Способ измерения подавления бактерий антибактериальными средствами, устройство для подсчета бактерий и способ подсчета

Группа изобретений относится к биотехнологии и микробиологии. Предложены способ измерения подавления бактерий антибактериальными средствами, устройство для подсчета бактерий и способ подсчета бактерий, основанный на детектировании наличия импульсного сигнала модуля счетной ячейки, с использованием заявленного устройства. Способ измерения подавления бактерий включает добавление антибактериального средства к бактериям, подлежащим определению, устанавливая это как смесь бактерий и препарата; при этом устанавливая подлежащие определению бактерии без антибактериального средства в качестве положительного контроля; по истечении первого заданного срока с момента добавления антибактериального средства – определение текущего количества бактерий в смеси бактерий и препарата и текущего количества бактерий в положительном контроле; определение того, что антибактериальное средство в заданной концентрации подавляет, частично подавляет или не подавляет бактерии, исходя из соотношения текущего количества бактерий в смеси бактерий и препарата к текущему количеству бактерий в положительном контроле. Устройство для подсчета бактерий включает модуль счетной ячейки, неподвижно соединенный с модулем отбора проб, и систему управления схемой для определения количества бактерий в образце. Изобретения обеспечивают расширение арсенала способов и устройств для тестирования бактерий на лекарственную чувствительность. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 18 ил., 12 табл., 4 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области биофармацевтики, в частности, оно касается способа измерения подавления бактерий антибактериальными средствами, устройства для подсчета бактерий и способа подсчета.

Уровень техники

Проблема лекарственной устойчивости у бактерий становится все более серьезной, она быстро и широко распространяется по всему миру, привлекая внимание правительств всех стран, также и в Китае было принято большое количество нормативных актов. Важнейшей задачей в борьбе с лекарственной устойчивостью бактерий является правильное использование антибиотиков, а главным приоритетом – быстрое тестирование на чувствительность к антибиотикам.

С развитием масс-спектрометрии и технологии нуклеиновых кислот в основном была достигнута быстрая идентификация бактерий (результаты выдаются в тот же день и совершаются в пределах 1-2 часов), поэтому более актуальной и имеющей практическое значение является разработка новых экспресс-тестов на чувствительность к антибиотикам. Краеугольным камнем работы с антибиотиками является как можно быстрый переход от эмпирической терапии антибиотиками широкого спектра действия к адресной терапии, но клиническую практику ограничивают текущие сроки представления результатов тестирования на лекарственную чувствительность. Поскольку сроки представления результатов при обычных ручных методах слишком велики, то в текущей клинической практике в основном применяются полностью автоматизированные методы тестирования лекарственной чувствительности, из которых самыми быстрыми системами определения являются система VITEK фирмы BioMérieux (Франция) и система Phoenix фирмы BD (США). Хотя надежность и точность этих двух систем была доказана, однако средние сроки представления результатов составляют 12,1 ч для Phoenix и 9,8 ч для Vitek2, что не дает возможности врачам выбрать целевое лекарство раньше следующего дня с учетом ежедневного рабочего процесса и расписания.

В настоящее время, чтобы сократить сроки получения результатов о тестировании на чувствительность к противомикробным препаратам (AST), в стране и за рубежом проводились различные исследования и разрабатывались различные методы, такие как метод масс-спектрометрии, метод проточной цитометрии, метод взвешивания микробных клеток на основе осциллирующего кантилевера, метод изотермической микрокалориметрии, метод вращения магнитных шариков, метод определения микрожидкостных капель, метод ПЦР в реальном времени, метод микроматриц, метод проводимости, метод поверхностного плазмонного резонанса, метод секвенирования РНК, бактериофаговый метод, метод микроскопии в реальном времени и метод микрокосмических звуковых волн. Однако эти технологии все еще находятся на стадии исследования и только для анализа небольших образцов, причем все они требуют управления профессиональными специалистами. Кроме того, дорогое оборудование, нестандартное и специализированное, отличается сложностью работы, нестабильными показателями, высокой стоимостью и неудобствами в применении. Поэтому трудно судить об их практической перспективе.

Быстрое тестирование лекарственной чувствительности проводится методами двух типов: фенотипическими методами и нефенотипическими методами. Нефенотипические методы – в основном это методы молекулярной биологии на основе нуклеиновых кислот, такие как метод ПЦР в реальном времени, методы микроматриц, методы секвенирования РНК, транскриптомное и полногеномное секвенирование и т.д. Их преимущества включают: 1) короткое время, например, можно выявлять гены множественной лекарственной устойчивости при мультиплексной ПЦР положительных культур крови; 2) можно проводить количественный анализ методом цифровой ПЦР; 3) можно выяснить механизм соответствующей лекарственной устойчивости. К недостаткам относятся: 1) сложность механизма резистентности бактерий может привести к большой рабочей нагрузке, которая влияет на экономичность и быстроту при применении в клинической практике; 2) требуется большой объем проверки на соответствие между результатами тестирования генов лекарственной устойчивости и их фенотипом вследствие генетической гетерогенности; 3) невозможно обнаружить новые механизмы лекарственной устойчивости, тогда как в клинической практике настоятельно требуется выявление новых механизмов лекарственной устойчивости; 4) эти методы, поскольку они пока незрелые, еще не применялись в клинической практике, и требуется дальнейшее клиническое наблюдение, чтобы их можно было применять в клинической практике после стандартизации и признания экспертами во всем мире.

При фенотипическом тестировании на лекарственную чувствительность непосредственно наблюдают реакцию бактерий на препарат in vitro, а также можно непосредственно отслеживать чувствительность и толерантность бактерий к антибиотикам. Традиционные фенотипические тесты на лекарственную чувствительность были полностью разработаны, валидированы, проверены и хорошо себя зарекомендовали в клинической практике, они и стали эталоном для методов тестирования лекарственной чувствительности. “Промежуточные методы”, т.е. разработанные на основе традиционных методов культивирования, ранее могли выполняться с высокой надежностью, тем самым порождая надежды до того, как будут усовершенствованы и окончательно установлены генетически обоснованные нефенотипические тесты на лекарственную чувствительность.

Кроме того, в большинстве тестов на лекарственную чувствительность применяются счетчики клеток. Счетчик клеток обычно означает прибор, который измеряет количество тромбоцитов, лейкоцитов, эритроцитовы и т.д. Широко применяются полностью автоматизированные счетчики клеток, а принцип Коултера для анализа частиц всегда был признан во всем мире как стандартный метод контроля для измерения размера клеток и частиц и всегда играл важную роль в гематологическом анализе.

В предшествующих устройствах и методах подсчета бактерий существуют следующие проблемы: 1) на рынке еще нет устройств, в которых применяется метод подсчета по сопротивлению для измерения количества бактерий; 2) диаметр отверстия в существующих счетчиках клеток подходит для измерения крупных клеток типа эритроцитов и лейкоцитов, гарантируя, что клетки могут проходить через отверстие одна за другой; а бактерии имеют небольшие размеры и не могут проходить через отверстие одна за другой, поэтому количество измеряемых бактерий, проходящих через отверстие в одно и то же время, может быть больше или равно 2, что приводит к неточности подсчета; 3) при измерении эритроцитов или лейкоцитов отверстие менее 50 мкм может вызвать засорение отверстия в существующих приборах, поэтому диаметр отверстия в предшествующих счетчиках должен быть более 50 мкм; 4) ручная работа: на предшествующем уровне техники количество бактерий можно легко и точно определить при помощи микроскопии либо такими методами, как окрашивание, проецирование или фотографирование, получая изображения для измерения на основе увеличения, что требует много труда и времени, поэтому эти методы подсчета не получили широкого распространения в клинической практике; 5) ручная работа: размеры и форма бактерий различаются между видами, к примеру, существуют разветвленные, нитчатые, веретенообразные и цепочечные бактерии, среди прочего, поэтому трудно определить количество бактерий вышеприведенными методами из предшествующего уровня техники, если бактерии сильно перекрываются.

Таким образом, особенно важно предложить экономичную и быструю схему тестирования на чувствительность и разработать автоматизированное устройство для подсчета бактерий специально для бактерий, которое будет быстрым, точным и удобным для применения.

Сущность изобретения

В настоящем изобретении предложен способ измерения подавления бактерий антибактериальными средствами, устройство для подсчета бактерий и способ подсчета с тем, чтобы по крайней мере решить техническую проблему длительного времени обработки в методах измерения подавления бактерий антибактериальными средствами из предшествующего уровня техники, что не дает возможности врачам выбрать целевое лекарство раньше следующего дня.

В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ измерения подавления бактерий антибактериальными средствами. Способ измерения подавления включает: добавление антибактериального средства в заданной концентрации к бактериям, подлежащим определению, устанавливая это как смесь бактерий и препарата; при этом устанавливая подлежащие определению бактерии без антибактериального средства в качестве положительного контроля; а по истечении первого заданного срока с момента добавления антибактериального средства – определение текущего количества бактерий в смеси бактерий и препарата и текущего количества бактерий в положительном контроле; определение того, что антибактериальное средство в заданной концентрации подавляет или частично подавляет или не подавляет бактерии, исходя из соотношения текущего количества бактерий в смеси бактерий и препарата к текущему количеству бактерий в положительном контроле.

Необязательно, когда соотношение текущего количества бактерий в смеси бактерий и препарата к текущему количеству бактерий в положительном контроле равняется первому заданному пороговому значению, то определяется, что антибактериальное средство в заданной концентрации подавляет данные бактерии.

Необязательно первое заданное пороговое значение составляет от 0 до 0,6.

Необязательно первое заданное пороговое значение составляет от 0 до 0,4.

Необязательно, когда соотношение текущего количества бактерий в смеси бактерий и препарата к текущему количеству бактерий в положительном контроле равняется второму заданному пороговому значению, то определяется, что антибактериальное средство в заданной концентрации частично подавляет данные бактерии, но подавление не достигается;

а по истечении второго заданного срока с момента добавления антибактериального средства определяется второе текущее количества бактерий в смеси бактерий и препарата и второе текущее количество бактерий в положительном контроле, причем второй заданный срок длиннее первого заданного срока;

когда соотношение второго текущего количества бактерий в смеси бактерий и препарата ко второму текущему количеству бактерий в положительном контроле равняется первому заданному пороговому значению, то определяется, что антибактериальное средство в заданной концентрации подавляет данные бактерии.

Необязательно, когда соотношение текущего количества бактерий в смеси бактерий и препарата к текущему количеству бактерий в положительном контроле превышает второе заданное пороговое значение, то определяется, что антибактериальное средство в заданной концентрации не подавляет данные бактерии.

Необязательно первый заданный срок составляет от 0 до 1,5 часов, причем первый заданный срок не составляет 0 часов.

Необязательно второе заданное пороговое значение составляет от 0,4 до 0,8.

Необязательно для определения текущего количества бактерий в смеси бактерий и препарата и текущего количества бактерий в положительном контроле применяется метод подсчета по сопротивлению.

