пролонгированного действия может быть включенным в циклодекстрин. В этой связи конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH и циклодекстрин могут образовывать комплекс включения.
В варианте осуществления настоящего изобретения циклодекстрин может образовывать комплекс включения с активным ингредиентом, который трудно растворить в воде, за счет чего у нерастворимого в воде ингредиента обеспечивается стабильность, улучшение растворимости и равномерное высвобождение в водном растворе. Следовательно, в варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая комплекс включения из конъюгированного с жирной кислотой производного GnRH пролонгированного действия и циклодекстрина, может демонстрировать улучшение равномерности высвобождения производного GnRH.
В настоящем изобретении циклодекстрин представляет собой нередуцирующий циклический олигосахарид, состоящий из макроциклического кольца из субъединиц глюкозы (C6H10O5)n, соединенных α-1,4 гликозидными связями, называемый α-циклодекстрином, β-циклодекстрином и γ-циклодекстрином при n=6, 7 и 8 соответственно.
В варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция может содержать циклодекстрин и активный ингредиент, представляющий собой конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH пролонгированного действия, при молярном соотношении от приблизительно 7:1 до 1:1, от 6:1 до 1:1 или от 5:1 до 1:1. При таких весовых соотношениях фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления настоящего изобретения может демонстрировать превосходную растворимость.
В варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит фармацевтически эффективное количество конъюгированного с жирной кислотой производного GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения и может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Используемый в данном документе термин «фармацевтически эффективное количество» означает количество, достаточное для обеспечения эффективности или активности конъюгированного с жирной кислотой производного GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения.
Фармацевтически приемлемые носители, которые могут быть включены в фармацевтическую композицию согласно варианту осуществления настоящего изобретения, представляют собой широко используемые для приготовления состава, и примеры фармацевтически приемлемого носителя включают лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмал, аравийскую камедь, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло, но не ограничиваются ими.
В дополнение к вышеуказанным ингредиентам фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления настоящего изобретения может дополнительно содержать смазывающее вещество, увлажнитель, подсластитель, ароматизатор, эмульгатор, суспендирующее средство, консервант и т.п.
В варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция может вводиться перорально или парентерально. В частности, в случае инъекционных путей введения ее можно вводить в виде лекарственной формы, предназначенной либо для подкожной инъекции, либо для внутримышечной инъекции. Лекарственная форма может быть выбрана с учетом различных факторов, таких как эффект контроля концентраций in vivo.
В варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может вводиться в лекарственной форме, представляющей собой инъекционный препарат, пасту, гелеобразное средство, лосьон, капсулу, таблетку, жидкий препарат, суспензию, спрей, ингаляционный препарат, глазные капли, адгезивное средство или пластырь и, в частности, инъекционный препарат.
В варианте осуществления настоящего изобретения подходящая дозировка фармацевтической композиции варьируется в зависимости от различных факторов, в том числе от способа получения состава, способа введения дозы, возраста, массы тела, пола пациента и тяжести течения заболевания, питания, времени введения, пути введения, скорости выведения и чувствительности ответа. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению обычно вводят в дозе, составляющей 0,001-100 мг/кг для взрослого. Фармацевтическая композиция содержит конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH по настоящему изобретению в количестве, составляющем приблизительно 0,001-30 мг/мл.
В варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается, что термин «приблизительно» охватывает допустимую погрешность для способа или корректировку чисел, соответствующую технической сущности настоящего изобретения. Например, термин «приблизительно» относится к относительным терминами, обозначающим приближенное значение, составляющее ±10% от номинального значения, к которому оно относится, причем в одном варианте осуществления оно составляет ±5%, и в другом варианте осуществления составляет ±2%. Для области техники, к которой относится настоящее изобретение, данный уровень приближения является подходящим, за исключением тех случаев, когда конкретно указано, что для значения требуется более узкий диапазон.
В варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция составлена с применением фармацевтически приемлемого носителя и/или наполнителя в соответствии со способом, который может легко осуществить рядовой специалист в данной области техники. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть получена в виде стандартной лекарственной формы или может быть помещена в многодозный контейнер. При этом состав может быть представлен в форме раствора, суспензии, сиропа или эмульсии в масляной или водной среде или в форме экстракта, порошка, гранул, таблетки или капсулы, и он может дополнительно содержать диспергирующее вещество или стабилизатор.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция может применяться для предупреждения или лечения заболевания, зависимого от половых гормонов, или для сдерживания полового созревания. Заболевание, зависимое от половых гормонов, может быть выбрано из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака молочной железы, рака яичника, эндометриоза, фибромиомы матки, поликистоза яичников, преждевременного полового созревания центрального генеза, гипертрихоза, гонадотропной аденомы гипофиза, апноэ во время сна, синдрома раздраженного кишечника, предменструального синдрома, доброкачественной гиперплазии предстательной железы и бесплодия, но не ограничивается ими.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения при применении в комбинации с традиционным биоразлагаемым полимером фармацевтическая композиция может демонстрировать заметно превосходящий период полужизни in vivo. Соответственно, фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления настоящего изобретения может дополнительно содержать биоразлагаемые полимеры.
