Способ прогнозирования появления отдаленных метастазов меланомы хориоидеи

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике в области онкологии, и может быть использовано для прогнозирования появления отдаленных метастазов меланомы хориоидеи в процессе прижизненного патолого-анатомического исследования опухоли. Способ включает иммуногистохимическое исследование опухоли с использованием комбинации маркеров CD 4, CD 68, Macrophage, CD 34. Проводят количественное определение в меланоме хориоидеи Т-лимфоцитов хелперов/индукторов, макрофагов, объемной плотности кровеносных сосудов, на основании показателей которых выведена модель прогнозирования появления отдаленных метастазов меланомы хориоидеи, причем вероятность появления отдаленных метастазов MX (Р) по формуле. При этом вероятность появления отдаленных метастазов MX определяют как высокую, если Р>0,5, а при Р≤0,5 вероятность определяют как низкую. Изобретение обеспечивает возможности прогнозирования появления отдаленных метастазов MX на основе количественных показателей лимфоцитов и макрофагов, объемной плотности кровеносных сосудов в опухоли. Способ информативен и может быть применен в работе врачей на этапе хирургического лечения меланомы хориоидеи (MX) в ходе прижизненного патолого-анатомического исследования операционного материала энуклеированных глаз на основании разработанной модели прогнозирования появления отдаленных метастазов MX, которая с чувствительностью 83,3% и специфичностью 92% позволяет прогнозировать появление вторичных очагов опухоли. 1 табл.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к специальности Патологическая анатомия, Офтальмология, Онкология. Предлагаемый способ информативен и может быть применен в работе врача-патологоанатома на этапе хирургического лечения меланомы хориоидеи (MX) в ходе прижизненного патолого-анатомического исследования операционного материала энуклеированных глаз на основании разработанной модели прогнозирования появления отдаленных метастазов MX, которая с чувствительностью 83,3% и специфичностью 92% позволяет прогнозировать появление вторичных очагов опухоли.

Данный способ позволяет спрогнозировать появление отдаленных метастазов MX на основе количественных показателей лимфоцитов и макрофагов, а также количественных показателей объемной плотности кровеносных сосудов в опухоли.

Ранняя диагностика метастазов, а также прогнозирование их появления при различных злокачественных новообразованиях (ЗНО) является актуальной в современной онкоморфологии с целью формирования скрининговых групп пациентов, потенциально угрожаемых по развитию метастатической болезни, а также для дальнейшей разработки углубленного клинико-инструментального дообследования и возможных подходов к лечебной тактике ведения.

MX метастазирует вне зависимости от метода проведенного лечения. Таким образом прогнозирование появления ее вторичных очагов - актуальная проблема современной офтальмоонкологии. MX преимущественно метастазирует гематогенным путем, существенно снижая показатели выживаемости пациентов с данной патологией. Процессы ангиогенеза в опухоли, а также склонность атипичных клеток к «васкулярной мимикрии» играют важную роль в развитии отдаленных метастазов [Grossniklaus Н.Е., Eberhart C.G., Kivela T.T., editors (2018). WHO Classification of tumours of the eye. 4th edition. Lyon: IARC. 228р.]. При этом, вне зависимости от метода лечения, отдаленные метастазы могут выявляться с частотой в диапазоне 12-50% [Li Y, Shi J, Yang J, Ge S, Zhang J, Jia R, Fan X. Uveal melanoma: progress in molecular biology and therapeutics. Ther Adv Med Oncol. 2020; 12:1758835920965852. DOI: 10.1177/1758835920965852.; Beran TM, McCannel ТА, Stanton AL, Straatsma BR, Burgess BL. Reactions to and desire for prognostic testing in choroidal melanoma patients. Journal of genetic counseling. 2009;18(3):265-274. DOI: 10.1007/s 10897-009-9223-2; Damato BE, Heimann H, Kalirai H, Coupland SE. Age, survival predictors, and metastatic death in patients with choroidal melanoma: tentative evidence of a therapeutic effect on survival. JAMA ophthalmology. 2014;132 (5):605-13. DOI: 10.1001/jamaophthalmol.2014.77.; Панова И.Е., Власова O.C., Гюнтнер Е.И., Самкович Е.В., Шаманова А.Ю. Клинико-инструментальные критерии риска метастазирования меланомы хориоидеи. Российский офтальмологический журнал. 2019;12(3):30-36. DOI: 10.21516/2072-0076-2019-12-3-30-36; Panova IE, Vlasova OS, Gyuntner EI, Samkovich EV, Shamanova AYu. Clinical and instrumental criteria for the risk of metastasis of choroid melanoma. Russian Ophthalmological Journal. 2019;12(3):30-36 (in Russ.). DOI: 10.21516/2072-0076-2019-12-3-30-36; Pham ChM, Custer PL, Couch SM. Comparison of primary and secondary enucleation for uveal melanoma. Orbit. 2017; 36(6):422-427. DOI: 10.1080/01676830.2017.1337183].