Необязательно способ измерения подавления бактерий антибактериальным средством включает следующие стадии:

a) получение бактерий: инокуляция бактерий в среду и инкубация при температуре от 20 градусов Цельсия (°C) до 40 градусов Цельсия (°C) в течение 15-24 часов и для последующего использования;

b) получение смеси бактерий и препарата и положительного контроля и инкубация при температуре от 20°C до 40°C;

c) после первого заданного срока или второго заданного срока – определение текущего количества или второго текущего количества бактерий в смеси бактерий и препарата либо текущего количества или второго текущего количества бактерий в положительном контроле методом подсчета по сопротивлению;

d) если соотношение текущего количества или второго текущего количества бактерий в смеси бактерий и препарата к текущему количеству или второму текущему количеству бактерий в положительном контроле равняется какому-либо значению от 0 до 0,4, то определяется, что антибактериальное средство в заданной концентрации подавляет данные бактерии.

Необязательно на стадии a) бактерии инокулируют на кровяную среду с агаром и инкубируют при 37 градусах Цельсия (°C) в течение 18 часов; и/или

на стадии b) получают смесь бактерий и препарата и положительный контроль и инкубируют при 37°C; и/или

на стадии c) первый заданный срок составляет 0,5 часа или 1 час или 1,5 часа; а второй заданный срок составляет 2 часа или 2,5 часа или 3 часа.

Необязательно текущее количество бактерий в смеси бактерий и препарата и текущее количество бактерий в положительном контроле определяют методом проточной цитометрии или методом микроскопии для подсчета бактерий либо с помощью счетчика или электрического счетчика, либо методом подсчета живых клеток или методом измерения веса клеток.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрено устройство для подсчета бактерий. Устройство для подсчета бактерий может применяться для определения текущего количества бактерий в смеси бактерий и препарата, и текущего количества бактерий в положительном контроле в способе определения подавления бактерий антибактериальными средствами. Устройство для подсчета бактерий включает: модуль отбора проб для получения образцов бактерий для подсчета; модуль счетной ячейки, включающий: отверстие, переднюю ячейку, заднюю ячейку и электроды, причем передняя ячейка и задняя ячейка соединяются через отверстие, на каждой стороне отверстия находится один из электродов, а давление жидкости между передней ячейкой и задней ячейкой представляет собой вакуум, который используется для того, чтобы образец бактерий для подсчета проходил из передней ячейки через отверстие в заднюю ячейку; и систему управления схемой для подсчета бактерий в образце бактерий для подсчета на основе импульсного сигнала, который генерируется с обеих сторон отверстия и детектируется, причем импульсный сигнал используется как показатель того, что через отверстие прошла одна бактерия из образца бактерий для подсчета.

Необязательно система управления схемой включает: первый процессор для детектирования импульсного сигнала, передачи импульсного сигнала на обрабатывающее устройство и получения количества бактерий в образце бактерий для подсчета, отправленного обрабатывающим устройством, причем количество бактерий в образце бактерий для подсчета получают на основе данных о характеристиках бактерий, указанных при помощи импульсного сигнала; или

второй процессор для детектирования импульсного сигнала и для подсчета бактерий в образце бактерий для подсчета на основе данных о характеристиках бактерий, указанных при помощи импульсного сигнала.

Необязательно система управления схемой включает: первую схему питания для подачи постоянного тока на отверстие через электроды, причем при подаче постоянного тока на отверстие запускается импульсный сигнал при прохождении одной или нескольких бактерий через отверстие; или

вторую схему питания для подачи постоянного тока на отверстие через электроды, причем при подаче постоянного тока на отверстие запускается импульсный сигнал при прохождении одной или нескольких бактерий через отверстие.

Необязательно диаметр отверстия находится в пределах первого целевого диапазона диаметров, причем первый целевой диапазон диаметров позволяет прохождение через отверстие только одной бактерии за раз при пропускании через него бактерий из образца бактерий для подсчета; или

диаметр отверстия находится в пределах второго целевого диапазона диаметров, причем второй целевой диапазон диаметров позволяет прохождение через отверстие нескольких бактерий за раз при пропускании через него бактерий из образца бактерий для подсчета.

Необязательно, когда диаметр отверстия находится в пределах первого целевого диапазона диаметров, то диаметр отверстия составляет от 30 микрон до 70 микрон и/или отверстие имеет длину от 30 микрон до 100 микрон.

Необязательно, когда диаметр отверстия находится в пределах первого целевого диапазона диаметров, то диаметр отверстия составляет от 40 микрон до 60 микрон и/или отверстие имеет длину от 40 микрон до 70 микрон.

Необязательно, когда диаметр отверстия находится в пределах первого целевого диапазона диаметров, то диаметр отверстия составляет 50 микрон и/или отверстие имеет длину в 50 микрон.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ подсчета бактерий. Способ подсчета бактерий может применяться для получения текущего количества бактерий в смеси бактерий и препарата, и текущего количества бактерий в положительном контроле в способе измерения ингибирования бактерий антибактериальными средствами. Способ подсчета бактерий включает: внесение образца бактерий для подсчета в модуль счетной ячейки, причем модуль счетной ячейки включает: отверстие, переднюю ячейку, заднюю ячейку и электроды, причем передняя ячейка и задняя ячейка соединяются через отверстие, а давление жидкости между передней ячейкой и задней ячейкой представляет собой вакуум, который используется для того, чтобы образец бактерий для подсчета проходил из передней ячейки через отверстие в заднюю ячейку, причем на каждой стороне отверстия находится один из электродов, а при подаче напряжения на электроды имеется заданное сопротивление между двумя сторонами отверстия;

детектирование наличия импульсного сигнала, генерируемого с обеих сторон отверстия из-за изменения сопротивления между двумя сторонами отверстия, причем импульсный сигнал используется как показатель того, что через отверстие прошла одна бактерия из образца бактерий для подсчета;

если детектируется импульсный сигнал, генерируемый с обеих сторон отверстия, то на основе импульсного сигнала определяется количество бактерий в образце бактерий для подсчета.

Необязательно определение количества бактерий в образце бактерий для подсчета на основе импульсного сигнала включает:

передачу импульсного сигнала на обрабатывающее устройство и получение количества бактерий в образце бактерий для подсчета, отправленного обрабатывающим устройством, причем количество бактерий в образце бактерий для подсчета определяется на основе данных о характеристиках бактерий, указанных при помощи импульсного сигнала; или

определение количества бактерий в образце бактерий для подсчета на основе данных о характеристиках бактерий, указанных при помощи импульсного сигнала.

Необязательно диаметр отверстия находится в пределах первого целевого диапазона диаметров, причем первый целевой диапазон диаметров позволяет прохождение через отверстие только одной бактерии за раз при пропускании через него бактерий из образца бактерий для подсчета; или

диаметр отверстия находится в пределах второго целевого диапазона диаметров, причем второй целевой диапазон диаметров позволяет прохождение через отверстие нескольких бактерий за раз при пропускании через него бактерий из образца бактерий для подсчета.

На каждой стороне отверстия имеется один из электродов, причем электроды с обеих сторон отверстия образуют источник постоянного тока. Однако бактерии не являются проводниками электричества, поэтому при их прохождении через отверстие образуется сигнал в виде импульса напряжения. Следовательно, количество бактерий в образце бактерий для подсчета можно определить по описанной схеме на основе сигнала типа импульса. Необязательно “импульсный сигнал” может означать “импульсный сигнал напряжения”.

Данные о характеристиках бактерий, указанные при помощи импульсного сигнала, включают: амплификацию и усиление импульсного сигнала контуром согласования, фильтрацию шума через фильтр нижних частот, фильтрацию запредельных значений через ограничительный буфер и идентификацию сигналов с данными о характеристиках бактерий в импульсном сигнале при помощи алгоритмов для идентификации импульсов, определения наклона, выявления пика волны, выявления впадины волны и определения ширины полосы, среди прочего.

Засорение отверстия (забивание отверстия) включает полное засорение отверстия и неполное засорение отверстия, т.е. полное закупоривание отверстия и неполное закупоривание отверстия.

В случае полного засорения отверстия будут выдаваться аномальные показания, приводящие к неверному результату подсчета, поэтому нужно использовать модуль обратной промывки или модуль обжига, чтобы устранить засорение отверстия; однако при неполном засорении отверстия это напрямую повлияет на результаты анализа при выводе данных. Неполное засорение отверстия можно определить по времени подсчета, т.е. существует эталонное значение для наблюдаемого времени подсчета, и если устройство для подсчета бактерий работает должным образом с незасоренным отверстием и время засасывания образца бактерий для подсчета фиксировано, то увеличение времени подсчета будет указывать на неполное засорение отверстия в детекторе устройства для подсчета бактерий; и необязательно, по другой схеме или при засорении отверстия, имеется алгоритм для определения запредельных значений, который определяет, что данные неточные и имеется засорение отверстия или внешнее вмешательство.

При нормальном рабочем состоянии устройства фиксированное значение времени подсчета уже установлено, поэтому оно одинаково, и в нормальном рабочем состоянии напряжение на отверстии в основном стабильно в определенном диапазоне, поэтому повышение напряжения на отверстии или аномальные результаты подсчета будут указывать на засорение отверстия или помехи от примесей на отверстии. Многие факторы могут приводить к засорению отверстия, а в большинстве случаев это происходит из-за неравномерного смешивания различных бактерий или нечастой прочистки отверстия, что может привести к накоплению мешающих подсчету веществ и к закупориванию отверстия.

Необязательно существует и другой способ определения наличия засора отверстия при помощи интервала напряжения, то есть напряжение делится на 3 уровня, т.е. нормальное, высокое или аномальное, соответственно; в случае повышения напряжения это значит, что имеется засорение отверстия в детекторе устройства для подсчета бактерий, сравнительно высокое напряжение означает микрозасорение отверстия (т.е. неполное засорение отверстия), аномальное напряжение означает полное засорение отверстия, а нормальное напряжение означает отсутствие засорения отверстия; в случае повышения напряжения в отверстии или аномальных показаний или аномального исходного уровня это значит, что отверстие закупорено или на него влияют загрязнения.

В нормальном случае: среднее отверстие для жидкости в задней ячейке находится под вакуумом, а в задней ячейке есть 3 канала, причем верхний и нижний каналы подсоединяются к разбавляющему буферу через клапан, а жидкость, проходящая внутрь, называется незагрязненной жидкостью; шаровой клапан в среднем отверстии затем подключается к насосу, а жидкость выводится как отработанная жидкость, электрод также располагается в среднем отверстии (этот электрод является внешним электродом и сделан из нержавеющей стали, а внутренний электрод из платины находится в передней ячейке), в нормальном случае жидкость в среднем канале находится под вакуумом, гарантируя, что жидкость в образце бактерий для подсчета может пройти в заднюю ячейку из передней ячейки и совершится подсчет по мере прохождения жидкости образца через отверстие, а после подсчета бактерий в образце задняя ячейка очищается путем пропускания жидкости через верхнее и нижнее входное отверстие задней ячейки и вытекания из выходного отверстия на другом конце задней ячейки, например, задняя ячейка очищается жидкостью, поступающей в заднюю ячейку и вытекающей из неё через входные и выходные отверстия задней ячейки, при этом, к примеру, жидкость, поступающая в заднюю ячейку, является разбавляющим буфером, а жидкость, находящаяся в задней ячейке, является отработанной жидкостью, которая может содержать образец и разбавляющий буфер, а верхний и нижний каналы соединяются друг с другом как 1, деленная на 2, где 1 означает основной канал, ведущий к разбавляющему буферу, а 2 соединяется с верхним и нижним отверстием задней ячейки, соответственно, и в среднем канале содержатся электроды.