В варианте осуществления настоящего изобретения биоразлагаемый полимер позволяет доставлять лекарственное средство через организм парентеральными путями или позволяет полимеру, содержащему производное GnRH по настоящему изобретению или его соль, локально воздействовать на конкретное место. Что касается биоразлагаемого полимера в настоящем изобретении, можно сослаться на Chasin M et al. («Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems», New York, Marcel Dekker, 1990) или D. Wescman et al. («Handbook of Biodegradable Polymers», Taylor & Francis, 1998), но без ограничения ими.
В качестве примера, биоразлагаемый полимер согласно варианту осуществления настоящего изобретения может представлять собой PLA (полимолочную кислоту), линейный или разветвленный PLGA (сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты), PGA (полигликолевую кислоту), гидрогель и т.п.
Согласно аспекту настоящего изобретения в нем дополнительно предусмотрен способ и применение для сдерживания полового созревания или способ и применение для предупреждения или лечения симптома или заболевания, связанных с половыми гормонами, путем введения конъюгированного с пальмитиновой кислотой производного GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения, его соли или композиции, содержащей их, млекопитающим, включая человека.
Аспект настоящего изобретения относится к применению конъюгированного с жирной кислотой производного GnRH или его соли согласно варианту осуществления настоящего изобретения в сдерживании полового созревания или предупреждении или лечении симптома или заболевания, связанных с половыми гормонами.
Аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции для применения в сдерживании полового созревания или предупреждении или лечении симптома или заболевания, связанных с половыми гормонами, композиции, содержащей конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения, его соль или их оба.
Аспект настоящего изобретения относится к применению конъюгированного с жирной кислотой производного GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения или его соли для получения фармацевтической композиции (или лекарственного препарата) для сдерживания полового созревания или предупреждения или лечения симптома или заболевания, связанных с половыми гормонами.
Ожидается, что превосходная биодоступность и увеличенный период полужизни in vivo нового конъюгированного с жирной кислотой производного гонадотропин-рилизинг-гормона (GnRH) пролонгированного действия согласно варианту осуществления настоящего изобретения будут в значительной степени способствовать уменьшению частоты введения доз и дозировки. В частности, конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH пролонгированного действия могло бы преодолеть проблемы существующих составов на основе GnRH с замедленным высвобождением, такие как неблагоприятные эффекты в виде остаточного ощущения и боли в месте инъекции.
Кроме того, конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH пролонгированного действия и фармацевтическая композиция, содержащая его, согласно варианту осуществления настоящего изобретения демонстрируют заметно превосходящие терапевтические действия на заболевания, зависимые от половых гормонов, и в связи с этим, ожидается, что они внесут большой вклад в уменьшение частоты введения доз и дозировки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На фиг. 1 показаны фотографии, на которых невооруженным глазом видны объемы суспензий, образованных фармацевтическими композициями (примеры 9, 10, 15 и 16), содержащими конъюгированные с жирной кислотой производные GnRH (примеры 1, 2, 7 и 8) согласно варианту осуществления настоящего изобретения и циклодекстрин.
На фиг. 2 показаны фотографии, на которых невооруженным глазом видны объемы суспензий, образованных фармацевтическими композициями (примеры 11-14), содержащими конъюгированные с жирной кислотой производные GnRH (примеры 3-6) согласно варианту осуществления настоящего изобретения и циклодекстрин.
На фиг. 3 представлен график, на котором показана доля (%) жизнеспособных клеток у линии клеток рака предстательной железы DU-145 после обработки композициями из примеров и сравнительных примеров в сравнении с отрицательным контролем, обработанным 1% метил-β-циклодекстрином.
На фиг. 4 представлен график, на котором показана доля (%) жизнеспособных клеток у линии клеток рака предстательной железы PC3 после обработки композициями из примеров и сравнительных примеров в сравнении с отрицательным контролем, обработанным 1% метил-β-циклодекстрином.
На фиг. 5 представлен график, на котором показана доля (%) жизнеспособных клеток у линии клеток рака предстательной железы LNCaP после обработки композициями из примеров и сравнительных примеров в сравнении с отрицательным контролем, обработанным 1% метил-β-циклодекстрином.
На фиг. 6 показаны отсканированные фотографии препаратов яичника после окрашивания у контроля, не подвергавшегося обработке, и контроля, которому вводили β-циклодекстрин.
На фиг. 7 показаны отсканированные фотографии препаратов яичника после окрашивания у групп, которым вводили фармацевтические композиции (примеры 9 и 10), содержащие конъюгированные с жирной кислотой производные GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения (примеры 1 и 2).
На фиг. 8 показаны отсканированные фотографии препаратов яичника после окрашивания у групп, которым вводили фармацевтические композиции (примеры 13 и 14), содержащие конъюгированные с жирной кислотой производные GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения (примеры 5 и 6).
На фиг. 9 показаны отсканированные фотографии препаратов яичника после окрашивания у групп, которым вводили фармацевтические композиции (примеры 15 и 16), содержащие конъюгированные с жирной кислотой производные GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения (примеры 7 и 8).
На фиг. 10 представлен график, показывающий увеличение периода полужизни in vivo у конъюгированных с жирной кислотой производных GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения, где на график нанесена концентрация в крови в зависимости от времени после того, как каждое из контрольных лекарственных средств (сравнительные примеры 1 и 4) и конъюгированных с жирной кислотой производных GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения вводили животным (крысам) подкожно один раз в дозе 12,5 мг/кг.
