Способ определения активности лизоцима в ротовой жидкости

Авторы патента:

G01N33/52 - использование соединений или составов для колориметрического, спектрофотометрического или флуорометрического анализа, например реактивной бумаги

C12Q1/02 - использующие жизнеспособные микроорганизмы

C12N9/36 - действующие на бета-1,4-связи между N-ацетилмурамовой кислотой и 2-ацетиламино-2-дезокси-D-глюкозой, например лизоцим

Владельцы патента RU 2786802:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к медицине, в частности к стоматологии и биотехнологии и может быть использовано для оценки уровня иммунной защиты от патогенной микрофлоры в ротовой жидкости и касается способа определения активности лизоцима в ротовой жидкости. Готовят культуру Micrococcus lysodeicticus ГИСК им. Л.А. Тарасевича в концентрации 10 млрд кл/мл, далее в пробирку с ротовой жидкостью объёмом 1 мл вносят 3 мл 1% физиологического раствора и 1 мл взвеси Micrococcus lysodeicticus в концентрации 10 млрд кл/мл. Полученный раствор тщательно перемешивают и проводят измерение оптической плотности на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора (D0). После этого данный раствор помещают в термостат на 2,5 часа при температуре 37 градусов, после чего повторно измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора (D1) и вычисляют активность лизоцима ротовой жидкости по формуле. Изобретение обеспечивает разработку модифицированной методики определения активности лизоцима в малом объеме ротовой жидкости, оценивая уровень местного иммунитета рта у пациентов с отягощенным соматическим статусом, внедрение в практическое здравоохранение. 2 пр.

Изобретение относится к медицине, в частности к стоматологии и биотехнологии и может быть использовано для оценки уровня иммунной защиты от патогенной микрофлоры в ротовой жидкости, изучении ротовой жидкости при патологических процессах в полости рта, для определения эффективности индивидуальных средств гигиены рта.

Известен «Способ определения лизоцимной активности биологических объектов» (Патент RU №2294373, МПК C12Q 1/02, G01N 33/48 - 27.02.2007, Бюл. № 6), предусматривает выращивание тест-культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Тарасевича на жидкой питательной среде при температуре 27°С до оптической плотности 3,2-3,4. Подвергают лиофильной сушке. Из выращенной тест-культуры готовят суспензию, которую вносят в исследуемый биологический объект. После чего проводят вычисление лизоцимной активности биологического объекта по известному методу.

Недостаток данного способа: не определен уровень для соматически здоровых и с высоким уровнем активности кариеса пациентов; отсутствие количественного определения лизоцима в ротовой жидкости.

Известен «Способ определения активности лизоцима в биологической среде» (Патент BY №22808, МПК C12N 9/36, C12Q 1/06, G01N 33/48 - 2019.12.30), мясопептонном агаре выращивают культуру Micrococcus lysodeikticus, выделяют из нее пептидогликан, инкубируют его с 2%-ным раствором Конго красного и центрифугируют с получением пептидогликана, меченого Конго красным, затем готовят контрольную пробу, содержащую фосфатный буферный раствор, физиологический раствор и биологическую среду, и опытную пробу, содержащую фосфатный буферный раствор, пептидогликан, меченый Конго красным, и биологическую среду, пробы инкубируют и центрифугируют, в полученных надосадках определяют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 492 нм и вычисляют активность лизоцима Х в мкг/мл по формуле.

Недостатком данного технического решения является отсутствие количественного определения лизоцима в ротовой жидкости, необходимость выделение пептидогликана, необходимость дополнительных реактивов.

Наиболее близким к заявленному техническому решению является «Способ определения активности лизоцима слюны» (Патент RU № 2170932 С1, МПК G01N 33/52 - 20.07.2001, Бюл. № 20), в котором определяют начальную оптическую плотность в растворе смеси слюны, разведенной в 15 раз, с микрококком, после чего смесь термостатируют в течение 10 мин и вновь измеряют оптическую плотность, а затем определяют активность лизоцима (АЛ) по формуле АЛ = (Д0 - ДК) ⋅ 200, где Д0 - начальная оптическая плотность смеси; ДК - конечная оптическая плотность смеси; 200 - коэффициент пересчета.