В случае засорения отверстия: вакуум в среднем отверстии для жидкости задней ячейки отключается, и одна из возможностей – начать подачу положительного давления через нагнетательный насос, создавая давление в задней ячейке с тем, чтобы промыть отверстие и устранить полное или неполное его засорение. Другая возможность – подача жидкости через верхнее и нижнее отверстие для жидкости в задней ячейке, создавая давление в задней ячейке с тем, чтобы промыть отверстие и устранить полное или неполное его засорение.

Далее, модуль счетной ячейки необязательно включает:

модуль обратной промывки для промывания при засорении отверстия, чтобы устранить его засорение. Кроме того, отключается вакуум для жидкости задней ячейки, и жидкость поступает через два отверстия для жидкости в задней ячейке, создавая давление в задней ячейке с тем, чтобы промыть отверстие и устранить его засорение. В качестве альтернативы прилагается положительное давление через нагнетательный насос, создавая давление в задней ячейке с тем, чтобы промыть отверстие и устранить его засорение.

Кроме того, модуль счетной ячейки необязательно включает:

модуль обжига для обжигания при засорении отверстия для устранения его засорения.

Кроме того, модуль обжига используется для подачи напряжения, превышающего заданное значение напряжения, через электроды на отверстие с тем, чтобы расплавить вещества, застрявшие в отверстии при засорении отверстия.

Как только компьютер, подключенный к устройству для подсчета бактерий, обнаружит засорение отверстия, т.е. включится сигнализация компьютера или появится сообщение, для устранения засора в отверстии можно провести высоковольтный обжиг вручную, т.е. вручную щелкнуть на кнопку управления в компьютере (терминале ПК), чтобы запустить контур высоковольтного обжига, т.е. если для нормального подсчета применяется напряжение постоянного тока (сравнительно низкое), то для обжига применяется высокое напряжение постоянного тока, а обжиг заключается в быстром переключении между высоким и низким напряжением с высокой частотой во время высоковольтного обжига, и в моменты прерывания тока возникают дуговые разряды с обеих сторон отверстия, образуя электрические искры, обжигающие материалы, засоряющие отверстие. Другим возможным способом устранения засора в отверстии путем обжига является использование высоковольтного постоянного тока для обжига, тогда как для нормального подсчета переключающим контуром подается стабильное низкое напряжение, причем при высоком напряжении во время обжига исследуемая жидкость нагревается до кипения с тем, чтобы расплавить и устранить содержащийся белок, производя обжигающий эффект, устраняющий засорение отверстия.

Далее, заданное напряжение составляет от 90 до 110 В.

Более того, заданное напряжение составляет 110 В.

Далее, передняя ячейка состоит из пластмассы.

Более того, передняя ячейка состоит из полиоксиметиленового материала.

Далее, задняя ячейка состоит из пластмассы.

Более того, задняя ячейка состоит из полиоксиметиленового материала.

Хорошие характеристики при обработке пластмасс, особенно полиоксиметиленовых материалов, позволяют легко обеспечить требуемые размеры передней ячейки и задней ячейки, а также их более стабильную структуру.

Наиболее заметные положительные эффекты способа измерения подавления бактерий антибактериальными средствами в воплощениях настоящего изобретения заключаются в следующем:

(1) прорыв в сроках представления результатов – отчет может быть отправлен в пределах 1-2 часов от получения чистых культур;

(2) прорыв в практичности, однако реальное преимущество состоит в том, что целевая терапия антибиотиками может осуществляться в тот же день с получением чистой культуры бактерий вместе с быстрой идентификацией бактерий (завершается в пределах 1-2 часов) с учетом ежедневного рабочего процесса и расписания, что не только снижает уровень смертности пациентов и расходы на здравоохранение, но также потенциально замедляет рост лекарственной устойчивости у бактерий;

(3) зрелая и стабильная технология с надежными результатами;

(4) принцип близок к международному стандартизированному протоколу (метод разведения бульона для теста на чувствительность), который будет иметь большую практическую применимость, если будет внедрен в клиническую практику;

(5) низкая стоимость;

(6) легко поддается автоматизации.

Устройство для подсчета бактерий и техническая схема способа подсчета, предусмотренные в воплощениях настоящего изобретения, имеют следующие положительные эффекты:

в воплощениях настоящего изобретения реализовано автоматическое применение устройства для подсчета бактерий методом подсчета по сопротивлению, решена проблема больших затрат времени и неэффективности текущего метода подсчета бактерий, а также достигнут эффект быстрого и точного подсчета бактерий.

Усовершенствование отверстия (апертуры) в воплощениях настоящего изобретения гарантирует, что бактерии могут проходить через отверстие одна за другой и тем самым предотвращает влияние перекрывания на подсчет бактерий и реализует точный и эффективный подсчет бактерий методом подсчета по сопротивлению; дополнительные функции обратной промывки под высоким давлением и обжигания могут предотвратить засорение отверстия, а в случае засорения отверстия конструкция обратной промывки под высоким давлением, встроенная в заднюю ячейку, может устранить полное или неполное засорение отверстия, а в случае неудачной обратной промывки под высоким давлением можно использовать функцию обжига для устранения засора в отверстии, то есть гарантирует, что в условиях меньшего размера отверстия будет непросто получить полное или неполное засорение отверстия.

Специально разработан контур согласования сигнала для подсчета бактерий; добавлена схема преобразования сигнала для фильтрации небактериальных сигналов и точной идентификации сигналов о характеристиках бактерий, что снижает вероятность ошибочных результатов.

Краткое описание фигур

В описании представлены чертежи, входящие в состав настоящего изобретения, для лучшего понимания настоящего изобретения, а также схематические воплощения настоящего изобретения и их описание для разъяснения настоящего изобретения, которые не составляют неправомерных ограничений изобретения.

На фиг. 1 представлено схематическое изображение полного устройства для подсчета бактерий в одном воплощении настоящего изобретения.

На фиг. 1-1 представлено схематическое изображение подвижного процесса аспирации образцов у полного устройства для подсчета бактерий в одном воплощении настоящего изобретения.

На фиг. 1-2 представлено схематическое изображение того, как полное устройство для подсчета бактерий дозирует аспирированный образец в модуль счетной ячейки в одном воплощении настоящего изобретения.

На фиг. 2 представлена структурная схема модуля счетной ячейки в одном воплощении настоящего изобретения.

На фиг. 2-1 представлено схематическое изображение частично симметричного поперечного сечения структуры из фиг. 2 в одном воплощении настоящего изобретения.

На фиг. 2-2 представлено схематическое изображение поперечного сечения структуры отверстия в одном воплощении настоящего изобретения.

На фиг. 3 представлена структурная схема модуля отбора проб в одном воплощении настоящего изобретения.

На фиг. 3-1 представлена структурная схема в поперечном сечении взаимного соответствия иглы для отбора проб и поршня в одном воплощении настоящего изобретения.

На фиг. 3-2 представлена структурная схема подноса для реагентов в одном воплощении настоящего изобретения.

На фиг. 4 представлена принципиальная схема работы способа подсчета по сопротивлению в одном воплощении настоящего изобретения.

На фиг. 4-1 представлена принципиальная схема путей прохождения жидкости в устройстве для подсчета бактерий в одном воплощении настоящего изобретения.

На фиг. 5 представлена блок-схема контура согласования сигнала в одном воплощении настоящего изобретения.

На фиг. 6 представлена диаграмма изменения количества бактерий в различное время в бульонной культуре Escherichia coli в одном примере из настоящего изобретения.

На фиг. 7 представлена диаграмма изменения мутности в различное время в бульонной культуре Escherichia coli в одном примере из настоящего изобретения.

На фиг. 8 представлена диаграмма наблюдаемых результатов изменения мутности и количества бактерий в бульонной культуре бактерий в одном примере из настоящего изобретения.

На фиг. 9 представлена диаграмма результатов эксперимента по культивированию из примера 3 настоящего изобретения.

На фиг. 10 представлена диаграмма результатов сравнения между 2 ч и 24 ч из примера 3 настоящего изобретения.

На фиг. 11 представлена диаграмма согласованности результатов по чувствительности из примера 3 настоящего изобретения.

Раскрытие сущности изобретения

Следует отметить, что примеры и признаки в примерах из данного изобретения можно комбинировать друг с другом при отсутствии противоречий. Далее настоящее изобретение будет подробно описано ниже со ссылкой на прилагаемые чертежи и примеры.

Сущность теста на чувствительность (методов измерения подавления бактерий антибактериальными средствами) по настоящему изобретению состоит в том, чтобы отслеживать влияние антибиотиков на рост, метаболизм и размножение бактерий и делать выводы об эффективности применения препаратов в будущем в соответствии с их влиянием на рост, метаболизм и размножение бактерий (т.е. с подавлением бактерий), наблюдаемым при тестировании in vitro, в сочетании с клиническими и фармакокинетическими исследованиями. В традиционных методах уничтожение бактерий под действием антибиотика отслеживают по изменениям количества бактерий в жидкой или твердой среде, наблюдая за популяцией бактерий. Точный количественный мониторинг каждой отдельной бактерии, а не выявление тенденции изменения при общем подсчете бактериальной популяции, может привести к раннему и быстрому выявлению воздействия препарата на бактерии, что вне сомнения приведет к крупному прорыву в сроках обработки при тестировании на чувствительность. Однако на предшествующем уровне техники отсутствует точный, практичный и автоматизированный метод микроскопии для выявления отдельных бактерий. Поэтому творчески предложены технические схемы настоящего изобретения с другой точки зрения для быстрого тестирования на чувствительность методом подсчета бактерий.

В частности, одна из технических схем настоящего изобретения заключается в творческом применении наиболее зрелого, надежного, быстрого и экономичного метода подсчета по сопротивлению (по принципу Коултера) для подсчета форменных элементов крови к измерению подавления бактерий антибактериальными средствами для быстрого тестирования на чувствительность. Добавляя различные концентрации антибактериального препарата во время роста бактерий, можно установить, что антибактериальный препарат выше определенной концентрации подавляет рост и размножение бактерий и тем самым определить минимальную ингибирующую концентрацию. В традиционных методах минимальная ингибирующая концентрация определяется по изменениям мутности бульона после роста бактерий, что занимает много времени, обычно 18 часов. В последние годы некоторые коммерческие компании проводили оптимизацию, используя более чувствительные нефелометры или добавляя индикаторы окислительно-восстановительного потенциала в попытке обнаружить рост или подавление бактерий на ранней стадии, однако эти методы по-прежнему занимают 10 часов до представления отчета. Поскольку антибактериальные средства могут оказывать действие на бактерии за короткий период времени, то практическое значение имеет поиск метода или схемы для определения действия препаратов на бактерии как можно быстрее, чтобы можно было определить чувствительность бактерий к препаратам за очень короткий промежуток времени. Настоящее изобретение позволяет количественно подсчитывать бактериальные клетки за короткий период времени методом подсчета по сопротивлению и тем самым быстро определять чувствительность к антибактериальным средствам. Посредством анализа и сравнения изменений в количестве бактерий можно быстро определять ингибирующее действие антибиотиков на бактерии, а тем самым и чувствительность к антибактериальным средствам. Этот метод очень подходит для быстрого тестирования на чувствительность со стабильными и надежными результатами.

