Подавление аллодинии, вызванной раком костей

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для подавления аллодинии, вызванной раком кости. Применение по изобретению касается ботулинического нейротоксина для подавления аллодинии, вызванной раком кости, у пациента, страдающего раком кости, где ботулинический нейротоксин вводят в дозе 10-40 Ед/кг пациента. Использование изобретения позволяет усилить подавление аллодинии. 9 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл., 3 пр.

 

Настоящее изобретение относится к способу подавления аллодинии, вызванной раком кости, предпочтительно для подавления тактильной аллодинии, вызванной раком кости.

Аллодиния означает «другая боль». Это боль, вызванная стимулом, который обычно не является болезненным. Например, субъект, страдающий от сильного солнечного ожога, может испытывать сильную боль даже при легком прикосновении. Более подробно, воздействие солнца может вызвать чрезмерную сенсибилизацию кожи, поэтому ношение рубашки или принятие душа может быть очень болезненным. Таким образом, страдающий тактильной аллодинией (также известной как статическая тактильная аллодиния или механическая аллодиния), может испытывать боль при прикосновении, например, если положить голову на подушку или носить шляпу, серьги или ожерелье. Точно так же страдающий динамической аллодинией может испытывать боль от легкого расчесывания волос или от бритья лица. Аллодиния представляет собой состояние, которое отличается от «отраженной» боли (также известной как рефлекторная боль), хотя она может возникать вне стимулируемой области. Она также отличается от гипералгезии, которая является болевым стимулом, который является более болезненным, чем обычно. В самом деле, как упоминалось выше, аллодиния по своему определению является «болью из-за стимула, который обычно не вызывает боли», в отличие от гипералгезии (усиление боли от стимула, который обычно вызывает боль).

Аллодиния отличается от «отраженной» боли и гипералгезии не только на уровне симптомов, но также на молекулярном/клеточном уровне. Известно, что периферическая сенсибилизация и дезадаптивные центральные изменения способствуют возникновению и поддержанию реакций на сенсорную модальность (например, прикосновение, давление, укол булавкой, холод и тепло) с отдельными механизмами в разных подтипах аллодинии и гипералгезии. Сообщается, что основной механизм «кожной аллодинии» при мигрени связан с сенсибилизацией определенного набора нейронов, а именно нейронов второго порядка в каудальном ядре тройничного нерва (TNC).

Разница между аллодинией и другими типами боли проявляется в том, что некоторые анальгетики неэффективны для лечения аллодинии. Например, сообщалось, что аллодиния плохо реагирует на триптаны (класс препаратов, которые действуют как агонисты серотониновых рецепторов 5-HT1B и 5-HT1D в кровеносных сосудах и нервных окончаниях головного мозга), что позволяет предположить, что аллодиния не связана (или плохо связана) с указанными рецепторами, так что они являются плохими кандидатами-мишенями для лечения аллодинии.

Аллодиния связана с (например, вызвана) определенными заболеваниями, особенно с раком костей. Примерно у трети пациентов с прогрессирующим раком в течение заболевания развиваются клинически значимые скелетные метастазы. Это наиболее заметно у пациентов, страдающих раком молочной железы, простаты или легкого. Действительно, кость является третьим по распространенности местом метастазирования после легкого и печени.

Как правило, метастазы в кости появляются на поздней стадии злокачественных новообразований и связаны с болью (боль в костях, вызванная раком). Боль в костях представляет серьезную клиническую проблему, связанную с нарушением функциональных исходов и низким качеством жизни. У пациентов, страдающих как остеолитическим, так и остеобластным метастатическим раком кости, боль возникает в результате структурного повреждения кости, раздражения надкостницы и защемления нерва. Боль обычно описывается как глубокое, раздражающее, локализованное ощущение, которое вызывает боль и жжение в пораженной области и обычно усиливается при нагрузке. Механическая аллодиния особенно распространена при метастатическом раке костей, вызывая сильную боль при кашле, поворотах в постели или осторожных движениях конечностей.

Опиоидное лечение боли при запущенном раке костей (например, аллодинии) является обычным и достаточно эффективным. Однако диапазон доз, необходимый для ослабления боли при раке костей, вызывает неприемлемые когнитивные побочные эффекты и побочные эффекты со стороны желудочно-кишечного тракта, и существует много типов пациентов, которым противопоказаны опиоиды (см. ниже). Кроме того, широко признанная в настоящее время проблема опиоидной зависимости вызывает серьезные сомнения относительно будущего использования (особенно долгосрочного) этого класса лекарственных средств в качестве подходящего анальгетика выбора.

Соответственно, существует возрастающая потребность в альтернативных терапиях/терапевтических средствах против аллодинии. В частности, существует потребность в альтернативных анальгетиках, эффективных для подавления боли, вызванной раком костей.

Настоящее изобретение решает эту проблему, предлагая альтернативные и/или улучшенные средства подавления аллодинии, вызванной раком кости.

Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии того, что введение нецитотоксической протеазы приводит к подавлению аллодинии. Это удивительно, учитывая уникальную молекулярную природу аллодинии по сравнению, например, с невралгией (при которой традиционно использовались нецитотоксические протеазы).

В дополнение к этому открытию авторы настоящего изобретения обнаружили, что нецитотоксическая протеаза приводит к подавлению особенно дискомфортного (например, связанного со значительным снижением качества жизни) типа аллодинии, а именно аллодинии, вызванной раком костей. Таким образом, авторы настоящего изобретения идентифицировали важную субпопуляцию (или подгруппу) пациентов, которым может быть полезно лечение нецитотоксической протеазой.

Таким образом, изобретатели настоящего изобретения не только открыли новую область применения нецитотоксической протеазы (аллодинии), они обнаружили удивительный технический эффект в указанной области (подавление аллодинии, вызванной раком костей).

Соответственно, настоящее изобретение предоставляет способ подавления аллодинии, вызванной раком кости, у пациента, причем указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества нецитотоксической протеазы пациенту, страдающему раком кости.

Настоящее изобретение предоставляет соответствующее терапевтическое применение, а именно нецитотоксическую протеазу для применения в подавлении аллодинии, вызванной раком кости, у пациента, страдающего раком кости.

Ключевым преимуществом изобретения является то, что настоящее изобретение обеспечивает выгодное «перенацеливание» нецитотоксической протеазы, обеспечивая лечение, альтернативное вызывающим привыкание анальгетикам, таким как опиоиды (например, морфин). Это особенно выгодно для лечения пациентов, которым противопоказано другое (отличающееся) болеутоляющее средство, например, все триптаны противопоказаны пациентам с сердечно-сосудистыми заболеваниями (коронарные спазмы, симптоматическая ишемическая болезнь сердца, после сердечного приступа или инсульта, неконтролируемая гипертензия, болезнь Рейно, заболевание периферических артерий). Большинство триптанов также противопоказаны при беременности и кормлении грудью, а также пациентам моложе 18 лет. Существуют многочисленные противопоказания к приему опиоидов (морфина), такие как (просто в качестве примера) системный мастоцитоз, нелеченое понижение уровня гормонов щитовидной железы и снижение функции надпочечников.

В одном варианте осуществления субъекту вводят нецитотоксическую протеазу. Термины «субъект», «индивидуум» и «пациент» используются в настоящем описании взаимозаменяемо для обозначения субъекта-млекопитающего. В одном варианте осуществления «субъект» представляет собой человека, домашнее животное (например, домашнее животное, такое как собака, кошка и/или кролик), домашний скот (например, свинья, овца, крупный рогатый скот и/или коза) и/или лошадь. В одном из вариантов осуществления субъект (пациент) является человеком.

В способах по настоящему изобретению у субъекта ранее не был диагностирован рак кости. В качестве альтернативы, у субъекта ранее мог быть диагностирован рак кости. Субъектом также может быть тот, у кого имеются факторы риска заболевания, или тот, кто имеет бессимптомный рак кости. Субъект также может быть тем, кто страдает от или находится в группе риска развития рака кости. В одном варианте осуществления субъекту ранее проводили лечение рака кости.

В способах по настоящему изобретению у субъекта ранее не была диагностирована аллодиния, вызванная раком кости. В качестве альтернативы, у субъекта ранее могла быть диагностирована аллодиния, вызванная раком кости. Субъектом также может быть тот, у кого имеются факторы риска заболевания, или тот, кто имеет бессимптомную аллодинию, вызванную раком кости. Субъект также может быть тем, кто страдает от или находится в группе риска развития аллодинии, вызванной раком кости. В одном варианте осуществления субъекту ранее проводили лечение аллодинии, вызванной раком кости.