На фиг. 11 представлен график, показывающий увеличение периода полужизни in vivo у конъюгированных с жирной кислотой производных GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения, где на график нанесена концентрация в крови в зависимости от времени после того, как каждое из контрольного лекарственного средства, представляющего собой состав на основе лейпролида ацетата для введения в один день (сравнительный пример 1), и конъюгированных с жирной кислотой производных GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения (примеры 4 и 6) вводили животным (крысам) подкожно один раз в дозе 12,5 мг/кг.
На фиг. 12 представлен график, показывающий увеличение периода полужизни in vivo у конъюгированных с жирной кислотой производных GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения, где на график нанесена концентрация в крови в зависимости от времени после того, как каждое из контрольного лекарственного средства, представляющего собой состав на основе лейпролида в виде депо-препарата для введения в один день (сравнительный пример 4) и конъюгированных с жирной кислотой производных GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения (примеры 4 и 6) вводили животным (крысам) подкожно один раз в дозе 12,5 мг/кг.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Далее в данном документе будут описаны варианты осуществления настоящего изобретения со ссылкой на примеры получения и примеры, которые изложены, чтобы проиллюстрировать настоящее изобретение, но не предназначены для ограничения настоящего изобретения.
ПРИМЕР ПОЛУЧЕНИЯ 1. Получение производных гонадотропин-рилизинг-гормона (GnRH)
Природный GnRH млекопитающих имеет следующую последовательность:
[Последовательность GnRH млекопитающих]
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly (SEQ ID NO: 1).
Leuprolide®, имеющий последовательность GnRH млекопитающих, содержащий замену D-Leu вместо Gly в положении 6 и замену des-Gly вместо Gly в положении 10, применяли в качестве остова для производного и конъюгированного с жирной кислотой производного GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения.
[Последовательность лейпролида]
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt (SEQ ID NO: 2).
Производные, в которых глутамат в положении 1 в последовательности лейпролида не содержит замены или заменен на глутамин, получали следующим образом.
В качестве справки, последовательность трипторелина является следующей:
[Последовательность трипторелина]
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (SEQ ID NO: 3).
(1) Способ получения пептидов, представляющих собой производные GnRH
Производные синтезировали с применением общего способа твердофазного пептидного синтеза (SPPS) с помощью Fmoc/tBu, где α-аминогруппы аминокислотных остатков защищены с помощью основно-лабильной группы Fmoc (флуоренилметилоксикарбонилхлорид), в то время как боковые группы защищены с помощью кислотно-лабильной группы. В способе твердофазного пептидного синтеза пептидная цепь последовательно удлиняется за счет повторяющегося отщепления Fmoc и сочетания аминокислот, что предусматривает следующие стадии, на которых:
загружают аминокислоту с Fmoc на смолу (Fmoc-Pro-тритильная смола);
удаляют защитную группу Fmoc из Fmoc-AA-смолы (20% пиперидин/DMF);
промывают с помощью DMF;
связывают аминокислоту после активации (применяют DIC/HOBt);
промывают с помощью DMF;
повторяют стадии с по для последовательного связывания аминокислот;
удаляют только смолу из синтезированного пептида (1,5% TFA/DCM);
присоединяют этиламин к амино-концу полученного пептида (с применением EDC HCl/HOAt) и
производят отщепление всех защитных групп с боковых цепей полученного пептида (92,5% TFA/2,5% TIS/2,5% EDT/2,5% H2O).
Согласно вышеприведенному способу получения получали производные, имеющие последовательности, описанные в таблице 2. Лауриновую кислоту, пальмитиновую кислоту или арахидиновую кислоту конъюгировали с амино-концом полученного производного GnRH в соответствии с инструкцией в таблице 2. Конъюгирование жирной кислоты с амино-концом производного выполняли таким же способом, что и конъюгацию общих аминокислот. Синтез производных GnRH для сравнительных примеров и примеров поручили компании Anygen Co. Ltd.
(2) Очистка пептидов, представляющих собой производные GnRH
После расщепления с помощью TFA пептид очищали с применением колонки C18 в системе Shimadzu HPLC 10AVP в условиях HPLC (буфер A 0,05% TFA/H2O, буфер B 0,05% TFA/ацетонитрил, расход 1 мл/мин, длина волны 230 нм) Очистку каждого примера поручали компании Anygen Co. Ltd. и полученные от них результаты приведены в таблице 1. В таблице 1 у производных GnRH из примера 1 (L1), примера 3 (P1), примера 5 (P3) и примера 7 (A1) в качестве аминокислотного остатка в положении 1 содержится глутамат, в то время как у производных GnRH из примера 2 (L2), примера 4 (P2), примера 6 (P4) и примера 8 (A2) в качестве аминокислотного остатка в положении 1 содержится глутамин (см. таблицу 2).