В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрено устройство для подсчета бактерий. Это устройство для подсчета бактерий может применяться для получения текущего количества бактерий в смеси бактерий и препарата, и текущего количества бактерий в положительном контроле в способе измерения подавления бактерий антибактериальными средствами. Это устройство для подсчета бактерий измеряет количество бактерий методом подсчета по сопротивлению. Во-первых, необходимо изобрести устройство для подсчета бактерий для измерения количества бактерий методом подсчета по сопротивлению, т.е. разработать модуль отбора проб, модуль счетной ячейки и систему управления схемой и объединить их, получая полное устройство для подсчета бактерий, пригодное для измерения количества бактерий методом подсчета по сопротивлению. Далее, поскольку диаметры отверстия у существующих устройств для подсчета бактерий подходят для измерения сравнительно крупных клеток типа эритроцитов и лейкоцитов, то техническая схема настоящего изобретения представляет собой усовершенствование диаметра отверстия в соответствии с конкретным размером бактерий, т.е. диаметр отверстия регулируется таким образом, чтобы за один раз через отверстие могла пройти только одна бактерия или несколько бактерий из образца бактерий для подсчета при прохождении через него бактерий из образца бактерий для подсчета, а в аномальном случае засорения отверстия используется модуль обратной промывки для промывания и устранения засора в отверстии либо модуль обжига для обжигания и устранения засора в отверстии в случае засорения отверстия.

Типичное устройство

Принципиальная схема полного устройства для подсчета бактерий, описанного выше, представлена на фиг. 1, причем устройство для подсчета бактерий содержит модуль счетной ячейки (1), модуль отбора проб (2), контур согласования сигнала (3) и корпус (4). Модуль счетной ячейки (1) жестко соединен с модулем отбора проб (2). Контур согласования сигнала (3) представлен на фиг. 5; контур согласования сигнала (3) располагается под канатной дорожкой (41), как показано на фиг. 1-2, т.е. он находится в устройстве для подсчета бактерий; контур согласования сигнала (3) соединяется с внутренним электродом (141) и внешним электродом (142) в модуле счетной ячейки (1); контур согласования сигнала (3) включает плату регистрации сигнала, главный пульт управления и т.п. Корпус (4) находится снаружи от модуля счетной ячейки (1), модуля отбора проб (2) и контура согласования сигнала (3), причем модуль отбора проб (2) включает механизм перемещения и модуль отбора проб (2) засасывает жидкость с бактериями для анализа в модуль счетной ячейки (1) через механизм перемещения, а модуль счетной ячейки (1) приводится в движение модулем отбора проб (2) и скользит по канатной дорожке (41).

Структурная схема модуля счетной ячейки (1) представлена на фиг. 2, а структурная схема модуля счетной ячейки (1) в частичном разрезе представлена на фиг. 2-1. Модуль счетной ячейки (1) включает отверстие (11), переднюю ячейку (12), заднюю ячейку (13), внутренний электрод (141) и внешний электрод (142), соединяющий переднюю ячейку и заднюю ячейку, а отверстие (11) расположено между передней ячейкой (12) и задней ячейкой (13), причем внутренний электрод (141) и внешний электрод (142) соединяются между передней ячейкой (12) и задней ячейкой (13).

Как видно из фиг. 2-1, задняя ячейка (13) включает верхний канал для жидкости (131), средний канал для жидкости (132) и нижний канал для жидкости (133), причем жидкость в задней ячейке (13) находится под вакуумом, заставляющим всю жидкость с бактериями для определения входить в переднюю ячейку (12), протекать через отверстие (11) и полностью входить в заднюю ячейку (13), причем наиболее значительный эффект возникает, когда средний канал для жидкости (132) в задней ячейке (13) находится под вакуумом; верхний канал для жидкости (131) и нижний канал для жидкости (133) в задней ячейке (13) – это два канала для промывки, а провод внешнего электрода (142) навинчен на металл внешней стенки среднего канала для жидкости (132) и необязательно внутренний электрод (141) является платиновым и используется для подсчета бактерий в образце бактерий для подсчета. При тестировании образец измеряемой жидкости проходит через отверстие, вызывая изменение сопротивления, которое регистрируется электродами в передней ячейке и задней ячейке, при этом генерируется импульсный сигнал в цепи и происходит подсчет бактерий согласно количеству импульсов.

Для подсчета бактерий измеряется сила сигнала из внутреннего электрода (141) и внешнего электрода (142) при помощи датчика. Поскольку разбавляющий буфер проводит электричество, то в отверстии (11) имеется некоторое сопротивление при подаче определенного напряжения между двумя электродами, и клетки, которые не проводят электричество, будут изменять сопротивление в отверстии при вхождении в него, тем самым генерируя импульсный сигнал в цепи, который затем обрабатывается и передается на терминал ПК для анализа, при этом можно измерять и анализировать количество, размеры и другие параметры клеток в соответствии с количеством импульсов и характеристиками типа амплитуды импульса и т.п. Принципиальная схема работы представлена на фиг. 4, а количество бактерий в жидкости с бактериями для измерения получается путем просчета сопротивления устройством для подсчета бактерий и передается на терминал ПК (компьютера).

Структурная схема модуля отбора проб (2) представлена на фиг. 3. Как видно из фиг. 1, фиг. 1-1 и фиг. 3, модуль отбора проб (2) включает механический рычаг, который может перемещаться в трех измерениях, иглу для отбора проб (22), поршень-сваб (23), поднос для реагентов (24), плунжерный насос (25) и т.п. Механизм перемещения модуля отбора проб (2) включает механический рычаг и иглу для отбора проб (22), причем механический рычаг включает в себя механический рычаг (21-1) для перемещения по оси X, механический рычаг (21-2) для перемещения по оси Y и механический рычаг (21-3) для перемещения по оси Z, а один конец иглы для отбора проб (22) проходит через поршень (23). Структурная схема в поперечном сечении взаимного соответствия иглы для отбора проб (22) и поршня (23) представлена на фиг. 3-1. Когда необходима очистка, вода поступает через впускную трубочку (231), а затем выходит через выпускную трубочку (232). Другой конец иглы для отбора проб (22) жестко соединен с механическим рычагом (21-2) и перемещается вместе с ним, тем самым реализуя целевую функцию отбора проб, то есть игла для отбора образцов (22) засасывает жидкость с бактериями для измерения из подноса для реагентов (24). Как видно из фиг. 1-1, плунжерный насос (25) соединен с иглой для отбора проб (22) и регулирует всасывание и выброс жидкости с бактериями для измерения иглой для отбора проб (22). Две иглы для отбора проб (22) закреплены на штативе механического рычага с трехмерным перемещением, а к каждой игле для отбора проб (22) прикреплен один из поршней (23), или же можно использовать четыре иглы для отбора проб (22).

Причем несколько зондов не только могут быть сравнительно неподвижными относительно друг друга, но и могут перемещаться независимо.

На фиг. 5 представлена блок-схема контура согласования сигнала (3), который представляет собой схему преобразования сигнала на плате обработки сигналов и получает слабые сигналы, а затем выдает количество бактерий после усиления, фильтрации, регистрации сигнала и т.д.

Принцип работы модуля отбора проб в устройстве для подсчета бактерий схематически представлен на фиг. 1, фиг. 1-1 и фиг. 1-2. Когда устройство для подсчета бактерий работает, модуль отбора проб (2) быстро перемещается в указанное положение, и под управлением плунжерного насоса (25) игла для отбора проб (22) выполняет начальное перемешивание жидкости с бактериями для измерения в подносе для реагентов (24) и отбирает пробу жидкости с бактериями для измерения, а затем вносит жидкость с бактериями для измерения в переднюю ячейку (12) модуля счетной ячейки (1), который перемещается вместе с модулем отбора проб (2).

Структурная схема отверстия 11 условно представлена на фиг. 2-2. Принимая во внимание как силу тестового сигнала, так и время подсчета бактерий, диаметр (111, диаметр апертуры) отверстия (11) устанавливается в пределах от 30 микрон до 70 микрон, предпочтительно от 40 микрон до 60 микрон, а длина (112) отверстия (11) составляет от 30 микрон до 100 микрон, предпочтительно от 40 микрон до 70 микрон. Диаметр (111) отверстия в 50 микрон и длина (112) отверстия в 50 микрон больше всего подходят для измерения бактерий. В случае засорения отверстия (11) конструкция обратной промывки под высоким давлением, встроенная в заднюю ячейку (13), может устранить засорение отверстия.

Данные испытания эффектов подсчета по сопротивлению для одного и того же стандартного раствора для испытания (стандартное количество бактерий примерно 2500 клеток/мл) при различных диаметрах отверстия по такой схеме имеют следующий вид.

1) Когда длина отверстия установлена равной 50 микрон, то количество бактерий на миллилитр (после вычислений), измеренное при различных диаметрах, для сравнения представлено в табл. 1.

Таблица 1

№ / диаметр	30 мкм	40 мкм	50 мкм	60 мкм	70 мкм
1	1035	2132	2501	1142	936
2	1056	2200	2488	1132	921
3	1034	2150	2493	1135	902
4	1026	2140	2487	1136	910
5	1019	2157	2495	1156	930
6	1034	2169	2510	1158	940

Анализ показывает, что если диаметр отверстия слишком мал, то произойдет засорение отверстия, что приведет к снижению измеренного количества частиц. Если диаметр отверстия слишком велик, то возрастет количество проходящих одновременно частиц, что приведет к неточному подсчету и снижению измеренного количества частиц. Из приведенной выше табл. 1 видно, что оптимальный диаметр (111) отверстия составляет 50 микрон, то есть когда получены наилучшие данные результатов испытаний для подсчета по сопротивлению.

2) Когда диаметр отверстия установлен равным 50 микрон, то количество бактерий на миллилитр (после вычислений), измеренное при различных отверстиях, для сравнения представлено в табл. 2.

Таблица 2

№ / длина	30 мкм	40 мкм	50 мкм	60 мкм	70 мкм	80 мкм	90 мкм	100 мкм
1	1700	1800	2501	1650	1025	951	850	725
2	1750	1800	2488	1645	1030	988	845	730
3	1705	1805	2493	1651	1050	993	851	750
4	1725	1795	2487	1648	1064	987	848	764
5	1736	1796	2495	1646	1036	995	846	736
6	1710	1810	2510	1652	1037	910	852	737

Анализ показывает, что при условии фиксированного диаметра отверстия с повышением длины отверстия возрастает количество проходящих одновременно частиц, что приводит к неточному подсчету и снижению измеренного количества частиц; а если длина отверстия слишком мала, то из-за высокой скорости потока многие частицы не будут обнаружены, что приведет к снижению измеренного количества частиц; а из приведенной выше табл. 2 видно, что оптимальная длина отверстия составляет 50 микрон, то есть когда получены наилучшие данные результатов испытаний для подсчета по сопротивлению.

Как видно из приведенной выше табл. 2, оптимально, когда диаметр (111) отверстия составляет 50 микрон и длина (112) отверстия составляет 50 микрон, то есть при наилучших данных испытаний для эффекта на подсчет по сопротивлению. Хотя диаметр и длина отверстия в других диапазонах не дает такого же хорошего эффекта, как 50 микрон, однако подсчет все же может проводиться, а полученные неточные показатели являются относительными, то есть для различных жидкостей с бактериями для измерения одинаковые стандарты подсчета приводят к точным суждениям о тенденциях при подсчете бактерий в бактериальных жидкостях, а это значит, что все-таки можно использовать другие характеристики длины и диаметра отверстия для измерения абсолютного количества бактерий.