Термин «подавление» используется в настоящем документе как синоним термина «лечение». Таким образом, настоящее изобретение охватывает способ лечения аллодинии, вызванной раком кости, у пациента, причем указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества нецитотоксической протеазы пациенту, страдающему раком кости. Настоящее изобретение также охватывает соответствующее терапевтическое применение, а именно нецитотоксическую протеазу для применения при лечении аллодинии, вызванной раком кости, у пациента, страдающего раком кости.

Термин «подавлять» или «подавление», или «лечить», или «лечение», как используется в настоящем документе, охватывает профилактическое подавление и лечение (например, для предотвращения возникновения аллодинии, вызванной раком кости), а также корректирующее подавление и лечение (подавление и лечение субъекта, уже страдающего от аллодинии, вызванной раком костей). В предпочтительном варианте осуществления термин «подавлять» или «подавление», как используется в настоящем документе, означает корректирующее лечение. В предпочтительном варианте осуществления термин «лечить» или «лечение», как используется в настоящем документе, означает корректирующее лечение. Термин «подавлять», или «подавление», или «лечить», или «лечение» включает подавление и лечение как аллодинии, вызванной раком кости, так и ее симптома. В некоторых вариантах осуществления термин «подавлять» или «подавление», или «лечить», или «лечение» относится к симптому аллодинии, вызванной раком кости.

Следовательно, нецитотоксическая протеаза и/или обезболивающее действующее вещество (предпочтительно нецитотоксическая протеаза) может быть введена субъекту в терапевтически эффективном количестве или профилактически эффективном количестве.

«Терапевтически эффективное количество» представляет собой любое количество нецитотоксической протеазы и/или обезболивающего действующего вещества (предпочтительно нецитотоксической протеазы), которое при введении отдельно или в комбинации субъекту для подавления/лечения аллодинии, вызванной раком кости (или его симптома), является достаточным для осуществления такого подавления/лечения аллодинии, вызванной раком кости, или ее симптома.

«Профилактически эффективное количество» представляет собой любое количество нецитотоксической протеазы и/или обезболивающего действующего вещества (предпочтительно нецитотоксической протеазы), которое при введении отдельно или в комбинации субъекту ингибирует или задерживает начало или повторное появление аллодинии, вызванной раком кости (или ее симптома). В некоторых вариантах осуществления профилактически эффективное количество полностью предотвращает начало или повторение аллодинии, вызванной раком кости. «Подавление» наступления означает либо уменьшение вероятности возникновения аллодинии, вызванной раком кости, (или ее симптома), либо полное предотвращение ее возникновения.

В одном варианте осуществления, способы и применения изобретения включают одну или несколько стадий введения, выбранных из перорального, внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного, внутримышечного, подкожного, ректального или вагинального, ингаляционного, местного или их комбинации. В одном варианте осуществления, введение представляет собой одно или несколько, выбранное из внутривенного, внутриартериального (например, путем инъекции или капельного введения), подкожного или их комбинацию.

В одном варианте осуществления, указанный способ/терапевтическое применение включает совместное введение анальгетика (например, опиата, такого как морфин). Таким образом, изобретение предоставляет терапевтическую комбинацию, содержащую компонент нецитотоксический протеазы и опиоидный компонент. Анальгетик отличается от компонента нецитотоксической протеазы и предпочтительно вводится в субэффективном терапевтически эффективном количестве. Указанная комбинированная терапия обеспечивает неожиданный аналгетический эффект и снижает терапевтическую нагрузку опиоидного компонента.

Порядок применения/введения компонентов терапевтической комбинации может изменяться. Нецитотоксическую протеазу и опиоид можно вводить одновременно (например, оба в их собственной конкретной оптимальной дозе для достижения синергизма), либо как часть одной композиции, либо в отдельных композициях. Например, нецитотоксическая протеаза может присутствовать в первой композиции (например, адаптированной для внутривенного введения субъекту), а опиоид может присутствовать во второй композиции (например, адаптированной для внутривенного, подкожного или перорального введения субъекту).

Кроме того, нецитотоксическую протеазу и опиоид можно вводить в разное время (например, нецитотоксическая протеаза может быть предварительно введена для сенсибилизации аллодинии, вызванной раком кости, к опиоиду, и наоборот). Таким образом, в дополнительном варианте осуществления нецитотоксическую протеазу и опиоид вводят субъекту в разное время в отдельных композициях.

В одном варианте осуществления компонент нецитотоксической протеазы вводят перед опиоидом. В одном варианте осуществления компонент нецитотоксической протеазы вводят одновременно с опиоидом. В одном варианте осуществления нецитотоксическую протеазу вводят последовательно с опиоидом.

Таким образом, при использовании компонент нецитотоксической протеазы можно вводить до, одновременно с или после другого анальгетического компонента.

В одном варианте осуществления, аллодиния представляет собой одну или несколько выбранных из тактильной аллодинии (используется как синоним термина «механическая аллодиния»), статической аллодинии (например, боли в ответ на прикосновение), динамической аллодинии (например, боли в ответ на легкое поглаживание), тепловой (горячей или холодной) аллодинии (например, боли от обычно умеренной температуры кожи в пораженной области), двигательной аллодинии (например, боль, вызванная нормальным движением суставов или мышц) или кожной аллодинии.

В одном варианте осуществления, аллодиния состоит или включает тактильную аллодинию (также известная как статическая тактильная аллодиния или механическая аллодиния) и/или динамическую аллодинию. В предпочтительном варианте осуществления, аллодиния представляет собой тактильную аллодинию (например, механическую аллодинию).

Введение обычно осуществляется локально в участок, выбранный из структурно поврежденной кости, раздражения надкостницы, защемления нерва и/или другой поврежденной области. Введение обычно осуществляют проксимально к локальной концентрации раковых клеток кости.

В одном варианте осуществления, введение осуществляют непосредственно в раковые клетки кости или в их соединительную ткань.

Не желая быть связанными теорией, полагают, что аллодиния с большей вероятностью индуцируется метастатическим раком (например, в большей степени, чем доброкачественным и/или неметастатическим раком). Другая теория предполагает, что аллодиния индуцируется метастатическим раком, возникающим из другой (например, не костной) ткани, до метастазирования в кость (например, из-за инвазии окружающих нарушений мягких тканей).

В одном варианте осуществления рак кости представляет собой метастатический рак кости (например, метастазы в кости).

В одном варианте осуществления, рак кости представляет собой метастатический рак, который возникает из ткани, отличной от кости (например, ткани, отличной от костной ткани). Примеры тканей, где может возникнуть рак (до метастазирования в кость), включают ткань простаты, груди, легкого и/или яичника.

В одном варианте осуществления пациент (например, субъект) имеет один из одного или нескольких видов рака (предпочтительно дополнительно к указанному раку кости), выбранных из рака легкого, рака молочной железы, рака предстательной железы и рака яичников (предпочтительно метастатического рака легкого, метастатического рака молочной железы, метастатического рака предстательной железы и метастатического рака яичников). У пациента может быть рак легкого. У пациента может быть рак молочной железы. У пациента может быть рак предстательной железы. У пациента может быть рак яичников.

В одном варианте осуществления, рак кости представляет собой метастатический рак, который отличается от доброкачественной опухоли. В одном варианте осуществления, аллодиния не вызвана остеоидной остеомой. В одном варианте осуществления, рак кости отличается от остеоидной остеомы (т.е. рак кости не включает остеоидную остеому).

Оценка указанного «подавления аллодина, вызванного раком костей» продемонстрирована ссылкой на прилагаемые примеры и может быть оценена с использованием методологии, описанной в примерах (например, пример 1). Например, в примере 1 (и связанных с ним материалах и способах) описан способ измерения аллодинии с помощью электронного теста фон Фрея. Этот тест включает приложение увеличивающегося давления на подошвенную область задних лап животного (предпочтительно крысы). Тест проводят на животных с одной задней лапой, воспаленной в результате инъекции или травмированной, и одной нормальной задней лапой (например, контрольной лапой) для оценки лекарственного средства-кандидата (например, нецитотоксической протеазы), который был введен животному, в отношении анальгетического действия. Устройство прилагает постоянно увеличивающуюся силу, и пороги чувствительности определяют как давление (г), необходимое для того, чтобы вызвать отдергивание лапы, чтобы обеспечить наблюдаемое значение «Порога отдергивания лапы (г)».