Данный патент принят за прототип.

Недостаток данного способа отсутствует количественное определение лизоцима в ротовой жидкости.

Задачей заявляемого изобретения является модифицирование методик определения активности лизоцима в ротовой жидкости, при которой будет возможно количественное определение лизоцима, оптимизация расчёта данных.

Полезность заявленного способа заключается в том, что благодаря полученным результатам предоставляется возможность определения количественного состава лизоцима в ротовой жидкости, что в свою очередь позволить определять состояние иммунного статуса ротовой жидкости при наличии заболеваний на ранних этапах.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка модифицированной методики определения активности лизоцима в малом объеме ротовой жидкости, оценивается уровень местного иммунитета рта у пациентов с отягощенным соматическим статусом, внедрение в практическое здравоохранение.

Технический результат заявленного изобретения достигается за счет того, что измеряют оптическую плотность, особенность заключается в том, что сначала готовят культуру Micrococcus lysodeicticus ГИСК им. Л.А. Тарасевича в концентрации 10 млрд кл/мл, далее в пробирку с ротовой жидкостью объёмом 1 мл вносят 3 мл 1% физиологического раствора и 1 мл взвеси Micrococcus lysodeicticus в концентрации 10 млрд кл/мл, полученный раствор тщательно перемешивают и проводят измерение оптической плотности на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора (D0), после чего данный раствор помещают в термостат на 2,5 часа при температуре 37 градусов, после чего повторно измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора (D1) и вычисляют активность лизоцима ротовой жидкости по формуле:

L = (D0-D1) / D0*100%,

где L - активность лизоцима;

D0 - оптическая плотность до инкубации;

D1 - оптическая плотность после инкубации.

Способ осуществляется следующим образом:

Готовят раствор с внесением в пробирку 3 мл 1% физиологического раствора и 1 мл ротовой жидкости, добавляют 1 мл взвеси Micrococcus lysodeicticus штамм №25292 ГИСК им. Л.А. Тарасевича в концентрации 10 млрд кл/мл, приготовленную по оптическому стандарту мутности. Полученный раствор тщательно перемешивают и сразу производят измерение оптической плотности на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора, после чего помещают в термостат на 2,5 часа при температуре 37 градусов, далее оптическую плотность замеряют на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора и вычисляют активность лизоцима ротовой жидкости по формуле:

L = (D0 - D1) / D0*100%,

где L - активность лизоцима;

D0 - оптическая плотность до инкубации;

D1 - оптическая плотность после инкубации.

Способ поясняется конкретными клиническими примерами.

Пример 1.

Ротовая жидкость взята у пациента без соматической патологии, но с высокой активностью кариеса.

На первом этапе осуществляется приготовление культуры Micrococcus lysodeicticus ГИСК им. Л.А. Тарасевича в концентрации 10 млрд кл/мл. Далее в каждую пробирку с пробами ротовой жидкости объёмом 1 мл вносят 3 мл 1% физиологического раствора и 1 мл взвеси Micrococcus lysodeicticus. Тщательно перемешивают. Сразу же проводят измерение оптической плотности на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора. По данным измерения D0 равен 0,196. После чего помещают пробирки в термостат для инкубации на 2,5 часа при температуре 37°С. Через указанное время проводят повторное измерение оптическое плотности при аналогичных условиях. По данным измерения D1 равен 0,102.

Расчёт производится по формуле:

L = (D0-D1) / D0*100%,

где L - активность лизоцима;

D0 - оптическая плотность до инкубации;

D1 - оптическая плотность после инкубации.

L = (0,196-0,102) / 0,196 * 100% = 47,9%.