Конструкция обратной промывки под высоким давлением конкретно заключается в следующем: отключается вакуум в среднем канале для жидкости (132) задней ячейки (13) с тем, чтобы жидкость поступала через верхний канал для жидкости (131) и нижний канал для жидкости (133) задней ячейки (13), создавая давление в задней ячейке (13) для обратной промывки отверстия (11) и устранения полного или неполного засорения отверстия (11). В случае, если высокое давление не сработает, можно выбрать функцию обжига для устранения засора в отверстии, то есть будет нелегко получить полное или неполное засорение отверстия при уменьшении отверстия.

Необязательно, как показано на фиг. 2, передняя ячейка (12) представляет собой интегрированную четырехканальную структуру из полиоксиметиленового материала или другого пластика, причем расстояние между двумя окнами каналов (121) передней ячейки (12) составляет 18 мм, а объем внутренней жидкости передней ячейки (12) превышает 2,5 мл. Использование полиоксиметиленового материала или другого пластика позволяет легко обеспечить точные размеры передней ячейки (12) и задней ячейки (13), а также их более стабильную структуру.

Например, бактерии могут вызвать засорение отверстия при прохождении через него, что приведет к неточному подсчету бактерий. Для решения проблемы неточного подсчета бактерий из-за засора, образовавшегося в отверстии, в одном примере настоящего изобретения также предусмотрена схема обнаружения и схема устранения засора в отверстии. На фиг. 1-1 представлена схема условного полного устройства, в котором для устранения засора в отверстии рядом с устройством для подсчета бактерий установлен плунжерный насос для обратной промывки под высоким давлением или/и на электроды с обеих сторон отверстия подается высокочастотное счетное напряжение для высоковольтного обжига для устранения засора в отверстии. Более подробно см. в разделе «Типичный способ».

Типичный способ

Необязательно с каждой стороны сформированного лазером отверстия расположен платиновый электрод. Поскольку разбавляющий буфер проводит электричество, то в отверстии имеется некоторое сопротивление при подаче определенного напряжения между двумя электродами. Но клетки не проводят электричество и будут изменять сопротивление в отверстии при вхождении в него, тем самым генерируя импульсный сигнал в цепи, который затем обрабатывается и передается на терминал ПК для анализа, при этом можно измерять и анализировать количество, размеры и другие параметры клеток в соответствии с количеством импульсов и характеристиками типа амплитуды импульса и т.п.

Для подсчета бактерий специально разработаны контур согласования сигналов и алгоритм регистрации сигналов, при этом эффективные сигналы остаются невредимыми при усилении сигнала, а эффективный сигнал настраивается на такое усиление, которое больше всего способствует распознаванию алгоритмом, путем регулировки усиления; для отфильтровывания высокочастотного шума используется фильтрация нижних частот, а запредельные амплитуды отфильтровываются при помощи ограничительного буфера. Количество бактерий определяется из импульсного сигнала путем точной идентификации сигналов о характеристиках бактерий с помощью таких алгоритмов, как распознавание импульсов, выявление наклона, выявление гребней, выявление впадин и определение ширины полосы.

Когда импульсный сигнал входит в набор импульсных сигналов первого типа, то система управления схемой или обрабатывающее устройство определяет количество импульсных сигналов из набора первого типа в качестве первого отсчета, причем каждый импульсный сигнал из набора импульсных сигналов первого типа запускается при прохождении одной бактерии через отверстие; а когда импульсный сигнал входит в набор импульсных сигналов второго типа, то система управления схемой или обрабатывающее устройство определяет произведение количества импульсных сигналов из набора второго типа на заданное число в качестве второго отсчета, причем каждый импульсный сигнал из набора импульсных сигналов второго типа запускается при одновременном прохождении заданного числа бактерий через отверстие.

Когда импульсный сигнал входит только в набор импульсных сигналов первого типа, количество бактерий в образце для подсчета определяется как первый отсчет; в случае, когда импульсный сигнал входит только в набор импульсных сигналов второго типа, количество бактерий в образце для подсчета определяется как второй отсчет; а когда импульсный сигнал входит в набор импульсных сигналов первого типа и в набор импульсных сигналов второго типа, количество бактерий в образце для подсчета определяется как сумма первого отсчета и второго отсчета.

В качестве примера система управления схемой или обрабатывающее устройство в одном примере из настоящего изобретения может определить, входит ли импульсный сигнал в набор импульсных сигналов второго типа, посредством следующих операций.

В случае прохождения только одной бактерии – это точный подсчет; а в случае одновременного прохождения двух или трех бактерий через отверстие генерируемый импульсный сигнал является импульсным сигналом второго типа и регистрируется как эффективный отсчет, если импульсный сигнал второго типа находится в пределах диапазона ошибок импульсного сигнала первого типа, в противном случае выдается сообщение об ошибке для повторного подсчета или же результат подсчета преобразуется по значению ошибки.

К примеру, бактерии могут вызвать засорение отверстия при прохождении через него, что приведет к неточному подсчету бактерий. Для того, чтобы решить проблему неточного подсчета, вызванного засорением отверстия, в примерах настоящего изобретения дополнительно предусмотрена схема выявления и схема устранения.

В качестве примера схемы выявления засорения отверстия в примерах настоящего изобретения дополнительно включают: когда отмечается, что напряжение между передней ячейкой и задней ячейкой превышает заданный порог, то определяется наличие засора в отверстии, при этом передняя ячейка является анодом, а задняя ячейка – катодом, и чем сильнее засорение отверстия, тем большее будет сопротивление между обеими сторонами отверстия и тем самым большее напряжение между передней ячейкой и задней ячейкой; а заданный порог может устанавливаться в соответствии с различными требованиями к измерениям (типа различной точности измерения) для подсчета бактерий.

В качестве примера схемы устранения засорения отверстия схема обратной промывки для устранения засорения отверстия в примерах настоящего изобретения дополнительно включает: обратную промывку под высоким давлением.

В качестве примера схемы устранения засорения отверстия схема обжига для устранения засорения отверстия в примерах настоящего изобретения дополнительно включает: обжиг под высоким напряжением.

В случае засорения отверстия жидкость проходит обратно под избыточным давлением из среднего промывочного канала, расположенного прямо напротив отверстия в средней части, и выходит из верхнего и нижнего промывочного канала; на заднюю ячейку под совместным контролем плунжерного насоса и клапана подается положительное давление через верхний и нижний каналы для жидкости, а отработанная жидкость выходит через канал для отработанной жидкости передней ячейки, причем отработанная жидкость выводится через комбинацию соленоидного клапана и насоса для отработанной жидкости.

Процесс обжигания проводится при 110 В с подачей высокочастотного счетного напряжения на электроды с обеих сторон отверстия; для нормального счета счетное напряжение представляет собой подаваемое непрерывно напряжение постоянного тока, но для высоковольтного обжига оно должно включаться и выключаться через короткие промежутки, формируя высокую частоту, а в момент включения и выключения питания возникает дуговой разряд между двумя электродами, причем электрическая искра выходит из отверстия, так что белки и обломки клеток легко удаляются. В некоторых приборах предусмотрен отдельный источник переменного тока, при этом обжигание контролируется с помощью реле или кремниевого триодного тиристора (SCR) на переднем конце электродного провода. Необязательно обжигание для устранения засорения отверстия также может осуществляться путем плавления белков при нагревании типа автоклавирования.

Необязательный вариант – многозондовая конструкция с новой конструкцией зонда: 2 зонда перемещаются одновременно, производя эффект 4 зондов, при этом сокращаются расходы; эта конструкция применяется для подсчета бактерий с двумя пробоотборниками из нержавеющей стали, которые приводятся в движение механическим рычагом с трехмерным перемещением, как показано на фиг. 3, а расстояние между двумя иглами пробоотборника (22) составляет 18 мм, они засасывают пробы из подноса и выпускают жидкость для измерения в две счетные ячейки, которых в общей сложности 4, причем в это время начинают работать два канала счетных ячеек; затем механический рычаг с трехмерным перемещением приводит в движение два пробоотборника из нержавеющей стали, которые опять засасывают пробы из подноса и выпускают жидкость для измерения в две другие счетные ячейки, а также начинают работать два канала этих счетных ячеек; по завершении детектирования в каналах снова будут засасываться пробы и будут повторяться те же действия. Одновременное перемещение 2 зондов (игл для отбора проб (22)) и многоканальное детектирование не только сокращают время ожидания, но и сокращают стоимость дополнительных комплектов зондов (пробоотборников).

Необязательно трехмерный рычаг перемещается вместе со счетной ячейкой, что сокращает время между засасыванием проб и их доставкой.

Трехмерный рычаг перемещается вместе со счетной ячейкой, которая сравнительно неподвижна. Пробы для детектирования попадают прямо в ближайшую счетную ячейку под действием трехмерного рычага, перемещающегося по осям X, Y и Z, при этом не требуется никаких чрезмерных трехмерных движений.

Необязательно, как показано на фиг. 3, иглы пробоотборника (22) находятся на расстоянии 18 мм друг от друга; как видно из структурной схемы подноса для реагентов (24) на фиг. 3-2, интервал между двумя отверстиями для проб (241) в подносе для реагентов (24) составляет 9 мм, поэтому расстояние между двумя иглами для отбора проб (22) ровно в два раза превышает интервал между двумя отверстиями для проб в подносе для реагентов, что уменьшает передвижения и сокращает время, тем самым избегая длинных ходов при перемещении, увеличения рабочего времени и снижения эффективности при слишком больших интервалах.

Необязательно, как показано на фиг. 4, как только иглы пробоотборника выпустят жидкость в переднюю ячейку, жидкость из передней ячейки поступает в заднюю ячейку под действием вакуума и при этом жидкость проходит через отверстие; при прохождении бактерий через отверстие возникает импульсный сигнал (подается постоянный ток, и прохождение бактерий вызывает изменение сопротивления и тем самым изменение напряжения), происходит фильтрация схемы и сигнал подвергается усилению, а затем фильтрации, после чего сигнал поступает в однокристальный микрокомпьютер, где проводится сбор данных AD, кроме того, однокристальный микрокомпьютер имеет алгоритм распознавания импульсов, а обработанные данные будут загружены в программное обеспечение ПК. При обработке сигнала: для сбора данных AD требуются данные порядка 10 мегабайт, которые затем преобразуются алгоритмом в данные по числу K, причем это “число K” означает общий счет и информацию для гистограммы. Затем данные загружаются в компьютер.