Животным, используемым в электронном теста фон Фрея, предпочтительно является модель боли при раке костей у крыс с клетками карциномы молочной железы MRMT-1 (Medhurst S.J., et al., “A rat model of bone cancer”, Pain, 2002: pp.129-140; включенное в настоящий документ в качестве ссылке), хорошо охарактеризованная модель на животных для фармацевтического тестирования боли при раке. Эта модель является широко принятой, поскольку она имитирует аспекты патогенеза и патологии в период времени, совместимый с доклиническими исследованиями боли.

Указанный «Порог отдергивания лапы (г)» может быть измерен в течение одного или нескольких выбранных из 2 дней, 4 дней, 6 дней, 8 дней, 10 дней, 12 дней, 14 дней, 15 дней, 16 дней, 17 дней, 18 дней, 19 дней, 20 дней или 21 дня после лечения нецитотоксической протеазой. В одном варианте осуществления, «Порог отдергивания лапы (г)» может быть измерен в течение одного или нескольких выбранных из 14 дней, 18 дней или 21 дня (предпочтительно 21 дня) после лечения нецитотоксической протеазой и/или повреждения лапы животного. Предпочтительно, измерение перед лечением также проводили перед воспалением или травмированием лапы.

В одном варианте осуществления, указанный «Порог отдергивания лапы (г)» может быть измерен в течение одного или нескольких выбранных из 0 мин, 30 мин, 60 мин, 90 мин, 120 мин, 150 мин, 140 мин, и 160 мин (предпочтительно 160 мин) после лечения нецитотоксической протеазой и/или повреждения лапы животного. Предпочтительно, измерение перед лечением также проводили перед воспалением или травмированием лапы.

В одном варианте осуществления, нецитотоксическая протеаза по изобретению подавляет аллодинию, вызванную раком кости, по меньшей мере на 10%, или по меньшей мере на 20%, или по меньшей мере на 30%, или по меньшей мере на 40%, или по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере на 60%, или по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или на 100% (что соответствует увеличению «Порога отдергивания лапы» по меньшей мере на 10%, или по меньшей мере на 20%, или по меньшей мере на 30%, или по меньшей мере на 40%, или по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере на 60%, или по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или 100%) больше, чем при идентичном в остальном введении без нецитотоксической протеазы (например, введение только носителя).

В одном варианте осуществления, нецитотоксическая протеаза по изобретению подавляет аллодинию, вызванную раком кости, по меньшей мере на 2%, или по меньшей мере на 4%, или по меньшей мере на 6%, или по меньшей мере на 8%, или по меньшей мере на 10%, или по меньшей мере на 12%, или по меньшей мере на 14%, или по меньшей мере на 16%, или по меньшей мере на 18% или на 20% (что соответствует увеличению «Порога отдергивания лапы» по меньшей мере на 2%, или по меньшей мере на 4%, или по меньшей мере на 6%, или по меньшей мере на 8%, или по меньшей мере на 10%, или по меньшей мере на 12%, или по меньшей мере на 14%, или по меньшей мере на 16%, или по меньшей мере на 18% или на 20%) больше, чем при идентичном в остальном введении без нецитотоксической протеазы (например, введение только носителя).

В отличие от цитотоксической протеазы (например, рицин, дифтерийный токсин, экзотоксин синегнойной палочки), которая действует, убивая свою естественную клетку-мишень, нецитотоксическая протеаза действует, временно выводя из строя клеточную функцию своей естественной клетки-мишени. Важно отметить, что нецитотоксическая протеаза не убивает естественную клетку-мишень, на которую она действует. Некоторые из наиболее известных примеров нецитотоксических протеаз включают клостридиальные нейротоксины (например, ботулинический нейротоксин, который продается под такими названиями, как Dysport^TM, Neurobloc^TM, и Botox^TM), IgA-протеазы (см., например, WO99/032272), и протеазы антареаза (см., например, WO2011/022357). Более подробно, нецитотоксические протеазы действуют путем протеолитического расщепления и, таким образом, инактивируют внутриклеточные транспортные белки, известные как белки SNARE (например, SNAP-25, VAMP, или Syntaxin) - см. Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology” (4^th edition) John Wiley & Sons, Inc. Акроним SNARE происходит от термина «растворимый рецептор прикрепления NSF», где NSF означает N-этилмалеинимид-чувствительный фактор. Белки SNARE являются важными компонентами процесса везикулярной секреции в эукариотических клетках. Таким образом, нецитотоксические протеазы действуют путем подавления клеточной секреции. Этот класс белков включает перенаправленные нецитотоксические белки, в которых естественная связывающая способность белка была модифицирована путем введения связывающего лиганда (также известного как нацеливающий фрагмент), тем самым придавая модифицированному белку новые свойства связывания с клеткой-мишенью. Заявитель разработал технологию, относящуюся к перенаправлению нецитотоксических протеаз, которая относится к 1990-м годам (см., например, WO 94/21300, WO 96/33273 и WO 98/07864). Указанные перенаправленные белки упоминаются (в литературе и в научном сообществе) как целевые ингибиторы секреции (TSI) - ссылка на TSI включает структурные эквиваленты, такие как те, что описаны в WO 2011/018665.

Предпочтительной нецитотоксической протеазой по настоящему изобретению является клостридиальный нейротоксин, такой как столбнячный токсин, ботулинический нейротоксин (например, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C₁, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, и их подтипы), или C. butyricum. В предпочтительном варианте осуществления нецитотоксическая протеаза представляет собой BoNT/A.

Ссылка в настоящем документе на нецитотоксическую протеазу включает природные и рекомбинантные клостридиальные нейротоксиновые протеазы, протеазы антареаза и протеазы IgA. Сюда входят гибриды серотипов (такие как гибриды серотипов структурных доменов BoNT), модифицированные нейротоксины (такие как TSI) и мультидоменные нейротоксины (например, мульти L-цепь BoNT).

Нецитотоксическая протеаза по настоящему изобретению влияет на те же последовательные стадии интоксикации, которые может продемонстрировать клостридиальный нейротоксин (см. фиг. 4). Например, связывание с естественной клеткой-мишенью клостридиального нейротоксина, приводящее к эндосомному высвобождению нецитотоксической протеазы в цитозоль указанной клетки-мишени и приводящее к расщеплению SNARE в цитозоле. В предпочтительном варианте осуществления нецитотоксическая протеаза по настоящему изобретению действует на те же последовательные стадии интоксикации, которые может продемонстрировать BoNT/A (например, BoNT/A₁), а именно связывание с нервными клетками (например, через полисиалоганглиозидный рецептор) пресинаптического мышечного соединения, приводящее к эндосомальному высвобождению протеазы в цитозоль и приводящее к расщеплению SNAP-25 внутри цитозоля.

В качестве примера типичные последовательности протеаз (эталонные) включают:

Ботулинический нейротоксин типа A - аминокислотные остатки (1-448)

Ботулинический нейротоксин типа B - аминокислотные остатки (1-440)

Ботулинический нейротоксин типа C - аминокислотные остатки (1-441)

Ботулинический нейротоксин типа D - аминокислотные остатки (1-445)

Ботулинический нейротоксин типа E - аминокислотные остатки (1-422)

Ботулинический нейротоксин типа F - аминокислотные остатки (1-439)

Ботулинический нейротоксин типа G - аминокислотные остатки (1-441)

Cтолбнячный нейротоксин - аминокислотные остатки (1-457)

Протеаза IgA - аминокислотные остатки (1-959)*

* Pohlner, J. et al. (1987). Nature 325, pp. 458-462, который включен в настоящий документ в качестве ссылки.