ТАБЛИЦА 1
Лауриновая кислота, пальмитиновая кислота и арахидиновая кислота слаборастворимы в воде и при комнатной температуре находятся в виде твердых фаз с соответствующими точками плавления, составляющими приблизительно 43,8°C, приблизительно 60°C и приблизительно 75,5°C. Следовательно, поскольку конъюгированные с жирной кислотой производные GnRH могут характеризоваться плохой растворимостью в воде, дополнительно проводили образование соли. Конъюгированные с жирной кислотой производные GnRH подвергали образованию соли с получением натриевой соли или ацетатной соли конъюгированного с жирной кислотой производного GnRH из сравнительных примеров 1-3 и примеров 1-8, как показано в таблице 2 ниже. Выполнение этих процессов поручали компании Anygen Co. Ltd.
ТАБЛИЦА 2
ПРИМЕР ПОЛУЧЕНИЯ 2. Получение фармацевтической композиции, содержащей комплекс включения из производного GnRH и циклодекстрина
Порошок метил-β-циклодекстрина (Sigma-Aldrich; № партии: C4555; Mw: 1303,311 г/моль) растворяли в 1 мл стерилизованной трижды дистиллированной воды в количестве, приведенном в таблице 3.
Производные GnRH добавляли в количестве, приведенном в таблице 3, в соответствующие конические пробирки объемом 15 мл, в которые затем добавляли 1 мл водного раствора β-циклодекстрина в соответствии с молярными соотношениями из таблицы 3, а потом перемешивали в течение ночи при комнатной температуре с помощью низкоскоростного ротора. Затем растворы, содержащиеся в пробирках объемом 15 мл, собирали посредством кратковременного центрифугирования и затем переносили в пробирки объемом 1,5 мл с последующим повторным перемешиванием на протяжении ночи при комнатной температуре с помощью низкоскоростного ротора. Наконец, получали фармацевтические композиции, каждая из которых содержала активный ингредиент в концентрации, составляющей приблизительно 10 мM. Композиции применяли в следующих экспериментальных примерах, необязательно после разбавления. Для сравнительных примеров 1-3 композиции разбавляли до 20 мM с помощью трижды дистиллированной воды.
ТАБЛИЦА 3
Следующие экспериментальные примеры проводили с использованием фармацевтических композиций.
[ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ПРИМЕР 1]. Оценка комплекса включения из конъюгированного с жирной кислотой производного GnRH и циклодекстрина
Для применения в качестве контроля раствор, содержащий 13 мг порошка метил-β-циклодекстрина в 1 мл стерильной трижды дистиллированной воды, получали таким же образом, как в примере получения 2, в пробирке объемом 1,5 мл (концентрация 10 мM).
Полученный контроль и композиции из примеров 9-16, окончательно полученные посредством перемешивания в пробирках объемом 1,5 мл, осматривали невооруженным глазом. Их центрифугировали при 10000 об/мин в течение от 40 секунд до 50 секунд (менее 1 минуты) и снова осматривали невооруженным глазом для оценки растворимости. Результаты для примеров 9, 10, 15 и 16 представлены на фиг. 1 и результаты для примеров 11-14 представлены на фиг. 2. Как можно видеть на фиг. 1, наблюдали, что перед проведением центрифугирования композиции из примеров 9 и 10, содержащие конъюгированные с лауриновой кислотой производные GnRH (примеры 1 и 2), и композиции из примеров 15 и 16, содержащие конъюгированные с арахидиновой кислотой производные GnRH (примеры 7 и 8), находились в виде суспензий, в которых активные ингредиенты (комплексы включения из производных GnRH и циклодекстринов), были хорошо диспергированы в растворителе, представляющем собой стерильную дистиллированной водой. Такое же состояние наблюдали у данных композиций после центрифугирования.
Как показано на фиг. 2, также наблюдали, что композиции из примеров 11-14, содержащие конъюгированные с пальмитиновой кислотой производные GnRH (примеры 3-6), находились в виде суспензий, в которых активные ингредиенты (комплексы включения из производных GnRH и циклодекстринов), были хорошо диспергированы в растворителе, представляющем собой стерильную дистиллированную воду, до и после проведения центрифугирования.
Из результатов вытекает, что фармацевтические композиции, содержащие производные GnRH и циклодекстрин согласно варианту осуществления настоящего изобретения, представлены в виде суспензий, в которых ингредиенты хорошо суспендированы, таким образом, обеспечиваются эффекты и цели, свойственные средствам с пролонгированным действием или замедленным высвобождением.
[ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ПРИМЕР 2]. Анализ доли жизнеспособных клеток у линий клеток рака предстательной железы
Производные GnRH применяют в клинических условиях для терапии заболеваний, в том числе рака молочной железы, рака предстательной железы, эндометриоза, преждевременного полового созревания центрального генеза и т. п. Следовательно, каждую из различных линий клеток рака предстательной железы (линии клеток DU-145, PC3 и LNCaP) культивировали в среде RPMI 1640 (содержащей 10% FBS, пенициллин/стрептомицин, 1% заменимых аминокислот) во флаконе T75 и культивировали при 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO2/95% воздуха, в стерильном инкубаторе. Анализ для определения доли жизнеспособных клеток проводили с применением набора для подсчета клеток Cell Counting Kit-8 (CCK-8, производства DOJINDO). Каждую из линий клеток отделяли от флакона T75 за посредством обработки трипсином и переносили в 96-луночные планшеты при плотности 1×104 клеток/мл в случае DU-145 и при плотности 1×105 клеток/мл в случае PC3 и LNCaP с последующей инкубацией в течение одного часа для прикрепления.