Последние годы обсуждается взаимодействие между клетками увеальной меланомы и ее микроокружением (лимфоциты, макрофаги), а также противоопухолевое и проопухолевое воздействие последних. Авторами показано, что к факторам неблагоприятного прогноза MX относятся повышенная инфильтрация MX туморинфильтрирующими лимфоцитами, макрофагами, пожилой возраст пациента, развитая сосудистая сеть [Impact of macrophages on tumor growth characteristics in a murine ocular tumor model /Stei M.M., Loeffler K.U., Kurts C, Hoeller Т., Pfarrer C, Holz F.G., Herwig-Carl M.C. // Exp Eye Res. - 2016. - 151. - P. 9-18. doi: 10.1016/j.exer.2016.07.008.; Makitie Т., Summanen P., Tarkkanen A.,Kivela T. Tumor-infiltrating macrophages (CD68(+) cells) and prognosis in malignant uveal melanoma / Invest Ophthalmol Vis Sci. - 2001. - 42(7). - P. 1414-21.].

В некоторых работах показано, что для выявления скрытого метастазирования увеальных меланом возможно исследовать иммунологические параметры (уровень лимфоцитов) в сыворотке крови пациентов [Патент №2147373 Российская Федерация, МПК G01N 33/53. Способ выявления скрытого метастазирования при увеальной меланоме: заявл. 19.06.1998: опубл. 10.04.2000 / Лихванцева В.Г., Бровкина А.Ф., Гусев Г.А., Юровская Н.Н.; заявитель Московский НИИ глазных болезней имени Гельмгольца. - 9 с.]. Данный способ успешно применяется для иммунологического исследования сыворотки крови, но имеют ограниченное применение, так как не позволяют оценить клеточное микроокружение в самой опухоли меланомах хориоидеи при прижизненном патологоанатомическом "исследовании операционного материала энуклеированных глаз. Данный способ взят нами за прототип.

А также известен способ оценки степени васкуляризации ткани, основанный на определении кровеносных сосудов в ткани ИГХ-методом с антителом CD34 и измерении удельной плотности кровеносных сосудов [Патент №2366951 Российская Федерация, МПК G01N 33/483. Способ оценки степени васкуляризации: 2019140755: заявл. 31.03.2008: опубл. 10.09.2009 / Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Франк Г.А., Петров А.Н., Батева М.В.; заявитель ФГУ МНИОИ им. П.А. Герцена Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи. - 6 с.]. Данный способ успешно применяется для иммуногистохимических исследований по специальности Патологическая анатомия, позволяет определить удельную плотность сосудов на единицу площади образца исследуемой ткани -отношение количества сосудов к площади исследуемой ткани. Данный способ имеет ограниченное применение, так как при данном способе оценивается только количество сосудов и не учитывается площадь просветов сосудов. Данный способ взят нами за прототип.

В основу предлагаемого способа положена задача, заключающаяся в определении количества CD4- Т-лимфоцитов хелперов/индукторов, CD68, Macrophage - макрофагов и объемной плотности кровеносных сосудов (иммунореактивных к CD34) в опухоли в ходе ИГХ исследования операционного материала энуклеированных глаз с опухолью и оценки полученных показателей относительно статистически достоверно рассчитанных пороговых уровней исследуемых параметров.

Данный способ подразумевает использование комбинации широко применяемых в патологической анатомии стандартных методов ИГХ -исследования с использованием нами предлагаемой комбинации маркеров (антител) для обнаружения эндотелия кровеносных сосудов (CD34), макрофагов (CD68, Macrophage), Т лимфоцитов хелперов / индукторов (CD 4). Использование конкретной комбинации исследований обусловлено задачей предлагаемого способа, которой является обнаружение и количественная оценка исследуемых клеток и сосудов для дальнейшего прогнозирования появления отдаленных метастазов меланомы хориоидеи.

Изготовление ИГХ-микропрепаратов опухоли проводится стандартными методиками.

Раскрытие предлагаемого способа

Технический результат - обеспечение возможности прогнозирования появления отдаленных метастазов MX на основе количественных показателей лимфоцитов и макрофагов, объемной плотности кровеносных сосудов в опухоли.

Предлагаемый способ включает в себя следующие этапы проведения:

1. Тканевой образец опухоли (меланомы хориоидеи), полученный после хирургического лечения (энуклеации), фиксируют в 10% забуференом формалине в течении 24 часов.