Вышеуказанную эталонную последовательность следует рассматривать в качестве гидовой, поскольку в зависимости от субсеротипов могут иметь место небольшие вариации. В качестве примера в US 2007/0166332 (включенном в настоящий документе в качестве ссылки) приведены несколько отличающиеся клостридиальные последовательности:

Ботулинический нейротоксин типа A - аминокислотные остатки (M1-K448)

Ботулинический нейротоксин типа B - аминокислотные остатки (M1-K441)

Ботулинический нейротоксин типа C - аминокислотные остатки (M1-K449)

Ботулинический нейротоксин типа D - аминокислотные остатки (M1-R445)

Ботулинический нейротоксин типа E - аминокислотные остатки (M1-R422)

Ботулинический нейротоксин типа F - аминокислотные остатки (M1-K439)

Ботулинический нейротоксин типа G - аминокислотные остатки (M1-K446)

Cтолбнячный нейротоксин - аминокислотные остатки (M1-A457)

Различные фрагменты клостридиального токсина, содержащие легкую цепь, могут быть полезны в аспектах настоящего изобретения при условии, что эти фрагменты легкой цепи могут специфически нацеливаться на центральные компоненты аппарата высвобождения нейротрансмиттера и, таким образом, участвовать в осуществлении общего клеточного механизма, посредством чего клостридиальный токсин протеолитически расщепляет субстрат. Легкие цепи клостридиальных токсинов составляют примерно 420-460 аминокислот в длину и содержат ферментный домен. Исследования показали, что вся длина легкой цепи клостридиального токсина не является необходимой для ферментативной активности ферментного домена. В качестве неограничивающего примера, первые восемь аминокислот легкой цепи BoNT/A не требуются для ферментативной активности. В качестве другого неограничивающего примера первые восемь аминокислот легкой цепи TeNT не требуются для ферментативной активности. Точно так же карбоксильный конец легкой цепи не является необходимым для активности. В качестве неограничивающего примера последние 32 аминокислоты легкой цепи BoNT/A (остатки 417-448) не требуются для ферментативной активности. В качестве другого неограничивающего примера последние 31 аминокислоты легкой цепи TeNT (остатки 427-457) не требуются для ферментативной активности. Таким образом, аспекты этого варианта осуществления могут включать легкие цепи клостридиального токсина, содержащие ферментный домен, имеющий длину, например, по меньшей мере 350 аминокислот, по меньшей мере 375 аминокислот, по меньшей мере 400 аминокислот, по меньшей мере 425 аминокислот и по меньшей мере 450 аминокислот. Другие аспекты этого варианта осуществления могут включать легкие цепи клостридиального токсина, содержащие ферментный домен, имеющий длину, например, не более 350 аминокислот, не более 375 аминокислот, не более 400 аминокислот, не более 425 аминокислот и не более 450 аминокислот.

В одном варианте осуществления, нецитотоксическая протеаза расщепляет не-нейрональный белок SNARE, такой как белок SNAP-23. В одном варианте осуществления, нецитотоксическая протеаза представляет собой модифицированную L-цепь ботулинического токсина, способную расщеплять SNAP-23. Пример такой модифицированной L-цепи описан Chen and Barbieri, PNAS, vol. 106, no. 23, p9180-9184, 2009.

В одном варианте осуществления, нецитотоксическая протеаза представляет собой протеазу BoNT/A, BoNT/C или BoNT/E, и предпочтительный мотив SNARE представляет собой мотив SNAP (например, SNAP 25). В другом варианте осуществления, нецитотоксическая протеаза может представлять собой BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F или BoNT/G или столбнячный нейротоксин (TeNT) протеазу, и предпочтительный мотив SNARE представляет собой мотив VAMP. В другом варианте осуществления нецитотоксическая протеаза представляет собой протеазу BoNT/C1, и предпочтительный мотив SNARE представляет собой мотив синтаксина.

Полипептиды по настоящему изобретению, особенно их компонент протеазы, могут быть пегилированы - это может помочь увеличить стабильность, например, продолжительность действия компонента протеазы. Пегилирование особенно предпочтительно, когда протеаза включает протеазу BoNT/A, B или C1. Пегилирование предпочтительно включает добавление ПЭГ к N-концу компонента протеазы. Например, N-конец протеазы может быть удлинен одним или несколькими аминокислотными остатками (например, цистеином), которые могут быть одинаковыми или разными. Один или несколько указанных аминокислотных остатков могут иметь свою собственную молекулу ПЭГ, присоединенную (например, ковалентно присоединенную) к нему. Пример этой технологии описан в WO2007/104567, которая полностью включена в нее посредством ссылки на нее.

Нецитотоксическая протеаза представляет собой предпочтительно протеазу BoNT/A, BoNT/C₁ или BoNT/E, и предпочтительный мотив SNARE представляет собой мотив SNAP (например, SNAP 25).

Альтернативно, нецитотоксическая протеаза может представлять собой BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F или BoNT/G или столбнячный нейротоксин (TeNT) протеазу, и предпочтительный мотив SNARE представляет собой мотив VAMP. Альтернативно, нецитотоксическая протеаза представляет собой протеазу BoNT/C₁, и предпочтительный мотив SNARE представляет собой мотив синтаксина.

При использовании нецитотоксическая протеаза по настоящему изобретению (например, L-цепь клостридиального нейротоксина или эквивалентная протеаза, расщепляющая SNARE) обычно доставляется в свой целевой участок (т.е. цитозоль естественной клетки-мишени клостридиального нейротоксина) путем взаимодействия/координации с компонентами каркаса клостридиального нейротоксина, а именно с нацеливающим фрагментом (например, доменом H_C клостридиального нейротоксина или эквивалентом) и доменом транслокации (например, доменом H_N клостридиального нейротоксина или эквивалентом). Эти компоненты каркаса хорошо известны специалистам в данной области.

В качестве примера, типичные последовательности транслокации (эталонные) включают:

Ботулинический нейротоксин типа A - аминокислотные остатки (449-871)

Ботулинический нейротоксин типа B - аминокислотные остатки (441-858)

Ботулинический нейротоксин типа C - аминокислотные остатки (442-866)

Ботулинический нейротоксин типа D - аминокислотные остатки (446-862)

Ботулинический нейротоксин типа E - аминокислотные остатки (423-845)

Ботулинический нейротоксин типа F - аминокислотные остатки (440-864)

Ботулинический нейротоксин типа G - аминокислотные остатки (442-863)

Cтолбнячный нейротоксин - аминокислотные остатки (458-879)

Вышеуказанную эталонную последовательность следует рассматривать в качестве гидовой, поскольку в зависимости от субсеротипов могут иметь место небольшие вариации. В качестве примера в US 2007/0166332 (включенном в настоящий документе в качестве ссылки) приведены несколько отличающиеся клостридиальные последовательности:

Ботулинический нейротоксин типа A - аминокислотные остатки (A449-K871)

Ботулинический нейротоксин типа B - аминокислотные остатки (A442-S858)

Ботулинический нейротоксин типа C - аминокислотные остатки (T450-N866)

Ботулинический нейротоксин типа D - аминокислотные остатки (D446-N862)

Ботулинический нейротоксин типа E - аминокислотные остатки (K423-K845)

Ботулинический нейротоксин типа F - аминокислотные остатки (A440-K864)

Ботулинический нейротоксин типа G - аминокислотные остатки (S447-S863)

Cтолбнячный нейротоксин - аминокислотные остатки (S458-V879)

Настоящее изобретение также охватывает вариантные домены транслокации при условии, что вариантные домены все еще демонстрируют необходимую транслокационную активность. В качестве примера вариант может иметь по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% гомологии аминокислотной последовательности с эталонным доменом транслокации. Термин фрагмент, когда он используется по отношению к домену транслокации, означает пептид, имеющий по меньшей мере 20, предпочтительно по меньшей мере 40, более предпочтительно по меньшей мере 80 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 100 аминокислотных остатков эталонного домена транслокации. В случае клостридиального домена транслокации фрагмент предпочтительно имеет по меньшей мере 100, предпочтительно по меньшей мере 150, более предпочтительно по меньшей мере 200 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 250 аминокислотных остатков эталонного домена транслокации (например, домена H_N). Что касается TM «фрагмента» компонента (обсужденного выше), «фрагменты» транслокации по настоящему изобретению включают фрагменты вариантных доменов транслокации на основе эталонных последовательностей.

Хорошо известно, что определенные домены молекул бактериального токсина способны образовывать такие поры. Также известно, что некоторые домены транслокации экспрессированных в вирусах мембранных слитых белков способны образовывать такие поры. Такие домены можно использовать по настоящему изобретению.

Другие примеры включают домен транслокации дифтерийного токсина, домен транслокации экзотоксина Pseudomonas типа A, домены транслокации токсина сибирской язвы, гемагглютинин вируса гриппа, фузогенный пептид вируса леса Семлики, гликопротеин G вируса везикулярного стоматита, белок F вируса SER и гликопротеин оболочки вируса пенистости обезьян.