Затем каждую линию клеток обрабатывали с помощью 100 мкM и 200 мкM каждого из средств, представляющих собой производные из сравнительных примеров 1-3 и примеров 9-16 и контроль. Вкратце, для оценки доли жизнеспособных клеток в качестве средства для отрицательного контроля применяли 1% метил-β-циклодекстрин, при этом 0,1% додецилсульфат натрия (SDS) служил в качестве средства для положительного контроля. После 48 часов инкубации использованную среду для культивирования удаляли и к каждой линии клеток добавляли по 100 мкл свежей среды для культивирования и 10 мкл раствора CCK-8. Опять же, после 48 часов инкубации раствор среды заменяли на 100 мкл свежей среды для культивирования и 10 мкл раствора CCK-8. Клетки инкубировали в течение 4 часов, а затем измеряли поглощение при 450 нм для оценки доли жизнеспособных клеток. Результаты измерений представлены в таблицах 4-6 и на фиг. 3-5.
ТАБЛИЦА 4
ТАБЛИЦА 5
ТАБЛИЦА 6
Обращаясь к таблицам 4-6 и фиг. 3-5, фармацевтические композиции (примеры 9-16), содержащие конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения (примеры 1-8), демонстрировали неожиданно превосходные эффекты по сравнению с природным GnRH (сравнительный пример 1) и коммерчески доступными производными GnRH (сравнительные примеры 2 и 3).
Подробно, показатели выживания у линии клеток предстательной железы DU-145 были по сути одинаковыми в случае применения композиций из сравнительных примеров 1-3 и отрицательного контроля. Только композиция из сравнительного примера 3 привела к доле жизнеспособных клеток, составляющей приблизительно 94%. В отличие от этого, композиции согласно варианту осуществления настоящего изобретения снижали долю жизнеспособных клеток до по меньшей мере приблизительно 80% и максимум до приблизительно 25% по сравнению с отрицательным контролем. Заметное снижение доли жизнеспособных клеток при применении композиций согласно варианту осуществления настоящего изобретения было статистически значимым.
Что касается клеток рака предстательной железы PC3, композиции из сравнительных примеров 1-3 показали небольшой эффект в отношении снижения доли жизнеспособных клеток. Только трипторелин из сравнительного примера 3 привел к доле жизнеспособных клеток, составляющей приблизительно 95%. В отличие от этого, композиции согласно варианту осуществления настоящего изобретения показывали очень значимое снижение доли жизнеспособных клеток. Помимо прочего, для композиции из примера 12 продемонстрировано очень сильное снижение доли жизнеспособных клеток по сравнению с таковыми для сравнительных примеров. В частности, композиция из примера 12 снижала долю жизнеспособных клеток в степени, аналогичной той, которую обеспечивал положительный контроль.
При применении в концентрации 200 мкM в отношении клеток LNCaP композиции из сравнительных примеров 1, 2 и 3 приводили к доле жизнеспособных клеток, составляющей приблизительно 93%, приблизительно 85% и приблизительно 90% соответственно. При этом композиции согласно варианту осуществления настоящего изобретения демонстрировали очень высокие эффекты в отношении гибели клеток по сравнению с композициями из сравнительных примеров. В частности, аналогичный эффект в отношении гибели клеток обнаружили у композиции из примера 10 и положительного контроля и более высокий у композиции из примера 16 по сравнению с положительным контролем.
Согласно данным экспериментов на трех разных линиях клеток рака предстательной железы у композиций из примеров 10, 12, 14 и 16, содержащих производные из примеров 2, 4, 6 и 8, у которых была замена аминокислоты в положении 1, замена глутаминовой кислоты на глутамин, эффекты в отношении гибели клеток превосходили таковые композиций из примеров 9, 11, 13 и 15, содержащих производные из примеров 1, 3, 5 и 7, у которых аминокислота в положении 1 оставалась интактной. Эти данные указывают на то, что производные GnRH, характеризующиеся заменой аминокислоты в положении 1, конъюгацией с жирной кислотой и преобразованием в соль согласно варианту осуществления настоящего изобретения, проявляют неожиданно превосходные эффекты в отношении гибели клеток рака предстательной железы.
[ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ПРИМЕР 3]. Анализ морфологического изменения яичника
Эксперименты проводили для проверки того, сохраняют ли конъюгированные с жирной кислотой производные GnRH свои функциональные характеристики и вызывают ли морфологическое изменение яичника.
Каждую из фармацевтических композиции из примеров 9, 10, 13, 14, 15 и 16 вводили самкам крыс возрастом 9 недель посредством подкожной инъекции один раз в заднюю область шеи при однократной дозе, составляющей 12,5 мг/кг. Крыс, которым не вводили лекарственные средства, использовали в качестве контроля, не подвергавшегося обработке, в то время как отрицательному контролю вводили водный раствор, содержащий 3 мг метил-β-циклодекстрина. Каждая группа состояла из 3 крыс.
В день 28 после инъекции крыс подвергали аутопсии с удалением яичников, которые затем окрашивали гематоксилином и эозином (окраска H&E). Окрашенные препараты яичника исследовали для обнаружения гистологического изменения и патологических отклонений.
Вкратце, яичники окрашивали с помощью H&E и исследовали следующим образом.