Необязательно принципиальная схема прохождения жидкости в процессе работы устройства для подсчета бактерий представлена на схеме путей прохождения жидкости на фиг. 4-1. Устройство для подсчета бактерий представляет собой устройство с путями прохождения жидкости по четырехканальной схеме. Поскольку пути прохождения жидкости для каждого канала одинаковы, то в качестве примера для уточнения принципа их работы приводятся два канала, т.е. канал 1 и канал 2 (CH1 и CH2): как видно из схемы путей прохождения жидкости на фиг. 4-1, перед введением проб для подсчета сначала каждый раз перед подсчетом очищается модуль счетной ячейки (1); всасывается разбавляющий буфер (реагент для измерения бактерий) под действием соленоидного клапана (V1) в сочетании с насосом на 10 мл, затем жидкость впрыскивается в переднюю ячейку (12) через соленоидный клапан (V1), соленоидный клапан (V2), соленоидный клапан (V3), соленоидный клапан (V4) и насос, а затем нагнетается положительное давление в жидкостный тракт под совместным действием насоса на 10 мл и соленоидного клапана (V1), соленоидного клапана (V2) и соленоидного клапана (V3) для обратной промывки отверстия (11), затем из передней ячейки (12) полностью выводится отработанная жидкость под действием соленоидного клапана (V8), соленоидного клапана (V9) и насоса (P1), а из задней ячейки (13) выводится отработанная жидкость под действием насоса (P3), соленоидного клапана (V6) и соленоидного клапана (V7). При этом процесс дозирования и просчета проб заключается в следующем: жидкость вводится в переднюю ячейку (12), затем разбавляется при добавлении разбавляющего буфера через комбинацию соленоидного клапана и насоса, и поднимается поршень (23). Процесс очистки поршня (23) заключается в следующем: поднимаются иглы пробоотборника (22), причем нижняя поверхность иглы для отбора проб (22) завернута в поршень (23), разбавляющий буфер промывает наружные стенки игл пробоотборника (22) из канала соленоидного клапана (V4) и отводится в резервуар для отработанной жидкости под совместным действием соленоидного клапана (V5) и насоса (P1), а затем разбавляющий буфер промывает внутренние стенки игл пробоотборника (22) из канала соленоидного клапана (V4) и отводится в резервуар для отработанной жидкости под совместным действием соленоидного клапана (V5) и насоса (P1). Соленоидный клапан (V4) представляет собой Т-образный клапан с одним входом и двумя выходами; в определенный момент по меньшей мере один из двух выходов (скажем, выход 1 и выход 2) открывается для входа, направляя разбавляющий буфер для очистки внутренних и наружных стенок игл пробоотборника (22); после очистки иглы будут отбирать пробы для измерения. В течение определенного периода времени проводится подсчет в двух каналах, в которые сначала вводятся пробы, под действием вакуума, создаваемого соленоидным клапаном (V6) и насосом (P3), а по прохождении заданного времени передняя ячейка (12) и задняя ячейка (13) будут очищаться под совместным действием соленоидного клапана и насоса в ожидании следующего введения проб.

Следует отметить, что хотя в подробном описании выше упоминается несколько блоков/модулей или подблоков/субмодулей, однако это разделение является только примерным, но не обязательным. На самом деле, согласно воплощениям настоящего изобретения, характеристики и функции двух или нескольких блоков/модулей, указанных выше, могут быть заданы в одном блоке/модуле. С другой стороны, характеристики и функции одного блока/модуля, указанного выше, могут быть разделены и заданы в виде нескольких блоков/модулей.

Кроме того, хотя операции в способе по настоящему изобретению представлены на сопроводительных чертежах в определенном порядке, но это не обязательно значит, что для достижения требуемых результатов они должны выполняться именно в этом порядке или что должны выполняться все представленные операции. Так или иначе, некоторые стадии могут быть пропущены, а несколько операций можно объединить в одну для выполнения и/или одну операцию можно разбить на несколько стадий для выполнения.

ПРИМЕРЫ

Далее положительные эффекты способа измерения подавления бактерий антибактериальными средствами будут изложены со ссылкой на примеры.

Пример 1

Цель: выявить показатели чувствительности бактерий к изменениям в бульонных культурах, определить теоретическую основу для быстрого тестирования лекарственной чувствительности и разработать способ тестирования лекарственной чувствительности у бактерий.

Материалы и методы

1. Получение бактериальных штаммов

Три стандартных штамма (Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923 и Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853) переносили для использования позже и инкубировали при 37°C в течение 18 часов.

2. Приготовление бульона

Готовили бактериальный штамм и растирали на стенке флакона с бульоном для AST (определения чувствительности к антибиотикам), равномерно перемешивали, закрывали крышку и измеряли мутность на нефелометре (BD PhoenixSpec Nephelometer), а когда мутность составляла 0,5 единиц МакФарланда – оставляли для использования позже. Бактерии инокулировали для тестирования при концентрации инокулята, указанной в методе CLSI (Американского института клинических и лабораторных стандартов) для определения лекарственной чувствительности по разведениям в бульоне, и инкубировали в инкубаторе при 37°C.

3. Подсчет бактерий

Инкубировали в инкубаторе при 37°C, проводили подсчет бактерий через 0 мин, 10 мин, 30 мин, 60 мин, 90 мин и 120 мин методом подсчета по сопротивлению (счетчик частиц по сопротивлению (счетчик Коултера) OMEC (Zhuhai) RC-3000). Измеряли дважды, брали средние значения и регистрировали данные.

4. Измерение мутности

Инкубировали в инкубаторе при 37°C, через 0 мин, 10 мин, 30 мин, 60 мин, 90 мин и 120 мин измеряли мутность дважды на нефелометре (BD PhoenixSpec Nephelometer), брали средние значения и регистрировали данные. Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3. Результаты наблюдений по изменениям мутности и количества бактерий в бульонных культурах бактерий

	ATCC 25922 Escherichia coli	ATCC 25923 Staphylococcus aureus	ATCC 27853 Pseudomonas aeruginosa
	Мутность	Подсчет (клеток/мкл)	Мутность	Подсчет (клеток/мкл)	Мутность	Подсчет (клеток/мкл)
0 мин	0,04	172	0,04	211	0,04	141
30 мин	0,05	265	0,04	254	0,04	246
60 мин	0,05	456	0,05	376	0,04	338
90 мин	0,06	647	0,06	697	0,05	668
120 мин	0,08	1577	0,06	963	0,06	1013

Изменения количества бактерий в бульонной культуре Escherichia coli в различное время представлены на фиг. 6.

Изменения мутности в бульонной культуре Escherichia coli в различное время представлены на фиг. 7.

Выводы

1. В случае бульонных культур бактерий наблюдаются большие отличия по наблюдаемым изменениям бактерий между различными методами, а общепринятые сейчас турбидиметрические методы для роста популяции бактерий проявляют низкую чувствительность и не могут определить отличия в пределах 120 минут.

2. Методом подсчета бактерий можно определить значительные отличия между бульонными культурами в пределах 30 минут, что свидетельствует о пригодности метода для определения лекарственной чувствительности у бактерий.

Пример 2. Способ измерения подавления Escherichia coli ATCC 25922 ампициллином (методом подсчета по сопротивлению)

Материалы и методы

1. Получение бактериальных штаммов

Стандартный штамм ATCC 25922 Escherichia coli переносили для использования позже и инкубирован при 37°C в течение 18 часов.

2. Приготовление бульона

Десять пробирок (или чашек) для тестирования лекарственной чувствительности содержали антибиотики в требуемых концентрациях при двукратных разведениях (согласно американским стандартам CLSI для концентраций различных препаратов); 11-я пробирка без антибиотиков использовалась в качестве положительного контроля (ПК); а 12-я пробирка без бактериальной суспензии использовалась в качестве отрицательного контроля (ОК).

Готовили бактериальный штамм и растирали на стенке флакона с бульоном Мюллера-Хинтона (MH для определения чувствительности к антибиотикам), равномерно перемешивали, закрывали крышку и измеряли мутность на нефелометре (BD PhoenixSpec Nephelometer), а когда мутность составляла 0,5 единиц МакФарланда – оставляли для использования позже.

Бактерии инокулировали для тестирования при концентрации инокулята, указанной в методе CLSI (Американского института клинических и лабораторных стандартов) для определения лекарственной чувствительности по разведениям в бульоне, и инкубировали в инкубаторе при 37°C.

Приготовление бактериальной суспензии: отбирали одну колонию для получения бактериальной суспензии с тем, чтобы концентрация бактериальной суспензии составляла 0,5 единиц МакФарланда. Вносили суспензию из колонии в (MH)-бульоны, содержащие различные антибиотики в различных концентрациях с тем, чтобы содержание бактерий
в каждой пробирке после инокуляции составляло от 1×10⁴ КОЕ/мл до 5×10⁷ КОЕ/мл, оптимально 5×10⁶ КОЕ/мл (колониеобразующих единиц на мл), т.е. оптимально 5×10⁶ колониеобразующих единиц на мл.

3. Метод подсчета по сопротивлению (по принципу Коултера)

Инкубировали в инкубаторе при 37°C, проводили подсчет бактерий через 0 мин, 10 мин, 30 мин, 60 мин, 90 мин и 120 мин, соответственно, методом подсчета по сопротивлению (счетчик частиц по сопротивлению (счетчик Коултера) OMEC (Zhuhai) RC-3000). Измеряли дважды, брали средние значения и регистрировали данные.

Изменения количества бактерий в экспресс-тесте на чувствительность Escherichia coli ATCC 25922 к ампициллину представлены ниже в табл. 4.

Таблица 4

	Полож. контроль	Отриц. контроль	0,5	1	2	4	8	16	32	64	128	256
0 мин	0	204	210	230	208	206	204	208	210	220	212	207
60 мин	0	820	807	789	811	304	250	264	290	278	214	350
90 мин	0	1502	1540	1469	1511	432	502	500	491	489	367	460
120 мин	0	2513	2534	2456	2463	590	524	560	578	641	498	512

Результаты наблюдений по изменениям мутности и количества бактерий в бульонных культурах представлены на фиг. 8, где по горизонтальной оси приведены концентрации антибиотиков, соответствующие значениям в первой строке табл. 4 в приложении, в единицах мкг/мл; а по вертикальной оси приведено количество бактерий в единицах числа клеток на мкл.

Для тестирования было 12 пробирок, причем 11-я пробирка – положительный контроль (ПК), 12-я пробирка – отрицательный контроль (ОК), а остальные 10 пробирок – опытные пробирки. В каждый момент детектирования проводились измерения для всех 12 пробирок.

На фиг. 8 представлены результаты тестирования лекарственной чувствительности методом подсчета по сопротивлению, то есть в данном примере тестировали подавление Escherichia coli ATCC 25922 ампициллином, и результаты показали, что минимальная ингибирующая концентрация (MIC) составляет 4 мкг/мл.

Кроме того, бактерии в этом примере также подвергали тестированию на лекарственную чувствительность тремя другими методами, а именно: измеряли подавление Escherichia coli ATCC 25922 в этом примере ампициллином в соответствии с руководством по эксплуатации системы определения чувствительности микробов VITEK фирмы Mérieux, Франция, с минимальной ингибирующей концентрацией 4 мкг/мл; измеряли подавление Escherichia coli ATCC 25922 в этом примере ампициллином в соответствии с методом Etest, как изложено в руководстве по эксплуатации набора Etest фирмы Thermo Fisher, США, с минимальной ингибирующей концентрацией 2 мкг/мл; и измеряли подавление Escherichia coli ATCC 25922 в этом примере ампициллином в соответствии с методом тестирования лекарственной чувствительности путем разведения в бульоне, как указано в стандартах определения чувствительности путем разведения в бульоне Американского института клинических и лабораторных стандартов, с минимальной ингибирующей концентрацией 4 мкг/мл. Как видим, все эти результаты последовательны и чувствительны.