В контексте настоящего изобретения различные области H_N клостридиального токсина, содержащие домен транслокации, могут быть полезны в аспектах настоящего изобретения при условии, что эти активные фрагменты могут способствовать высвобождению нецитотоксической протеазы (например, клостридиальной L-цепи) из внутриклеточных везикул в цитоплазму клетки-мишени и, таким образом, участвовать в осуществлении общего клеточного механизма, посредством которого клостридиальный токсин протеолитически расщепляет субстрат. Области H_N из тяжелых цепей клостридиальных токсинов составляют приблизительно 410-430 аминокислот в длину и включают домен транслокации. Исследования показали, что вся длина области H_N тяжелой цепи клостридиального токсина не является необходимой для транслокационной активности домена транслокации. Таким образом, аспекты этого варианта осуществления могут включать области HN клостридиального токсина, содержащие домен транслокации, имеющий длину, например, по меньшей мере 350 аминокислот, по меньшей мере 375 аминокислот, по меньшей мере 400 аминокислот и по меньшей мере 425 аминокислот. Другие аспекты этого варианта осуществления могут включать области H_N клостридиального токсина, содержащие домен транслокации, имеющий длину, например, не более 350 аминокислот, не более 375 аминокислот, не более 400 аминокислот и не более 425 аминокислот.

Для более подробной информации о генетической основе продуцирования токсина в Clostridium botulinum и C. tetani авторы изобретения ссылаются на статью Henderson et al (1997) in The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic press. Термин H_N охватывает природные части нейротоксина H_N и модифицированные части H_N, которые имеют аминокислотные последовательности, которые не встречаются в природе, и/или синтетические аминокислотные остатки, при условии, что модифицированные части H_N все еще проявляют вышеуказанную функцию транслокации.

Альтернативно, домен транслокации может быть не клостридиального происхождения. Примеры доменов транслокации не клостридиального происхождения (эталонные) включают, но не ограничиваются ими, домен транслокации дифтерийного токсина [O’Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 6202-6206; Silverman et al., J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532; and London, E. (1992) Biochem. Biophys. Acta., 1112, pp.25-51], домен транслокации экзотоксина Pseudomonas типа A [Prior et al. Biochemistry (1992) 31, 3555-3559], домены транслокации токсина сибирской язвы [Blanke et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 8437-8442], разнообразные фузогенные или гидрофобные пептиды с транслокационной функцией [Plank et al. J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924; and Wagner et al (1992) PNAS, 89, pp.7934-7938], и амфифильные пептиды [Murata et al (1992) Biochem., 31, pp.1986-1992]. Домен транслокации может дублировать домен транслокации, присутствующий в природном белке, или может содержать аминокислотные вариации такой длины, чтобы эти вариации не нарушали транслокационную способность домена транслокации.

Конкретные примеры вирусных (эталонных) доменов транслокации, подходящих для использования по настоящему изобретению, включают некоторые транслоцирующие домены экспрессируемых в вирусах мембранных слитых белков. Например, в статьях Wagner et al. (1992) и Murata et al. (1992) описана функция транслокации (то есть слияния мембран и везикуляции) ряда фузогенных и амфифильных пептидов, происходящих из N-концевой области гемагглютинина вируса гриппа. Другие экспрессируемые в вирусах мембранные слитые белки, которые, как известно, имеют нужную транслокационную активность, представляют собой транслоцирующий домен фузогенного пептида вируса леса Семлики (SFV), транслоцирующий домен гликопротеина G вируса везикулярного стоматита (VSV), транслоцирующий домен F-белка вируса SER и транслоцирующий домен гликопротеина оболочки вируса пенистости обезьян. Кодируемые вирусами белки Aspike имеют конкретное применение в контексте настоящего изобретения, например, белок E1 SFV и белок G VSV.

Использование (эталонных) доменов транслокации включает использование их вариантов последовательностей. Вариант может содержать одну или более консервативных нуклеотидных замен и/или нуклеотидных делеций или вставок при условии, что вариант обладает необходимой транслокационной функцией. Вариант может также содержать одну или более аминокислотных замен и/или аминокислотных делеций или вставок при условии, что вариант обладает необходимой транслокационной функцией.

Полипептиды по настоящему изобретению могут дополнительно содержать домен, способствующий транслокации. Указанный домен облегчает доставку нецитотоксической протеазы в цитозоль клетки-мишени и описан, например, в 08/008803 и WO 08/008805, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки.

В качестве примера подходящие домены, способствующие транслокации, включают домен фузогенного пептида оболочки вируса, например, подходящие домены фузогенного пептида включают домен фузогенного пептида вируса гриппа (например, домен фузогенного пептида вируса гриппа A из 23 аминокислот), домен фузогенного пептида альфавируса (например, домен фузогенного пептида вируса леса Семлики из 26 аминокислот), домен фузогенного пептида везикуловируса (например, домен фузогенного пептида вируса везикулярного стоматита из 21 аминокислоты), домен фузогенного пептида респировируса (например, домен фузогенного пептида вируса Сендай из 25 аминокислот), домен фузогенного пептида морбилливируса (например, домен фузогенного пептида вируса собачьей чумы из 25 аминокислот), домен фузогенного пептида авулавируса (например, домен фузогенного пептида вируса псевдочумы птиц из 25 аминокислот), домен фузогенного пептида хенипавируса (например, домен фузогенного пептида вируса Хендра из 25 аминокислот), домен фузогенного пептида метапневмовируса (например, домен фузогенного пептида метапневмовируса человека из 25 аминокислот) или домен фузогенного пептида спумавируса, такой как домен фузогенного пептида вируса пенистости обезьян; или их фрагменты или варианты.

В качестве дополнительного примера, домен, способствующий транслокации, может содержать домен H_CN клостридиального токсина или его фрагмент или вариант. Более подробно, домен, способствующий транслокации H_CN клостридиального токсина, может иметь длину по меньшей мере 200 аминокислот, по меньшей мере 225 аминокислот, по меньшей мере 250 аминокислот, по меньшей мере 275 аминокислот. В этом отношении домен, способствующий транслокации H_CN клостридиального токсина, предпочтительно имеет длину не более 200 аминокислот, не более 225 аминокислот, не более 250 аминокислот или не более 275 аминокислот. Конкретные (эталонные) примеры включают:

Ботулинический нейротоксин типа A - аминокислотные остатки (872-1110)

Ботулинический нейротоксин типа B - аминокислотные остатки (859-1097)

Ботулинический нейротоксин типа C - аминокислотные остатки (867-1111)

Ботулинический нейротоксин типа D - аминокислотные остатки (863-1098)

Ботулинический нейротоксин типа E - аминокислотные остатки (846-1085)

Ботулинический нейротоксин типа F - аминокислотные остатки (865-1105)

Ботулинический нейротоксин типа G - аминокислотные остатки (864-1105)

Cтолбнячный нейротоксин - аминокислотные остатки (880-1127)

Вышеупомянутые положения последовательности могут немного отличаться в зависимости от серотипа/подтипа, и дополнительные примеры подходящих (эталонных) доменов H_CN клостридиального токсина включают:

Ботулинический нейротоксин типа A - аминокислотные остатки (874-1110)

Ботулинический нейротоксин типа B - аминокислотные остатки (861-1097)

Ботулинический нейротоксин типа C - аминокислотные остатки (869-1111)

Ботулинический нейротоксин типа D - аминокислотные остатки (865-1098)

Ботулинический нейротоксин типа E - аминокислотные остатки (848-1085)

Ботулинический нейротоксин типа F - аминокислотные остатки (867-1105)

Ботулинический нейротоксин типа G - аминокислотные остатки (866-1105)

Cтолбнячный нейротоксин - аминокислотные остатки (882-1127)

Любой из описанных выше способствующих доменов можно объединять с любым из ранее описанных пептидов домена транслокации, которые подходят для использования в настоящем изобретении. Таким образом, например, неклостридиальный облегчающий домен может быть объединен с пептидом неклостридиального домена транслокации или с пептидом клостридиального домена транслокации. Альтернативно, домен, способствующий транслокации H_CN клостридиального токсина, можно объединять с пептидом неклостридиального домена транслокации. Альтернативно, домен, способствующий H_CN клостридиального токсина, можно объединять или с пептидом клостридиального домена транслокации, примеры которого включают:

Ботулинический нейротоксин типа A - аминокислотные остатки (449-1110)