Пример 2.

Ротовая жидкость взята у пациента с психоневрологическими расстройствами и высоким уровнем активности кариеса.

На первом этапе осуществляется приготовление культуры Micrococcus lysodeicticus ГИСК им. Л.А. Тарасевича в концентрации 10 млрд кл/мл. Далее в каждую пробирку с пробами ротовой жидкости объёмом 1 мл вносят 3 мл 1% физиологического раствора и 1 мл взвеси Micrococcus lysodeicticus. Тщательно перемешивают. Сразу же проводят измерение оптической плотности на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора. По данным измерения D0 равен 0,364. После чего помещают пробирки в термостат для инкубации на 2,5 часа при температуре 37°С. Через указанное время проводят повторное измерение оптическое плотности при аналогичных условиях. По данным измерения D1 равен 0,096.

Расчёт производится по формуле:

L = (D0-D1) / D0*100% = (0,364-0,096) / 0,364 * 100% = 73,6%.

Таким образом, чем выше показатель, тем хуже иммунологический статус во рту.

По приведенным примерам видно, что в первом случае активность лизоцима ниже, чем во втором. Это свидетельствует о наличии патогенной микрофлоры и напряженном иммунном статусе примера 2.

Предлагаемый способ позволяет определять количественный состав лизоцима в ротовой жидкости, что, в свою очередь, позволить определять состояние иммунного статуса ротовой жидкости при наличии заболеваний на ранних этапах.

Способ определения активности лизоцима в ротовой жидкости, включающий измерение оптической плотности, отличающийся тем, что сначала готовят культуру Micrococcus lysodeicticus ГИСК им. Л.А. Тарасевича в концентрации 10 млрд кл/мл, далее в пробирку с ротовой жидкостью объёмом 1 мл вносят 3 мл 1% физиологического раствора и 1 мл взвеси Micrococcus lysodeicticus в концентрации 10 млрд кл/мл, полученный раствор тщательно перемешивают и проводят измерение оптической плотности на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора (D0), после чего данный раствор помещают в термостат на 2,5 часа при температуре 37 градусов, после чего повторно измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора (D1) и вычисляют активность лизоцима ротовой жидкости по формуле:

L = (D0-D1) / D0*100%,

где L – активность лизоцима;

D0 – оптическая плотность до инкубации;

D1 – оптическая плотность после инкубации.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным способам исследования гемостаза, и касается определения показателей коагуляции плазмы крови – активности тромбина, времени рекальцификации плазмы и толерантности плазмы к гепарину. Используют флуоресцентный метод в видимом диапазоне излучения 420-600 нм в присутствии соединений бордипиринового ряда (BODIPY), таких как 4,4-дифторо-8-фенил-1,3,5,7-тетраметил-2,6-диэтил-4-бор-3а,4а-диаза-s-индацен; 4,4-дифторо-8-(пара-диметиламинофенил)-1,3,5,7-тетраметил-2,6-диэтил-4-бор-3а,4а-диаза-8-индацен; 4,4-дифторо-8-(ди-ортометилфенил)-1,3,5,7-тетраметил-2,6-диэтил-4-бор-3а,4а-диаза-s-индацен, флуоресценция которых зависит от присутствия биомолекул фибриногена.

Способ прогнозирования синдрома задержки развития плода у беременных женщин с ожирением // 2785904

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования синдрома задержки развития плода у беременных женщин с ожирением. В крови беременной женщины определяют содержание общей меди (Cuоб.) и церулоплазмина (ЦП).

Способ обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза // 2783710

Изобретение относится к лабораторной диагностике и иммунологии, и может быть использовано для обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза. Способ включает: нанесение исследуемого материала на подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм, на которую точечно наносят исследуемый материал в объеме 1-2 мкл, после полного впитывания исследуемого материала подложку промывают дважды физиологическим раствором, затем помещают в 2% раствор бычьего сывороточного альбумина на физиологическом растворе на 15 мин, затем подложку двукратно промывают физиологическим раствором, однократно дистиллированной водой и помещают в раствор иммуноглобулина G, выделенного из агглютинирующей псевдотуберкулезной сыворотки, меченного частицами коллоидного серебра размером 5-9 нм, с экспозицией на 40 мин.