Выводы

1. Минимальная ингибирующая концентрация (MIC) определяется в пределах 60 минут.

2. В этом примере настоящего изобретения минимальная ингибирующая концентрация (MIC) определяется в пределах 60 минут, что согласуется с результатами метода VITEK (метода тестирования лекарственной чувствительности фирмы Mérieux), метода Etest и тестирования лекарственной чувствительности путем разведения в бульоне, то есть опять же это свидетельствует о пригодности метода тестирования лекарственной чувствительности бактерий по настоящему изобретению, который проявляет значительные положительные эффекты быстрого получения результатов по чувствительности бактерий.

Как видно из примеров 1 и 2, результаты по подавлению, полученные способом измерения подавления бактерий антибактериальными средствами по настоящему изобретению, анализировали в сравнении с результатами традиционных методов: результаты сравнивали с результатами методов VITEK (метода тестирования лекарственной чувствительности фирмы Mérieux), Etest и BMD (метода разведения в бульоне), а критерии сравнения определяли в соответствии с правилами FDA (Управления по контролю за продуктами и лекарствами США).

Точки для определения результатов тестирования на лекарственную чувствительность – это когда наблюдаемое количество клеток уменьшается на 20%, 40%, 60% или 80% по сравнению с положительным контролем, а результаты сравниваются с условленными методами для соответствия. Вывод состоит в том, что, когда количество клеток снижается на 40-60% и более, точность достигает 100%, при этом оптимально, когда количество клеток снижается на 60% и более. Время до снижения количества клеток на 40-60% варьируется для разных бактерий, а тестирование может завершаться в пределах 90-120 минут для обычных клинически значимых бактерий и 90 минут для наиболее распространенных клинически значимых бактерий.

Пример 3

1. Эксперимент по выращиванию

1.1. Цели эксперимента

В соответствии с требованиями стандартов CLSI, инокулировали 6 распространенных штаммов, которые обычно используются в клинической области (ATCC 29212, ATCC 29213, ATCC 27853, ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 и Acinetobacter baumannii), и регистрировали тенденции их роста, чтобы установить, возможно ли определение их роста.

1.2. Методы эксперимента

1.2.1. Отрицательный контроль: тестирование неинокулированных сред с помощью счетчика бактерий по сопротивлению и регистрация количества частиц.

1.2.2. Получение бактериальных штаммов: в соответствии с требованиями стандартов CLSI, выбирали свежий штамм в пределах 24 ч с мутностью 0,5 единиц МакФарланда, отбирали 100 мкл и вносили в среду на 10 мл.

1.2.3. Регистрировали результаты через 0ч/0,5ч/1ч/1,5ч, соответственно, и анализировали их после вычитания отрицательного контроля.

1.3. Результаты представлены на фиг. 9. Из эксперимента по выращиванию видно, что уже через 2 часа были значительные изменения у бактерий, которые были четко зафиксированы методом подсчета по сопротивлению, что свидетельствует о пригодности подсчета по сопротивлению с точки зрения методики определения.

2. Сравнение по чувствительности через 2 часа и 24 часа (определение пригодности метода подсчета по сопротивлению для проверки бактерий на чувствительность по результатам сравнения чувствительности за два промежутка времени).

2.1. Цели эксперимента

Для каждого штамма бактерий, обычно используемых в клинической практике, была отобрана группа препаратов класса A, чтобы провести сравнение результатов и проверить соответствие между результатами за 2 часа и 24 часа. См. табл. 5 насчет штаммов бактерий и соответствующих им антибиотиков.

Таблица 5

Название бактериального штамма	Антибиотик
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853)	Цефтазидим
Staphylococcus aureus (ATCC 29213)	Эритромицин
Enterococcus faecalis (ATCC 29212)	Пенициллин
Klebsiella pneumoniae	Гентамицин
Acinetobacter baumannii	Меропенем

2.2. Методы эксперимента

2.2.1. Получение бактериальных штаммов: в соответствии с требованиями стандартов CLSI, отбирали свежие штаммы в пределах 24 ч с мутностью 0,5 единиц МакФарланда из столбца с названием штамма в табл. 5.

2.2.2. Инокуляция: отбирали по 100 мкл из каждой бактериальной суспензии с мутностью 0,5 единиц МакФарланда и вносили в 48-луночный планшет с заданными градиентами антибиотиков, по 500 мкл на лунку.

2.2.3. Инкубация и определение: инкубировали в течение 2 ч при 37°C и измеряли с помощью счетчика бактерий по сопротивлению. Настраивали прибор на максимальную чувствительность, а затем подсчитывали бактерии. Регистрировали результаты 24-часового теста на чувствительность для сравнительного анализа.

2.3. Анализ результатов эксперимента

Таблица 6

Название штамма бактерий	Антибиотик	MIC за 2 ч	MIC за 24 ч	Примечания
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853)	цефтазидим	4	2	разница в один градиент, допустимо
Staphylococcus aureus (ATCC 29213)	эритромицин	0,5	0,25	разница в один градиент, допустимо
Enterococcus faecalis (ATCC 29212)	пенициллин	1	2	разница в один градиент, допустимо
Klebsiella pneumoniae	гентамицин	4	8	разница в один градиент, допустимо
Acinetobacter baumannii	меропенем	0,12	0,12	нет отличий

Из результатов на фиг. 10 и в табл. 6 видно, что отличия между значениями MIC, полученными методом подсчета по сопротивлению (порог для определения MIC составляет 60% от значения положительного контроля) для предпочтительных препаратов согласно требованиям CLSI для пяти клинически значимых штаммов бактерий, выбранных для тестирования чувствительности к антибиотикам, и полученными обычным методом тестирования лекарственной чувствительности путем визуального наблюдения через 24 часа, проявлялись в допустимых пределах, что доказывает пригодность метода подсчета по сопротивлению для тестирования лекарственной чувствительности у бактерий.

3. Степень соответствия данных по чувствительности

Были выбраны 11 клинически значимых штаммов энтеробактерий (2 штамма Escherichia coli, Morganella morganii, Shigella castellani, Klebsiella aerogenes, Citrobacter freundii, 2 штамма Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Salmonella spp.). Для инокуляции согласно требованиям CLSI использовали 96-луночные планшеты с реагентами для определения чувствительности у энтеробактерий фирмы Scenker Biological Technology Co., Ltd. Бактерии инкубировали при 37°C в течение 2 ч, а затем инокулировали в два планшета с реагентами, причем один планшет с реагентами использовался для получения результатов подсчета бактерий через 2 часа и сравнения с результатами положительного контроля. Предварительно было установлено, что при регистрации результатов положительным результатом считаются значения, составляющие не менее 60% от величины положительного контроля. Другой планшет с реагентами использовался для получения результатов эксперимента через 24 часа и для определения степени соответствия данных по чувствительности между 2 ч и 24 ч. Как видно из фиг. 11, результаты показывают, что тестирование лекарственной чувствительности 11 клинически значимых видов Enterobacteriaceae к широко используемым в клинике антибиотикам методом подсчета по сопротивлению проявляет высокую степень соответствия с результатами стандартного метода CLSI.

Пример 4. Результаты тестирования лекарственной чувствительности на живых бактериях и его соответствие с традиционными методами

1.1. Цели эксперимента

Для каждого штамма бактерий, обычно используемых в клинической практике, была отобрана группа препаратов класса A, чтобы провести сравнение результатов и проверить соответствие между результатами за 2 часа и 24 часа. Регистрировали тенденции их роста, чтобы установить, возможно ли определение их роста через 2 часа. См. табл. 7 насчет штаммов бактерий и соответствующих им антибиотиков.

Таблица 7

Название бактериального штамма	Антибиотик
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853)	Цефтазидим
Staphylococcus aureus (ATCC 29213)	Эритромицин
Enterococcus faecalis (ATCC 29212)	Пенициллин
Klebsiella pneumoniae	Гентамицин
Acinetobacter baumannii	Меропенем

1.2. Методы эксперимента

1.2.1. Получение бактериальных штаммов: в соответствии с требованиями стандартов CLSI, отбирали свежие штаммы в пределах 24 ч с мутностью 0,5 единиц МакФарланда из столбца с названием штамма в табл. 7.

1.2.2. Инокуляция: отбирали по 100 мкл из каждой бактериальной суспензии с мутностью 0,5 единиц МакФарланда и вносили в 48-луночный планшет с заданными градиентами антибиотиков, по 500 мкл на лунку.

1.2.3. Инкубация и определение: инкубировали в течение 2 ч при 37°C и проводили подсчет живых бактерий. Регистрировали результаты 24-часового теста на чувствительность для сравнительного анализа.

1.3. Анализ результатов эксперимента

1.3.1. Результаты эксперимента

Результаты тестирования чувствительности Pseudomonas aeruginosa к цефтазидиму.

Результаты экспресс-теста живых клеток на лекарственную чувствительность: MIC = 2; результаты стандартного теста на лекарственную чувствительность: MIC = 2.

См. табл. 8 насчет подробных данных экспресс-тестирования живых клеток на лекарственную чувствительность.

Таблица 8 (значения в первой строке – концентрации антибиотика; единица измерения – мкг/мл; значения во второй строке – количество бактерий, единица измерения – число клеток/мкл)

	16	8	4	2	1	0,5	0,25	0,12	0,06	0,03	Положит. контроль
Число живых клеток	209	202	297	308	1090	1235	1480	1513	1478	1509	1498

Результаты тестирования чувствительности Staphylococcus aureus к эритромицину.

Результаты экспресс-теста живых клеток на лекарственную чувствительность: MIC = 0,25; результаты стандартного теста на лекарственную чувствительность: MIC = 0,25.

См. табл. 9 насчет подробных данных экспресс-тестирования живых клеток на лекарственную чувствительность.

Таблица 9 (значения в первой строке – концентрации антибиотика; единица измерения – мкг/мл; значения во второй строке – количество бактерий, единица измерения – число клеток/мкл)

	16	8	4	2	1	0,5	0,25	0,12	0,06	0,03	Положит. контроль
Число живых клеток	457	446	460	498	598	609	889	3980	5078	5107	4897

Результаты тестирования чувствительности Enterococcus faecalis к пенициллину.

Результаты экспресс-теста живых клеток на лекарственную чувствительность: MIC = 1; результаты стандартного теста на лекарственную чувствительность: MIC = 2.

См. табл. 10 насчет подробных данных экспресс-тестирования живых клеток на лекарственную чувствительность.

Таблица 10 (значения в первой строке – концентрации антибиотика; единица измерения – мкг/мл; значения во второй строке – количество бактерий, единица измерения – число клеток/мкл)

	16	8	4	2	1	0,5	0,25	0,12	0,06	0,03	Положит. контроль
Число живых клеток	659	683	798	1076	3085	11105	12088	12958	13679	13789	13900

Результаты тестирования чувствительности Klebsiella pneumoniae к гентамицину.

Результаты экспресс-теста живых клеток на лекарственную чувствительность: MIC = 8; результаты стандартного теста на лекарственную чувствительность: MIC = 8.

См. табл. 11 насчет подробных данных экспресс-тестирования живых клеток на лекарственную чувствительность.