2. Осуществляют механизированную проводку материала в гистологическом процессоре в соответствии с программой аппарата Sakura, Tissue-Tek Xpress х50.

3. Заливают тканевой материал в парафиновые блоки и нарезают гистологические срезы на микротоме, тканевые срезы толщиной до 4 мкм (для дальнейшего ИГХ -исследования).

4. Осуществляют постановку ИГХ-реакции в аппаратах согласно стандартным протоколам проведения исследования в аппаратах:

A. в аппарате для иммуногистохимии «Бонд - III» (Bond- III) с принадлежностями 2020 используют антитела CD68 (514Н12) (Bond).

При помощи автоматических устройств Ventana BenchMark. используют антитела к эндотелию кровеносных сосудов CD34 (Clone QBEnd 10), первичное антитело Ready-to-use (Ventana)); к Т-лимфоцитам хелперам/индукторам CD4 (Clone SP35) первичное антитело Ready-to-use (Ventana)); Macrophage (Clone HAM56) (Ventana).

Б. в иммуностейнере автоматическом Ventana BenchMark ULTRA IHC/ISH system используют антитела CD34 (Clone QBEnd 10), CD4 (Clone SP35), Macrophage (Clone HAM56).

B. В аппарате для иммуногистохимии «Бонд - III» (Bond- III) с принадлежностями 2020 используют антитела к макрофагам (CD68 (Clone 514Н12) первичное антитело Ready-to-use (Bond)).

5. Оценить приготовленные гистологические препараты с помощью световой микроскопии с оценкой области опухоли на 10 полей зрения при увеличении микроскопа 400. Сформировать оцифрованное электронное изображение микропрепарата (приготовленные микропрепараты фотографируются через встроенную в световой микроскоп камеру или сканируются в гистосканере) с использованием стандартных прикладных компьютерных программ проводят количественное вычисление исследуемых параметров с подсчетом на 10 полей зрения при увеличении 400.

Этапы постановки ИГХ-реакции:

1. Приготовить парафиновые срезы ткани опухоли (меланомы хориоидеи) на стеклах с адгезивным покрытием, покрытых поли-L-лизином

2. Поместить стекла с размещенными на них тканевыми срезами в термостат на 24 часа при температуре 60,2 градусов по Цельсию.

3. Поместить стекла с размещенными на них тканевыми срезами в аппараты: аппарат для иммуногистохимии «Бонд - III» (Bond- III) с принадлежностями 2020; в иммуностейнер автоматический Ventana BenchMark ULTRA IHC/ISH system

4. Провести автоматизировано депарафинирование срезов ткани опухоли, предварительную обработку, нанесение первичных антител, инкубацию с антителами CD34 (Clone QBEnd 10) (Ventana), CD4 (Clone SP35), Macrophage (Clone HAM56), CD68 (Clone 514H12) (Bond), докрашивание гематоксилином в соответствии с инструкциями и протоколами работы с данными антителами аппаратов.

Принцип окрашивания при ИГХ-исследовании:

В соответствии с инструкциями к аппаратам и антителам продукты реакции преципитируются с комплексом антиген-антитело, окрашивая его в коричневый цвет и его оттенки. Гематоксилин обеспечивает визуализацию ядер клеток в срезах.

В результате окраски гематоксилином ядра клеток приобретают синий либо сине-фиолетовый цвет.

5. Стекла со срезами после протокола проводки в аппарате Ventana промыть в теплой мыльной воде. Провести дегидратацию тканевых срезов по протоколу изопропиловой проводки в аппарате карусельного типа Sakura, Tissue-Tek Xpress х50 в течении 1 минуты дважды в изопропиловом спирте (Изопреп (Biovitrum)), по 1 мин дважды в ксилоле (Xylen for histology). Провести автоматизированное покрытие тканевых срезов на стеклах под покровную пленку в аппарате Sakura, Tissue-Tek Film.

6. Стекла со срезами после протокола проводки в аппарате Bond поместить для автоматизированного покрытия тканевых срезов под покровную пленку в аппарат Sakura, Tissue-Tek Film.

Оценить приготовленные гистологические препараты с помощью световой микроскопии с оценкой области опухоли на 10 полей зрения при увеличении микроскопа 400. При этом участки микропрепарата, содержащие иммунопозитивный компонент, окрашиваются в коричневый цвет и его оттенки, маркируют кровеносные сосуды (при проведении реакции с антителами к CD34), Т-лимфоциты хелперы/индукторы (с антителами к CD4), макрофаги (с антителами к CD68, Macrophage), а иммунонегативные - окрашиваются в сине-фиолетовый и оттенки синего или серого цветов [Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. - 4-е изд., доп. И перераб./ Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. - Казань, 2012. - 624 с.]. Использование конкретной комбинации маркеров обусловлено задачей предлагаемого способа, которой является обнаружение и количественная оценка объемной плотности кровеносных сосудов в MX, количества инфильтрирующих ткань опухоли макрофагов и Т-лимфоцитов хелперов/индукторов. Таким образом, в ходе анализа ИГХ-микропрепаратов проводится оценка по интенсивной окраске данных клеток коричневым хромогеном с последующим подсчетом количества клеток.