1. Непосредственно после аутопсии иссеченную ткань (яичник) фиксировали в течение 12 часов в фиксирующем растворе.
2. Зафиксированную в достаточной степени ткань промывали водой с удалением фиксирующего реагента.
3. Для применения парафиновой заливки ткань яичника обезвоживали с помощью батареи спиртов. Обезвоживание проводили с использованием серии спиртов с возрастающей концентрацией, начиная с низкой концентрации до более высоких концентраций и, наконец, 100% чистого спирта и бензола.
4. Обезвоженную ткань яичника оставляли для пропитывания в растворе парафина в бензоле, а затем ее обрабатывали чистым парафином в жидком состоянии, находящемся при высокой температуре (60°C), для полной пропитки ткани парафином.
5. Залитую в парафин ткань нарезали на блоки подходящих размеров и затем с помощью микротома получали срезы толщиной 4 мкм.
6. Срезы ткани монтировали на предметное стекло и с помощью органического растворителя, такого как ксилол, удаляли парафин.
7. Предметное стекло с прикрепленной к нему тканью подвергали гидратации посредством обработки с помощью серии спиртов от высокой до низкой концентраций.
8. Вначале применяли водный раствор гематоксилина для окрашивания ядра и других кислых структур (богатых РНК и т.д.) в синий цвет.
9. После этого окрашивали различные вещества и органеллы в цитоплазме и внеклеточный матрикс в красный цвет с помощью эозина.
10. После завершения окрашивания образец обезвоживали с помощью батареи спиртов, и затем покрывали покровным стеклом с использованием клеящего вещества, такого как смола (бальзам или синтетическая смола). Этот процесс называется «заключение в среду».
11. После завершения вышеописанных процедур микропрепараты с образцами сканировали с помощью сканера микропрепаратов ScanScope® AT (Aperio) и фотографии, сохраненные таким образом, анализировали с помощью программы ImageScope (Aperio). Отсканированные фотографии представлены на фиг. 6-9.
Результаты
У самок крыс эстральный цикл, состоящий из диэструса, проэструса, эструса и метаэструса, длится приблизительно 4-5 дней и сопровождается морфологическими изменениями в яичнике в зависимости от стадий эстрального цикла.
Известно, что при введении крысам агонист GnRH снижает образование вторичных фолликулов и граафовых пузырьков (см.: Mohammadbeigi et al., Short-term Administration of Gonadotropin-releasing Hormone Agonist (Buserelin) Induces Apoptosis in Rat Ovarian Developmental Follicles, July 2016). В данном эксперименте вторичные фолликулы и граафовы пузырьки на фотографиях яичника у каждой группы обработки обозначены с помощью стрелок для определения того, уменьшается ли число фолликулов.
Как показано на фиг. 6, в группе, не подвергавшейся обработке, и в группе, которой вводили инъекцию метил-β-циклодекстрина, присутствовало большое количество вторичных фолликулов или граафовых пузырьков, как указано с помощью стрелок. В отличие от этого, как показано на фиг. 7-9, в группах крыс, которым вводили конъюгированные с жирной кислотой производные GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения (примеры 1, 2, 5, 6, 7 и 8), количество вторичных фолликулов или граафовых пузырьков снижалось. В группе, которой вводили производные из примеров, часто наблюдали желтое тело и образовались немногочисленные примордиальные фолликулы или многослойные первичные фолликулы.
На основании этих данных стало понятно, что конъюгированные с жирной кислотой производные GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения обладают благоприятным эффектом, в частности, эффектом сдерживания полового созревания у крыс.
Кроме того, наблюдаемое уменьшение количества вторичных фолликулов или граафовых пузырьков даже через 28 дней после введения однократной дозы указывает на то, что конъюгированные с жирной кислотой производные GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения или комплексы включения из производных и циклодекстрина демонстрируют замедленное высвобождение и, в связи с этим, могут применяться в качестве составов пролонгированного действия.
[ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ПРИМЕР 4]. Измерение скорости увеличения периода полужизни in vivo
Автор настоящего изобретения проводил эксперименты на животных (самки крыс SD возрастом девять недель), чтобы исследовать увеличение периодов полужизни in vivo у полученных конъюгированных с жирной кислотой производных GnRH. Вкратце, состав на основе лейпролида для введения в один день (n=6), состав на основе лейпролида ацетата в виде депо-препарата для введения в течение одного месяца (3,75 мг/месяц; n=7) и производное из примера 4 (n=6) или производное из примера 6 (n=6) вводили подкожно крысам каждой группы один раз в дозе 12,5 мг/кг, а затем отслеживали концентрации в крови с течением времени. При необходимости в качестве растворителя использовали DMSO (диметилсульфоксид). Перед введением и через 0,5, 1, 2 и 6 часов и в дни 1, 3, 7, 10, 14, 21 и 28 после введения из хвостовой вены крыс проводили забор образцов крови и измеряли концентрации лейпролида и производных из примеров в крови с применением LC/MSMS. Если в конкретный момент времени концентрация достигала приблизительно 4 нг/мл, дальнейшие измерения в следующий момент времени не проводили.
Результаты экспериментов обобщены следующим образом. В следующей таблице единицей измерения является нг/мл.