Ботулинический нейротоксин типа B - аминокислотные остатки (442-1097)

Ботулинический нейротоксин типа C - аминокислотные остатки (450-1111)

Ботулинический нейротоксин типа D - аминокислотные остатки (446-1098)

Ботулинический нейротоксин типа E - аминокислотные остатки (423-1085)

Ботулинический нейротоксин типа F - аминокислотные остатки (440-1105)

Ботулинический нейротоксин типа G - аминокислотные остатки (447-1105)

Cтолбнячный нейротоксин - аминокислотные остатки (458-1127)

В качестве примера, типичные последовательности нацеливающего фрагмента (эталонные) включают:

Ботулинический нейротоксин типа A - аминокислотные остатки (Y1111-L1296)

Ботулинический нейротоксин типа B - аминокислотные остатки (Y1098-E1291)

Ботулинический нейротоксин типа C - аминокислотные остатки (Y1112-E1291)

Ботулинический нейротоксин типа D - аминокислотные остатки (Y1099-E1276)

Ботулинический нейротоксин типа E - аминокислотные остатки (Y1086-K1252)

Ботулинический нейротоксин типа F - аминокислотные остатки (Y1106-E1274)

Ботулинический нейротоксин типа G - аминокислотные остатки (Y1106-E1297)

Cтолбнячный нейротоксин - аминокислотные остатки (Y1128-D1315).

Нецитотоксическую протеазу можно вводить в дозе 1-100 ед/кг пациента, предпочтительно в дозе 10-50 ед/кг пациента.

Например, нецитотоксическую протеазу может вводить в дозе одной или нескольких, выбранных из 5 ед/кг, 10 ед/кг, 20 ед/кг или 40 ед/кг (предпочтительно 40 ед/кг).

В одном варианте осуществления, нецитотоксическую протеазу вводят в виде однократной дозы в течение периода по меньшей мере 2 месяцев, предпочтительно в течение периода по меньшей мере 3 месяцев.

Гомология последовательностей

Для определения процента идентичности можно использовать любой из множества методов выравнивания последовательностей, включая, без ограничения, глобальные методы, локальные методы и гибридные методы, такие как, например, методы сегментного подхода. Протоколы для определения процента идентичности являются обычными процедурами в пределах компетенции специалиста в данной области. Глобальные методы выравнивают последовательности от начала до конца молекулы и определяют наилучшее выравнивание путем сложения десятков отдельных пар остатков и наложения штрафов за разрыв. Неограничивающие методы включают, например, CLUSTAL W, см., например, Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994); и итеративное уточнение, см., например, Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. MoI. Biol. 823-838 (1996). Локальные методы выравнивают последовательности путем идентификации одного или нескольких консервативных мотивов, общих для всех входных последовательностей. Неограничивающие методы включают, например, Match-box, см., например, Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992); семплирование по Гиббсу, см., например, C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131 ) Science 208-214 (1993); Align-M, see, e.g., Ivo Van WaIIe et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004).

Таким образом, процент идентичности последовательностей определяют обычными методами. См., например, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986 and Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992. Вкратце, две аминокислотные последовательности выравнивают для оптимизации оценок выравнивания с использованием штрафа за открытие гэпа, равного 10, штрафа за продление гэпа, равного 1, и матрицы весовых оценок замен «blosum 62» Henikoff and Henikoff (там же), как показано ниже (аминокислоты обозначаются стандартными однобуквенными кодами).

«Процент идентичности последовательностей» между двумя или более последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот является функцией количества идентичных положений, общих для последовательностей. Таким образом, % идентичности можно рассчитать как количество идентичных нуклеотидов/аминокислот, деленное на общее количество нуклеотидов/аминокислот, умноженное на 100. При расчетах % идентичности последовательностей также можно учитывать количество гэпов и длину каждого гэпа, который необходимо ввести для оптимизации выравнивания двух или более последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя или более последовательностями может быть выполнено с использованием определенных математических алгоритмов, таких как BLAST, которые будут знакомы квалифицированному специалисту.

Практически гомологичные полипептиды характеризуются наличием одной или нескольких аминокислотных замен, делеций или добавлений. Эти изменения предпочтительно носят незначительный характер, то есть консервативные аминокислотные замены (см. ниже) и другие замены, которые существенно не влияют на укладку или активность полипептида; небольшие делеции, обычно от одной до примерно 30 аминокислот; и небольшие удлинения на амино- или карбокси-концевом участке, такие как амино-концевой метиониновый остаток, небольшой линкерный пептид примерно до 20-25 остатков или аффинная метка.

Консервативные аминокислотные замены

Базовые:

аргинин

лизин

гистидин

Кислые: глутаминовая кислота

аспарагиновая кислота

Полярные: глутамин

аспарагин

Гидрофобные: лейцин

изолейцин

валин

Ароматические: фенилаланин

триптофан

тирозин

Небольшие: глицин

аланин

серин

треонин

метионин.

В дополнение к 20 стандартным аминокислотам нестандартные аминокислоты (такие как 4-гидроксипролин, 6-N-метиллизин, 2-аминоизомасляная кислота, изовалин и α-метилсерин) можно заменить на аминокислотные остатки полипептидов по настоящему изобретению. Ограниченное количество неконсервативных аминокислот, аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом, и неприродных аминокислот можно заменить на аминокислотные остатки полипептида. Полипептиды по настоящему изобретению могут также содержать не встречающиеся в природе аминокислотные остатки.

Ограниченное количество неконсервативных аминокислот, аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом, аминокислот, не встречающихся в природе, и неприродных аминокислот, можно заменить на аминокислотные остатки полипептидов по настоящему изобретению.

Незаменимые аминокислоты в полипептидах по настоящему изобретению могут быть идентифицированы в соответствии со способами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989). Сайты биологического взаимодействия также могут быть определены с помощью физического анализа структуры, что определяется такими способами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, дифракция электронов или фотоаффинное мечение, в сочетании с предполагаемым контактирующим сайтом аминокислот. См., например, de Vos et al., Science 255:306-12, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Идентичность незаменимых аминокислот также может быть выведена из анализа гомологии со связанными компонентами (например, компонентами транслокации или протеазы) полипептидов по настоящему изобретению.

Множественные аминокислотные замены могут быть сделаны и протестированы с использованием известных методов мутагенеза и скрининга, таких как раскрытые Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988) или Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989). Вкратце, эти авторы описывают способы одновременной рандомизации двух или более положений в полипептиде, отбора функционального полипептида и последующего секвенирования мутагенизированных полипептидов для определения спектра допустимых замен в каждом положении. Другие способы, которые могут быть использованы, включают в себя способ фагового дисплея (например, Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991; Ladner et al., патент США No. 5223409; Huse, публикация WIPO WO 92/06204) и область-направленный мутагенез (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988).

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в области, к которой относится это раскрытие. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994), and Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) предоставляет квалифицированному специалисту общий словарь многих терминов, используемых в этом раскрытии.

Это раскрытие не ограничено примерными способами и материалами, описанными в настоящем документе, и любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, могут использоваться на практике или при тестировании вариантов осуществления настоящего раскрытия. Область числовых значений включают числа, определяющие диапазон. Если не указано иное, любые последовательности нуклеиновых кислот записываются слева направо в ориентации от 5' к 3'; аминокислотные последовательности записываются слева направо в направлении от амино-к карбокси-концу, соответственно.

Заголовки, приведенные в настоящем документе, не являются ограничениями различных аспектов или вариантов осуществления настоящего раскрытия.

В настоящем описании аминокислоты упоминаются с использованием названия аминокислоты, трехбуквенного сокращения или однобуквенного сокращения. Термин «белок», используемый в настоящем описании, включает белки, полипептиды и пептиды. Используемый в настоящем описании термин «аминокислотная последовательность» является синонимом термина «полипептид» и/или термина «белок». В некоторых случаях термин «аминокислотная последовательность» является синонимом термина «пептид». В некоторых случаях термин «аминокислотная последовательность» является синонимом термина «фермент». Термины «белок» и «полипептид» используются в настоящем описании взаимозаменяемо. В настоящем описании и формуле изобретения могут использоваться обычные однобуквенные и трехбуквенные коды для аминокислотных остатков. Трехбуквенный код для аминокислот, определенный в соответствии с IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN). Также понятно, что полипептид может кодироваться более чем одной нуклеотидной последовательностью вследствие вырожденности генетического кода.