В предлагаемом способе для прогнозирования отдаленных метастазов MX предлагается количественно определять параметры с комбинацией иммуногистохимических маркеров (антител) для обнаружения эндотелия кровеносных сосудов (CD34), CD 4- Т-лимфоцитов и макрофагов (CD68, Macrophage) [Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. - 4-е изд., доп. И перераб./ Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. - Казань, 2012. - 624 с.]. Использование конкретной комбинации маркеров обусловлено задачей предлагаемого способа, которой является обнаружение и количественный подсчет в опухоли объемной плотности кровеносных сосудов, количества макрофагов и Т-лимфоцитов хелперов/индукторов.

Формируется оцифрованное электронное изображение микропрепарата (приготовленные микропрепараты фотографируются через встроенную в световой микроскоп камеру или сканируются в гистосканере) с использованием стандартных прикладных компьютерных программ проводят количественное вычисление исследуемых параметров с подсчетом на 10 полей зрения при увеличении 400.

При патологоанатомическом исследовании энуклеированных глаз никакие манипуляции с пациентами не проводятся.

Для определения пороговых показателей исследуемых параметров в MX, для решения вышеуказанной задачи были исследованы 50 случая с меланомой хориоидеи (MX): 1 группа исследования представлена случаями MX без отдаленных метастазов (N=30) и 2 группа - с верифицированными отдаленными метастазами меланомы хориоидеи (в печень) (N=20).

Проведены гистологическое и иммуногистохимическое исследование (ИГХ) тканевых образцов с антителами к CD68, Macrophage для идентификации макрофагального звена клеточного окружения MX, CD 4- Т-лимфоцитов хелперов/индукторов, маркера к эндотелию кровеносных сосудов (CD 34). Для получения математической модели (уравнения) прогноза нами был проведен множественный логистический регрессионный анализ с принудительным включением трех переменных: показателей объемной плотности кровеносных сосудов (ИГХ исследование с использованием CD34), количество Т-лимфоцитов индукторов/хелперов CD4, количество макрофагов CD68, Macrophage. Проверка статистических гипотез показала, что уравнение (р<0,001) и его коэффициенты являются статистически значимыми (таблица 1).

где

- объемная плотность кровеносных сосудов (CD34).

- количество Т-лимфоцитов CD4,

- количество макрофагов CD68,

Р - вероятность появления метастазов опухоли.

Данная модель с чувствительностью 83,3% и специфичностью 92% позволяет прогнозировать появление метастазов MX, если рассчитанная по формуле вероятность Р - будет больше 0,5. Общий процент правильно классифицированных наблюдений составил 88,4%.

Применение данного способа в патологической анатомии, в онкологии позволит уже на этапе хирургического, лечения прогнозировать у пациентов появление отдаленных метастазов MX и в дальнейшем разрабатывать для данной категории больных прицельную скрининговую диагностику метастазов с целью раннего их обнаружения и коррекции тактики лечения.

Исходя из вышеперечисленного можно сделать вывод о том, что исследуемый способ информативен в отношении прогнозирования метастазов MX и может быть применен в работе врача-патологоанатома уже на этапе прижизненного: патолого-анатомического исследования операционного материала энуклеированных глаз при MX.

Способ прогнозирования появления отдаленных метастазов меланомы хориоидеи в процессе прижизненного патолого-анатомического исследования опухоли, включающий иммуногистохимическое исследование опухоли с использованием комбинации маркеров CD 4, CD 68, Macrophage, CD 34, отличающийся тем, что при данном способе проводится количественное определение в меланоме хориоидеи Т-лимфоцитов хелперов/индукторов, макрофагов, объемной плотности кровеносных сосудов, на основании показателей которых выведена модель прогнозирования появления отдаленных метастазов меланомы хориоидеи, причем вероятность появления отдаленных метастазов MX по формуле:

где

x₁ - объемная плотность кровеносных сосудов (CD34),

х₂ - количество Т-лимфоцитов CD4,

х₃ - количество макрофагов CD68,

при этом вероятность появления отдаленных метастазов MX определяют как высокую, если Р>0,5, а при Р≤0,5 вероятность определяют как низкую.