ТАБЛИЦА 7
Результаты измерений графически представлены на фиг. 10-12. На основании результатов проводили фармакокинетический анализ путем расчета периода полужизни (t1/2), скорости клиренса (CL), объема распределения (Vd), времени достижения максимальной концентрации после введения лекарственного средства (Tmax), максимальной концентрации после введения лекарственного средства (Cmax) и системной экспозиции лекарственного средства (AUCt). Результаты анализа являются следующими.
ТАБЛИЦА 8
Как можно понять из этих данных, конъюгированные с жирной кислотой производные GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения значительно превосходят лейпролид (сравнительный пример 1) с точки зрения периода полужизни in vivo, скорости клиренса, объема распределения и системной экспозиции (AUCt). Кроме того, обнаружили, что конъюгированные с жирной кислотой производные GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения характеризуются значениями периода полужизни, скорости клиренса и системной экспозиции (AUCt), аналогичными значениям существующего состава на основе лейпролида для введения в течение одного месяца, содержащего физически смешанный биоразлагаемый полимер, и, в частности, они демонстрируют превосходный объем распределения, замедленное время достижения максимальной концентрации после введения лекарственного средства и сниженную максимальную концентрацию в течение длительного периода времени по сравнению с коммерчески доступным продуктом. Взятые вместе эти данные демонстрируют, что конъюгированные с жирной кислотой производные GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения позволяют GnRH поддерживать подходящую концентрацию в течение длительного периода времени in vivo.
С учетом превосходных свойств конъюгированных с жирной кислотой производные GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения их можно применять в значительно меньшем объеме по сравнению с существующими продуктами, в которых биоразлагаемые полимеры смешивают с производными GnRH для достижения замедленного высвобождения, и, таким образом, можно преодолевать недостаток в виде боли и исключать побочный эффект, заключающийся в том, что биоразлагаемый полимер остается in vivo в течение длительного периода времени. Эти свойства являются благоприятными, в частности, для детей. Кроме того, обладая превосходной равномерностью высвобождения, конъюгированные с жирной кислотой производные GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения могут демонстрировать превосходные эффекты в отношении уничтожения клеток рака предстательной железы, а также сдерживания полового созревания посредством уменьшения количества вторичных фолликулов или граафовых пузырьков в яичниках, как было определено в экспериментальных примерах 2 и 3.
В то же время, когда конъюгированные с жирной кислотой производные GnRH согласно варианту осуществления настоящего изобретения использовали в комбинации с биоразлагаемым полимером, используемым в традиционных продуктах, период полужизни значительно увеличивался по сравнению с традиционными лекарственными средствами, такими как лейпролид, и становился таким же длительным, как у лекарственных средств, применяемых при инвазивных способах введения (оперативном вмешательстве), например, как в случае имплантатов (от нескольких месяцев до одного года).
Хотя техническая идея настоящего изобретения была описана с помощью примеров, описанных в некоторых вариантах осуществления и проиллюстрированных в сопутствующих графических материалах, следует отметить, что без отступления от объема настоящего изобретения могут производиться различные замены, модификации и изменения, которые могут быть понятны специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Кроме того, следует отметить, что подразумевается, что такие замены, модификации и изменения находятся в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.
--->
<110> ДжейПи Био Джи Инк.
<120> КОНЪЮГИРОВАННЫЕ С ЖИРНОЙ КИСЛОТОЙ ПРОИЗВОДНЫЕ GnRH ПРОЛОНГИРОВАННОГО
ДЕЙСТВИЯ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ИХ
<130> FC19025WO
<160> 11
<170> KoPatentIn версия 3.0
<210> 1
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> homo sapiens
<220>
<221> САЙТ
<222> (1)
<223> Glu в положении 1 представляет собой pyroGlu.
<400> 1
Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly
1 5 10
<210> 2
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аналог GnRH - лейпролид
<220>
<221> САЙТ
<222> (1)
<223> Glu в положении 1 представляет собой pyroGlu.
<220>
<221> САЙТ
<222> (6)
<223> Leu в положении 6 представляет собой D-Leu.
<220>
<221> САЙТ
<222> (9)
<223> C-концевая область пептида была модифицирована в виде NHEt(des-Gly).
<400> 2
Glu His Trp Ser Tyr Leu Leu Arg Pro
1 5
<210> 3
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аналог GnRH - трипторелин
<220>
<221> САЙТ
<222> (1)
<223> Glu в положении 1 представляет собой pyroGlu.
<220>
<221> САЙТ
<222> (6)
<223> Trp в положении 6 представляет собой D-Trp
<400> 3
Glu His Trp Ser Tyr Trp Leu Arg Pro Gly
1 5 10
<210> 4
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аналог GnRH
<220>
<221> САЙТ
<222> (1)
<223> Glu в положении 1 был модифицирован с помощью лауриновой кислоты.
<220>
<221> САЙТ
<222> (6)
<223> Leu в положении 6 представляет собой D-Leu.
<220>
<221> САЙТ
<222> (9)
<223> C-конец пептида был модифицирован в виде NHEt(des-Gly).
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (1)..(9)
<223> Образована соль пептида в виде ацетатной соли.
<400> 4
Glu His Trp Ser Tyr Leu Leu Arg Pro
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аналог GnRH
<220>
<221> САЙТ
<222> (1)
<223> Gln в положении 1 был модифицирован с помощью лауриновой кислоты.