Другие определения терминов могут встречаться в описании. Прежде чем примерные варианты осуществления будут описаны более подробно, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными описанными вариантами осуществления, поскольку таковые могут, конечно, варьироваться. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения будет определяться только прилагаемой формулой изобретения.

Если предоставляется диапазон значений, подразумевается, что каждое промежуточное значение, вплоть до десятой единицы нижнего предела, если контекст явно не диктует иное, между верхним и нижним пределами этого диапазона также конкретно раскрывается. Каждый небольшой диапазон между любым заявленным значением или промежуточным значением в указанном диапазоне и любым другим заявленным или промежуточным значением в этом указанном диапазоне охватывается этим раскрытием. Верхние и нижние пределы этих небольших диапазонов могут независимо включаться или исключаться в диапазон, и каждый диапазон, в котором либо один, либо оба предела включены в небольшие диапазоны, также охватывается настоящим изобретением с учетом любого специально исключенного предела в указанном диапазоне. Если указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие один или оба из этих включенных пределов, также включены в настоящее раскрытие.

Следует отметить, что используемые в настоящем описании и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылки во множественном числе, если контекст явно не диктует иное. Таким образом, например, ссылка на «токсин» включает множество таких токсинов, а ссылка на «токсин» включает ссылку на один или несколько токсинов и их эквивалентов, известных специалистам в данной области, и тому подобное.

Публикации, обсуждаемые в настоящем документе, предназначены исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто представленное в настоящем документе не должно рассматриваться как предположение о том, что настоящее изобретение не имеет право на предвосхищение такого материала в силу предшествующего изобретения.

Краткое описание фигур

Варианты осуществления изобретения теперь будут описаны только в качестве примера со ссылкой на следующие фигуры и примеры.

На фиг. 1 показано исследование дозовой кривой протеазы BoNT/A (Dysport® 10-40 Ед/кг), демонстрирующее эффект однократного внутриподошвенного введения протеазы BoNT/A по оценке на крысиной модели MRMT-1 индуцированной боли при раке костей.

На фиг. 2 и 3 показаны сравнительные исследования, показывающие эффект однократного введения морфина по оценке на крысиной модели MRMT-1 индуцированной боли при раке костей.

На фиг.4 показан процесс интоксикации нецитотоксической протеазой, который можно описать как включающий четыре стадии: 1) связывание нецитотоксической протеазы через связывающий домен (например, через HC клостридиального нейротоксина или эквивалентную нацеливающий фрагмент) с сайтом связывания, присутствующим на поверхности клетки; 2) сайт связывания (плюс связанная нецитотоксическая протеаза) интернализуется в клетку 3) высвобождение эффектов нецитотоксической протеазы (например, через HN клостридиального нейротоксина или эквивалентного домена транслокации) из эндосомы в цитозоль (то есть событие транслокации) 4) высвобожденная нецитотоксическая протеаза (например, L-цепь клостридиального нейротоксина или эквивалентная протеаза, расщепляющая SNARE) может затем действовать на свою внутриклеточную (белок SNARE) цель.

Примеры

Далее изобретение будет описано только в качестве примера со ссылкой на следующие примеры.

Материалы и способы

Модель боли при раке костей у крыс с клетками карциномы молочной железы MRMT-1 (Medhurst S.J., et al., “A rat model of bone cancer”, Pain, 2002: pp.129-140) представляет собой хорошо охарактеризованную модель на животных для фармацевтического тестирования боли при раке. Эта модель является широко принятой, поскольку она имитирует аспекты патогенеза и патологии в период времени, совместимый с доклиническими исследованиями боли.

Животные и условия содержания

Для этих исследований были отобраны шестьдесят (60) самцов крыс Sprague-Dawley (SPF status, Janvier, France), массой 175-200 г во время операции.

Крыс содержали в помещении с контролируемой температурой (20-24°C) и относительной влажностью (45%-65%) и акклиматизировали к искусственному циклу день/ночь, состоящему из 12 часов света (с 6:30 до 18:30)/12 часов темноты. Крысы имели свободный доступ к водопроводной воде и получали без ограничений полноценный гранулированный корм. Животных размещали по 4 в каждой клетке (клетки типа E) и акклиматизировали в течение не менее 5 дней перед любым тестированием. Каждую крысу идентифицировали по маркировке на хвосте.

Реагенты

Подробности использования нецитотоксической протеазы (BoNT/A Dysport ®) приведены в таблице 1.

Таблица 1

Нецитотоксическая протеаза	BoNT/A Dysport ®
Партия N°/ Ipsen Bioinnovation Ltd	K02459
Соотношение образовал соль/ не образовал соль	1,00
Количество/флакон	500 Ед
Описание	Лиофилизат
Условия хранения	+4°C (раствор); -20°C (Лиофилизат)
Специфический протокол формулировки	Раствор в 0,9% NaCl

Подробная информация об эталонном веществе (морфине) приведена в таблице 2 ниже.

Таблица 2

Идентификатор эталонного вещества	Морфин
Поставщик	Francopia
Ссылка в каталоге	3695
Партия N°	IR00002
Соотношение образовал соль/ не образовал соль	1,13
Условия хранения	Комнатная температура

Подробная информация об используемом носителе (например, для контрольных экспериментов только носитель) представлена в таблице 3 ниже.

Таблица 3

Идентификатор носителя	0,9% NaCl
Источник	Aguettant
Ссылка в каталоге	069808
Условия хранения	+4°C

0-9% NaCl, используемый в качестве носителя для нецитотоксической протеазы и для раствора морфина.

Подробная информация о клетках MRMT-1 и HBSS приведена в таблице 4 ниже.

Основное оборудование и система обработки данных

Электронный прибор фон Фрея (модель EVF3, Bioseb, France)) использовали в тестах на боль (например, для оценки тактильной аллодинии).

Анализ (например, статистический анализ) проводили с использованием следующих средств:

- Программное обеспечение SigmaStat version 3.5 (SPSS Science Software, Erkrath, Germany).

- Программное обеспечение Lab X direct version 2.4 (Mettler Toledo, France).

- Программное обеспечение Dragon Naturally Speaking version 13.0 (Nuance, France).

Болевой тест

Тактильную аллодинию оценивали с помощью электронного теста фон Фрея. Этот тест предполагает приложение повышающегося давления на подошвенную часть задних лап. Тест проводили на животных с одной задней лапой, воспаленной в результате инъекции или травмированной, и одной нормальной задней лапой, для оценки лекарственных средств в отношении анальгетического действия. Устройство прилагает постоянно увеличивающуюся силу, и пороги чувствительности определяют как давление (г), необходимое для того, чтобы вызвать отдергивание лапы. Каждое измерение порога чувствительности повторяли трижды для обеих задних лап с интервалами приблизительно 2-3 мин.

Схема эксперимента

Использовали шесть (6) групп по 10 крыс.

Группа 1: HBSS, интра-большеберцовой, раствор

+ 0,9% NaCl,

внутриподошвенное, раствор

Группа 2: 30000 MRMT-1 клеток в HBSS, интра-большеберцовой, раствор

+ 0,9% NaCl, внутриподошвенное, раствор

Группа 3: клетки 30000 MRMT-1 в HBSS, интра-большеберцовой, раствор

+ BoNT/A (Dysport 5 Ед/кг) в 0.9% NaCl, внутриподошвенное, раствор

Группа 4: 30000 MRMT-1 клеток в HBSS, интра-большеберцовой, раствор

+ BoNT/A (Dysport 10 Ед/кг) в 0.9% NaCl, внутриподошвенное, раствор

Группа 5: 30000 MRMT-1 клеток в HBSS, интра-большеберцовой, раствор

+ BoNT/A (Dysport 20 Ед/кг) в 0.9% NaCl, внутриподошвенное, раствор

Группа 6: 30000 MRMT-1 клеток в HBSS, интра-большеберцовой, раствор

+ BoNT/A (Dysport 40 Ед/кг) в 0.9% NaCl, внутриподошвенное, раствор

Группа 7: 30000 MRMT-1 клеток в HBSS, интра-большеберцовой, раствор

+ морфин HCl, 3 мг/кг в 0.9% NaCl, п/к, раствор

Дозы выражены в пересчете на свободное активное вещество.

Носитель и протеазу BoNT/A (Dysport) вводили внутриподошвенным путем в поврежденную заднюю лапу в объеме 70 мкл/кг с помощью иглы 30 G.

Морфин вводили подкожно в дозе 5 мл/кг.