Способ дооперационной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных узловых образований щитовидной железы // 2783304

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургической эндокринологии, и может быть использовано для дооперационной дифференциальной диагностики доброкачественной или злокачественной природы узловых образований щитовидной железы. Выполняют тонкоигольную аспирационную биопсию узловых образований щитовидной железы под контролем УЗИ.

Способ превентивной оценки риска снижения уровня здоровья юношей подросткового возраста // 2782491

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для превентивной оценки риска снижения уровня здоровья юношей подросткового возраста. Проводят исследование капиллярной крови и количественное определение с помощью спектрофотометра степени гемолиза эритроцитов.

Способ диагностики лимфомы ходжкина // 2782326

Изобретение относится к биотехнологии и диагностической медицине и может быть использовано для диагностики лимфомы Ходжкина (ЛХ). Выделяют тотальную популяцию внеклеточных нановезикул (ВНВ) из плазмы крови с помощью двухфазной полимерной системы.

Способ количественного определения 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1н-индол-3-ил)ацетата и индометацина в плазме крови // 2781342

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии и токсикологии, и может быть использовано для количественного определения 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-ил)ацетата и индометацина в плазме крови. Осуществляют экстракцию определяемого вещества ацетонитрилом, с последующим определением его методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке ProntoStL 75×2,0 мм, 5 мкм.

Способ оценки риска неблагоприятного исхода у детей с периферическими парезами // 2779561

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, и может быть использовано для оценки риска неблагоприятного исхода у детей с периферическими парезами. Осуществляют определение уровня матриксной металлопротеиназы I (нг/мл) в сыворотке крови и проведение электромиографического исследования мышц на стороне поражения.

Способ диагностики риска обострения хронического воспалительного бронхолегочного процесса у детей с врожденными пороками развития легких // 2778269

Изобретение относится к медицине, а именно педиатрии, пульмонологии, и может быть использовано для диагностики риска обострения хронического воспалительного бронхолегочного процесса у детей с врожденными пороками развития легких (ВПРЛ). Выполняют цитохимическое исследование активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) с учетом процента лимфоцитов с неизмененным мембранным потенциалом митохондрий (МПМ) в периферической крови.

Способ определения жизнеспособности клеток в биомедицинских клеточных продуктах в процессе регенерации // 2777257

Изобретение относится к биомедицине, медицине, биотехнологии, регенеративной медицине, в частности к способам определения жизнеспособности стволовых клеток в биомедицинских клеточных продуктах (БМКП) в процессе регенерации. Проводят окрашивание мезенхимальных стволовых клеток мембранным трассирующим красителем до формирования биомедицинских клеточных продуктов (БМКП), включение клеток в состав БМКП, культивирование in vitro сформированного БМКП, трансплантацию БМКП в ткани экспериментального животного, эвтаназию животного в контрольные сроки, выделение тканей из места имплантации БМКП.

Способ определения болезни паркинсона // 2785017

Изобретение относится к биотехнологии, медицине. Предложен способ определения прогрессирования патологического состояния у пациента с болезнью Паркинсона, включающий измерение количеств одной или более кишечных бактерий, выбранных из группы, состоящей из Bifidobacterium, группы Bacteroides fragilis, Lactobacillus brevis и подгруппы Lactobacillus plantarum и/или общего количества кишечных бактерий у пациента в два или более различных моментов времени и сравнение этих количеств; в случае, если количество снижается, считают, что тяжесть состояния при болезни Паркинсона повышается, если количество повышается, считают, что тяжесть состояния при болезни Паркинсона снижается.