<220>
<221> САЙТ
<222> (6)
<223> Leu в положении 6 представляет собой D-Leu.
<220>
<221> САЙТ
<222> (9)
<223> C-конец пептида модифицирован в виде NHEt(des-Gly).
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (1)..(9)
<223> Образована соль пептида в виде ацетатной соли.
<400> 5
Gln His Trp Ser Tyr Leu Leu Arg Pro
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аналог GnRH
<220>
<221> САЙТ
<222> (1)
<223> Glu в положении 1 модифицирован с помощью пальмитиновой кислоты.
<220>
<221> САЙТ
<222> (6)
<223> Leu в положении 6 представляет собой D-Leu.
<220>
<221> САЙТ
<222> (9)
<223> C-конец пептида модифицирован в виде NHEt(des-Gly).
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (1)..(9)
<223> Образована соль пептида в виде натриевой соли.
<400> 6
Glu His Trp Ser Tyr Leu Leu Arg Pro
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аналог GnRH
<220>
<221> САЙТ
<222> (1)
<223> Gln в положении 1 модифицирован с помощью пальмитиновой кислоты.
<220>
<221> САЙТ
<222> (6)
<223> Leu в положении 6 представляет собой D-Leu.
<220>
<221> САЙТ
<222> (9)
<223> C-конец пептида модифицирован в виде NHEt(des-Gly).
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (1)..(9)
<223> Образована соль пептида в виде натриевой соли.
<400> 7
Gln His Trp Ser Tyr Leu Leu Arg Pro
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аналог GnRH
<220>
<221> САЙТ
<222> (1)
<223> Glu в положении 1 модифицирован с помощью пальмитиновой кислоты.
<220>
<221> САЙТ
<222> (6)
<223> Leu в положении 6 представляет собой D-Leu.
<220>
<221> САЙТ
<222> (9)
<223> C-конец пептида был модифицирован в виде NHEt(des-Gly).
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (1)..(9)
<223> Образована соль пептида в виде ацетатной соли.
<400> 8
Glu His Trp Ser Tyr Leu Leu Arg Pro
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аналог GnRH
<220>
<221> САЙТ
<222> (1)
<223> Gln в положении 1 модифицирован с помощью пальмитиновой кислоты.
<220>
<221> САЙТ
<222> (6)
<223> Leu в положении 6 представляет собой D-Leu.
<220>
<221> САЙТ
<222> (9)
<223> C-конец пептида модифицирован в виде NHEt(des-Gly).
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (1)..(9)
<223> Образована соль пептида в виде ацетатной соли.
<400> 9
Gln His Trp Ser Tyr Leu Leu Arg Pro
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аналог GnRH
<220>
<221> САЙТ
<222> (1)
<223> Glu в положении 1 был модифицирован с помощью арахидиновой кислоты.
<220>
<221> САЙТ
<222> (6)
<223> Leu в положении 6 представляет собой D-Leu.
<220>
<221> САЙТ
<222> (9)
<223> C-конец пептида модифицирован в виде NHEt(des-Gly).
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (1)..(9)
<223> Образована соль пептида в виде ацетатной соли.
<400> 10
Glu His Trp Ser Tyr Leu Leu Arg Pro
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аналог GnRH
<220>
<221> САЙТ
<222> (1)
<223> Gln в положении 1 был модифицирован с помощью арахидиновой кислоты.
<220>
<221> САЙТ
<222> (6)
<223> Leu в положении 6 представляет собой D-Leu.
<220>
<221> САЙТ
<222> (9)
<223> C-конец пептида модифицирован в виде NHEt(des-Gly).
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (1)..(9)
<223> Образована соль пептида в виде ацетатной соли.
<400> 11
Gln His Trp Ser Tyr Leu Leu Arg Pro
1 5
<---
1. Конъюгированное с жирной кислотой производное гонадотропин-рилизинг-гормона (GnRH) пролонгированного действия или его фармацевтически приемлемая соль для введения субъекту,
где жирная кислота представляет собой лауриновую кислоту или арахидиновую кислоту,
где производное GnRH содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11,
где фармацевтически приемлемая соль представляет собой ацетат или натриевую соль, и
где карбоксильная группа жирной кислоты производного GnRH конъюгирована посредством пептидной связи с амино-концом пептидного участка производного GnRH.
2. Конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH пролонгированного действия или его соль по п. 1, где конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH пролонгированного действия содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5.
3. Конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH пролонгированного действия или его соль по п. 1, где конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH пролонгированного действия содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11.
4. Фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения заболевания, зависимого от половых гормонов, содержащая конъюгированное с жирной кислотой производное GnRH пролонгированного действия или его соль по любому из пп. 1-3 в качестве активного ингредиента в эффективном количестве.
5. Фармацевтическая композиция по п. 4, где заболевание, зависимое от половых гормонов, выбрано из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака молочной железы, рака яичника, эндометриоза, фибромиомы матки, поликистоза яичников, преждевременного полового созревания центрального генеза, гипертрихоза, гонадотропной аденомы гипофиза, апноэ во время сна, синдрома раздраженного кишечника, предменструального синдрома, доброкачественной гиперплазии предстательной железы и бесплодия.
6. Фармацевтическая композиция по п. 4, дополнительно содержащая биоразлагаемый полимер.