Таблица 11 (значения в первой строке – концентрации антибиотика; единица измерения – мкг/мл; значения во второй строке – количество бактерий, единица измерения – число клеток/мкл)

	16	8	4	2	1	0,5	0,25	0,12	0,06	0,03	Положит. контроль
Число живых клеток	880	1876	10876	10549	10654	10971	10278	10167	11426	11879	12576

Результаты тестирования чувствительности Acinetobacter baumannii к меропенему.

Результаты экспресс-теста живых клеток на лекарственную чувствительность: MIC = 0,12; результаты стандартного теста на лекарственную чувствительность: MIC = 0,12.

См. табл. 12 насчет подробных данных экспресс-тестирования живых клеток на лекарственную чувствительность.

Таблица 12 (значения в первой строке – концентрации антибиотика; единица измерения – мкг/мл; значения во второй строке – количество бактерий, единица измерения – число клеток/мкл)

	16	8	4	2	1	0,5	0,25	0,12	0,06	0,03	Положит. контроль
Число живых клеток	979	1003	1561	1479	1490	1514	1570	1574	6495	7959	8632

Из результатов в табл. 7-12 видно, что отличия между значениями MIC, полученными методом подсчета живых бактерий (в качестве порога для определения MIC – 60% от значения положительного контроля) для предпочтительных препаратов согласно требованиям CLSI для пяти клинически значимых штаммов бактерий, выбранных для тестирования чувствительности к антибиотикам, и полученными традиционным методом тестирования лекарственной чувствительности путем визуального наблюдения через 24 часа, проявлялись в допустимых пределах, что доказывает пригодность метода подсчета по сопротивлению для тестирования лекарственной чувствительности у бактерий и его соответствие с традиционными методами.

Вышеприведенное описание является лишь предпочтительным воплощением настоящего изобретения и не должно рассматриваться как ограничивающее это изобретение. Настоящее изобретение может подвергаться различным изменениям и вариациям для специалистов в данной области. Любые модификации, эквивалентные замены, усовершенствования и т.п., сделанные в соответствии с духом и принципами настоящего изобретения, должны входить в объем защиты настоящего изобретения.

1. Способ измерения подавления бактерий антибактериальными лекарственными средствами, который включает:

добавление антибактериального лекарственного средства к бактериям, подлежащим определению, устанавливая это как смесь бактерий и лекарственного средства; где устанавливая подлежащие определению бактерии без антибактериального лекарственного средства в качестве положительного контроля; по истечении первого заданного срока с момента добавления антибактериального лекарственного средства – определение текущего количества бактерий в смеси бактерий и лекарственного средства и текущего количества бактерий в положительном контроле; определение того, что антибактериальное средство подавляет, частично подавляет или не подавляет бактерии, исходя из соотношения текущего количества бактерий в смеси бактерий и лекарственного средства к текущему количеству бактерий в положительном контроле; когда отношение текущего количества бактерий в смеси бактерий и лекарственного средства к текущему количеству бактерий в положительном контроле равно первому заданному порогу, определяют, что антибактериальное лекарственное средство ингибирует бактерии; первый заданный порог представляет собой любое значение от 0 до 0,6; когда отношение текущего количества бактерий в смеси бактерий и лекарственного средства к текущему количеству бактерий в положительном контроле равно второму заданному порогу, определяют, что антибактериальное лекарственное средство ингибирует бактерии, но ингибирование не достигнуто; когда достигается второй заданный срок с момента добавления антибактериального лекарственного средства, получают второе текущее количество бактерий в смеси бактерий и лекарственного средства и второе текущее количество бактерий в положительном контроле, где второй заданный срок превышает первый заданный срок; когда отношение второго текущего количества бактерий в смеси бактерий и лекарственного средства ко второму текущему количеству бактерий в положительном контроле равно первому заданному порогу, определяют, что антибактериальное лекарственное средство ингибирует бактерии; когда отношение текущего количества бактерий в смеси бактерий и лекарственного средства к текущему количеству бактерий в положительном контроле превышает второе заданное пороговое значение, определяют, что антибактериальное лекарственное средство не ингибирует бактерии; первый заданный срок представляет собой любое значение от 0 до 1,5 часов, и первый заданный срок не равен 0 часам;

второе заданное пороговое значение представляет собой любое одно значение от 0,6 до 0,8.

2. Способ по п. 1, где первое заданное пороговое значение составляет от 0 до 0,4.

3. Способ по любому из пп. 1, 2, где для определения текущего количества бактерий в смеси бактерий и лекарственного средства и текущего количества бактерий в положительном контроле применяется метод подсчета по сопротивлению.

4. Способ по п. 3, где способ измерения подавления бактерий антибактериальным лекарственным средством включает следующие стадии:

a) получение бактерий: инокуляция бактерий в культуральную среду и инкубация при температуре от 20 до 40°C в течение 15-24 часов и для последующего использования;

b) получение смеси бактерий и лекарственного средства и положительного контроля и инкубация при температуре от 20 до 40°C;

c) после первого заданного срока или второго заданного срока – определение текущего количества или второго текущего количества бактерий в смеси бактерий и лекарственного средства либо текущего количества или второго текущего количества бактерий в положительном контроле методом подсчета по сопротивлению;

d) если соотношение текущего количества или второго текущего количества бактерий в смеси бактерий и лекарственного средства к текущему количеству или второму текущему количеству бактерий в положительном контроле равняется какому-либо значению от 0 до 0,4, то определяется, что антибактериальное лекарственное средство подавляет данные бактерии.

5. Способ по п. 4, где:

на стадии a) бактерии инокулируют на кровяную среду с агаром и инкубируют при 37°C в течение 18 часов; и/или

на стадии b) получают смесь бактерий и лекарственного средства и положительный контроль и инкубируют при 37°C; и/или

на стадии c) первый заданный срок составляет 0,5 часа, или 1 час, или 1,5 часа; а второй заданный срок составляет 2 часа, или 2,5 часа, или 3 часа.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где текущее количество бактерий в смеси бактерий и лекарственного средства и текущее количество бактерий в положительном контроле определяют методом проточной цитометрии или методом микроскопии для подсчета бактерий либо с помощью счетчика или электрического счетчика либо методом подсчета живых клеток или методом измерения веса клеток.

7. Устройство для подсчета бактерий, предназначенное для применения в способе по п. 1, включающее:

модуль отбора проб для получения образцов бактерий для подсчета;

модуль счетной ячейки, включающий: отверстие, переднюю ячейку, заднюю ячейку и электроды, причем передняя ячейка и задняя ячейка соединяются через отверстие, на каждой стороне отверстия находится один из электродов, а давление жидкости между передней ячейкой и задней ячейкой представляет собой вакуум, который используется для того, чтобы образец бактерий для подсчета проходил из передней ячейки через отверстие в заднюю ячейку;

систему управления схемой для определения количества бактерий в образце бактерий для подсчета на основе импульсного сигнала, который генерируется с обеих сторон отверстия и детектируется, причем импульсный сигнал используется как показатель того, что через отверстие проходят бактерии из образца бактерий для подсчета;

модуль счетной ячейки неподвижно соединен с модулем отбора образцов, в случае, когда диаметр отверстия представляет собой диаметр в пределах первого диапазона диаметров мишени, диаметр отверстия составляет от 30 до 70 микрон, и/или отверстие имеет длину от 30 до 100 микрон.

8. Устройство по п. 7, где система управления схемой включает:

первый процессор для детектирования импульсного сигнала, передачи импульсного сигнала на обрабатывающее устройство и получения количества бактерий в образце бактерий для подсчета, отправленного обрабатывающим устройством, причем количество бактерий в образце бактерий для подсчета получают на основе данных о характеристиках бактерий, указанных при помощи импульсного сигнала; или

второй процессор для детектирования импульсного сигнала и для подсчета бактерий в образце бактерий для подсчета на основе данных о характеристиках бактерий, указанных при помощи импульсного сигнала.

9. Устройство по п. 7, где система управления схемой включает:

первую схему питания для подачи постоянного тока на отверстие через электроды, причем при подаче постоянного тока на отверстие запускается импульсный сигнал при прохождении одной или нескольких бактерий через отверстие; или

вторую схему питания для подачи постоянного тока на отверстие через электроды, причем при подаче постоянного тока на отверстие запускается импульсный сигнал при прохождении одной или нескольких бактерий через отверстие.

10. Устройство по любому из пп. 7-9, где диаметр отверстия находится в пределах первого целевого диапазона диаметров, причем первый целевой диапазон диаметров позволяет прохождение через отверстие только одной бактерии за раз при пропускании через него бактерий из образца бактерий для подсчета; или

диаметр отверстия находится в пределах второго целевого диапазона диаметров, причем второй целевой диапазон диаметров позволяет прохождение через отверстие нескольких бактерий за раз при пропускании через него бактерий из образца бактерий для подсчета.

11. Устройство по п. 7, где если диаметр отверстия находится в пределах первого целевого диапазона диаметров, то диаметр отверстия составляет от 40 до 60 микрон и/или отверстие имеет длину от 40 до 70 микрон.

12. Устройство по п. 11, где если диаметр отверстия находится в пределах первого целевого диапазона диаметров, то диаметр отверстия составляет 50 микрон и/или отверстие имеет длину в 50 микрон.

13. Способ подсчета бактерий, который включает:

внесение образца бактерий для подсчета в модуль счетной ячейки устройства для подсчета бактерий по п. 7, причем модуль счетной ячейки включает: отверстие, переднюю ячейку, заднюю ячейку и электроды, причем передняя ячейка и задняя ячейка соединяются через отверстие, а давление жидкости между передней ячейкой и задней ячейкой представляет собой вакуум, который используется для того, чтобы образец бактерий для подсчета проходил из передней ячейки через отверстие в заднюю ячейку, причем на каждой стороне отверстия находится один из электродов, а при подаче напряжения на электроды имеется сопротивление между двумя сторонами отверстия;

детектирование наличия импульсного сигнала, генерируемого с обеих сторон отверстия из-за изменения сопротивления между двумя сторонами отверстия, причем импульсный сигнал используется как показатель того, что через отверстие проходят бактерии из образца бактерий для подсчета;

если детектируется импульсный сигнал, генерируемый с обеих сторон отверстия, то на основе импульсного сигнала определяется количество бактерий в образце бактерий для подсчета.

14. Способ по п. 13, где определение количества бактерий в образце бактерий для подсчета на основе импульсного сигнала включает:

передачу импульсного сигнала на обрабатывающее устройство и получение количества бактерий в образце бактерий для подсчета, отправленного обрабатывающим устройством, причем количество бактерий в образце бактерий для подсчета определяется на основе данных о характеристиках бактерий, указанных при помощи импульсного сигнала; или

определение количества бактерий в образце бактерий для подсчета на основе данных о характеристиках бактерий, указанных при помощи импульсного сигнала.

15. Способ по п. 13 или 14, где диаметр отверстия находится в пределах первого целевого диапазона диаметров, причем первый целевой диапазон диаметров позволяет прохождение через отверстие только одной бактерии за раз при пропускании через него бактерий из образца бактерий для подсчета; или

диаметр отверстия находится в пределах второго целевого диапазона диаметров, причем второй целевой диапазон диаметров позволяет прохождение через отверстие нескольких бактерий за раз при пропускании через него бактерий из образца бактерий для подсчета.