Хирургическая процедура

Боль при раке костей индуцировали имплантацией 30000 клеток карциномы молочной железы MRMT-1 в медуллярную полость большеберцовой кости анестезированным крысам (ксилазин 10 мг/кг внутрибрюшинно, кетамин 60 мг/кг внутрибрюшинно) на Д0.

На коже над проксимальной половиной левой большеберцовой кости делали разрез в ростро-каудальном направлении длиной 1 см, чтобы обнажить кость с минимальным повреждением окружающих мышц или кровеносных сосудов. С помощью иглы 21 калибра проткнули кость и вставили тонкий катетер со шприцем Гамильтона, позволяя ему достичь интрамедуллярного канала большеберцовой кости. Затем осторожно вводили 10 мкл суспензии клеток (группа рака) или HBSS (группа плацебо). Место инъекции закрыли костным воском и хирургическим клеем, тщательно промыли 0,9% NaCl, и рану закрыли хирургическим швом.

Тестирование поведения

Через одиннадцать дней после имплантации раковых клеток (Д11) пороги отдергивания двух задних лап были измерены (исходный уровень) во всех группах.

Крысы из групп от 1 до 6 получали носитель или протеазу BoNT/A (Dysport®) путем внутриподошвенной инъекции в левую травмированную лапу под газовой анестезией (3,5% изофлуран/3 л/мин) с помощью иглы 30 G.

Морфин вводили подкожно на Д14 и на Д21.

Крыс умерщвляли в конце эксперимента путем ингаляции CO2 до последующего удаления сертифицированной компанией.

Масса тела

Крыс взвешивали каждый день (кроме субботы и воскресенья) от операции до Д10 и в каждый экспериментальный день перед тестированием.

Представление данных и статистический анализ

Результаты были выражены как (для каждого животного):

• Порог отдергивания лапы, определяемый как давление в граммах (г), прикладываемое к каждой задней лапе, и вычисляемый как среднее значение трех последовательных измерений для каждой задней лапы.

Для каждой группы лечения,

• Порог отдергивания лапы (среднее ± s.e.m. (стандартная ошибка среднего)), рассчитанный как среднее значение для животных

• Процент отклонения порога отдергивания лапы, рассчитанный на основе среднего значения для группы, получившей лечение носителем.

Для определения статистического эффекта тестируемого вещества и эталонного вещества данные анализировали с помощью параметрического или непараметрического критерия в зависимости от нормального распределения результатов. Критический уровень значимости был установлен на уровне p<0,05.

Растворение лиофилизата

Протеаза BoNT/A (Dysport®) кондиционировали во флаконе в форме лиофилизата в количестве 500 Ед для используемой партии.

Лиофилизат растворяли в соответствующем объеме 0,9% NaCl для получения маточного раствора при 500 Ед/мл:

- наполняли шприц с иглой 25G или 26G, пересекая перегородку посередине, и вводили 1 мл, избегая образования пузырей,

- шприц быстро удаляли с иглой, чтобы избежать вакуумного всасывания,

- после того как токсин был в растворе, можно было открыть флакон, чтобы добавить или нет, точно, с помощью автоматической пипетки объем для получения раствора 500 ед/мл.

Этот раствор использовали в качестве исходного раствора и хранили при температуре +4°C в течение 24 часов.

Разбавления

Контейнеры, используемые для разведения, были стеклянными, и серийных разведений можно будет избежать.

В конце каждого дня тестирования оставшийся раствор BoNT/A (Dysport®) дезактивировали, используя 0,5% хлорактивный раствор гипохлората натрия. В конце экспериментальной фазы в оставшийся исходный раствор BoNT/A (Dysport®) добавляли 0,5% хлор-активный раствор гипохлората натрия.

Для того чтобы обеспечить объем около 20 мкл/крысу, следующие растворы получали в концентрации, представленной ниже. Остальные растворы получали аналогично:

Таблица 5

Доза	Концентрация раствора	Объем введения
10 Ед/кг	150 Ед/мл	70 мкл/кг
20 Ед/кг	300 Ед/мл	70 мкл/кг
30 Ед/кг	450 Ед/мл	70 мкл/кг

Пример 1

Исследование дозозависимой кривой протеазы BoNT/A (Dysport® при 10-40 ед/кг)

Оценивали эффект однократного внутриподошвенного введения протеазы BoNT/A (Dysport ®) на крысиной модели MRMT-1 индуцированной боли при раке костей - см. фиг. 1. Острое внутриподошвенное введение протеазы BoNT/A (Dysport®) приводило к дозозависимому и зависящему от времени реверсированию дефицита в пороге отдергивания лапы, тем самым уменьшая аллодинию, вызванную раком кости.

Пример 2

Сравнительные исследования морфина

В сравнительных исследованиях эффект однократного введения морфина оценивали на той же крысиной модели MRMT-1 индуцированной боли при раке костей. Морфин вводили в Д14 (см. фиг. 2) или Д21 (см. фиг. 3) после имплантации раковых клеток. Результаты демонстрируют изменение дефицита в пороге отдергивания лапы, тем самым демонстрируя снижение аллодинии, вызванной раком кости.

Эти результаты дополняют результаты, полученные для нецитотоксической протеазы (BoNT/A), показанные в Примере 1, демонстрируя, что анальгетическое вещество (например, опиат, такой как морфин) может быть введено совместно с нецитотоксической протеазой для обеспечения синергического подавления кость-индуцированной аллодинии.

Пример 3

Сравнительные исследования массы тела крыс

Соответствующую массу тела крысы контролировали в исследованиях, сравнительных с примером 1, хотя и с использованием немного разных дозировок протеазы BoNT/A (Dysport®). Эффект однократного местного введения протеазы BoNT/A (Dysport®) оценивали на той же крысиной модели MRMT-1 индуцированной боли при раке костей. Массу тела (таблица 6) оценивали после введения протеазы BoNT/A, соответствующей Д₁₁-Д₂₁, после имплантации раковых клеток.

Таблица 6.

Масса тела (г)
Группы	Д11	Д12	Д14	Д18/Д19	Д21
HBSS/носитель	297	302	320	358	370
MRMT-1/носитель	322	325	345	387	403
MRMT-1/BoNT/A (Dysport 10 Ед/кг)	330	334	353	385	402
MRMT-1/BoNT/A (Dysport 20 Ед/кг)	313	318	334	361	367
MRMT-1/BoNT/A (Dysport 30 Ед/кг)	324	329	343	364	376

Результаты выражены в виде среднего ± s.e.m.

1. Применение ботулинического нейротоксина для подавления аллодинии, вызванной раком кости, у пациента, страдающего раком кости, где ботулинический нейротоксин вводят в дозе 10-40 Ед/кг пациента.

2. Применение по п. 1, где рак кости представляет собой метастатический рак кости.

3. Применение по любому из предшествующих пунктов, где пациент имеет дополнительный рак, предпочтительно, где дополнительный рак представляет собой один или несколько, выбранных из рака легкого, рака молочной железы, рака предстательной железы и рака яичников.

4. Применение по любому из предшествующих пунктов для синергетического подавления аллодинии, вызванной раком кости, у пациента, включающее совместное введение анальгетического вещества, предпочтительно, опиата, такого как морфин; и где указанное анальгетическое вещество вводят до, одновременно или после нецитотоксической протеазы.

5. Применение по п. 4, где анальгетическое вещество вводят в количестве, которое, при введении в отсутствие ботулинического нейротоксина, не подавляет аллодинию, вызванную раком кости, у пациента.

6. Применение по п. 4 или 5, где аллодиния состоит из или включает тактильную аллодинию и/или динамическую аллодинию.

7. Применение по любому из пп. 4-6, где введение ботулинического нейротоксина осуществляют в участок, выбранный из структурно поврежденной кости, раздражения надкостницы, защемления нерва и/или другой поврежденной области.

8. Применение по п. 7, где введение осуществляют проксимально к локальной концентрации раковых клеток костей или непосредственно в раковые клетки костей или в их соединительную ткань.

9. Применение по любому из предшествующих пунктов, где ботулинический нейротоксин представляет собой ботулинический нейротоксин, предпочтительно BoNT/A.

10. Применение по любому из предшествующих пунктов, где ботулинический нейротоксин вводят в виде однократной дозы введения в течение периода по меньшей мере 2 месяцев, предпочтительно в течение периода по меньшей мере 3 месяцев.