Способ получения целлюлазы

 

ОПИСАНИЕ 368ЗОЗ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советсних

Социалистичесних

Республин

Зависимое от авт. свидетельства ¹

Заявлено 09.Х11.1970 (№ 1494263/28-13) с присоединением заявки №

Приоритет

Опубликовано 26.1.1973. Бюллетень ¹ 9

Дата опубликования описания 9.IV.1973

М. Кл. С 12d 13/10

Номитет по делам изобретений и отнрытий при Совете Министров

СССР

УДК 577.15.07(088.8) Авторы изобретения P. В. Фениксова, H. А. Тиунова, H. А. Родионова, T. И. Кудря

И. И. Сидорова и Л. И. Мартинович ВСЕСОЮЗН„ Я

Ордена В. И. Ленина институт биохимии имени A. Н, Баха!" :;и:;,,"гт г и В

«з ;,: Д(у," l.Ã и г ъ -а

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛАЗЫ

Изобретение относится к производству ферментных препаратов, а именно к способу получения целлюлазы.

Известен способ получения целлюлазы путем выращивания ее продуцентов на питательной среде, содержащей, источник углерода, азота в присутствии минеральных солей и стимуляторов роста.

Предлагаемый способ позволяет повысить выход и стабильность фермента. 10

Для этого в качестве продуцента целлюлозы используют грибы вида Geotrichum cadidum. Можно использовать штамм Geotrichum

candidum № Зс.

В качестве источника углерода целесообраз- 1 но использовать свекловичный жом или фильтровальную бумагу в количестве 2%.

В качестве минеральных солей можно использовать КН РО4, MgSO4 7НзО в количестве, преимущественно равном 0,1 и 0,005%. 20

В качестве источника азота можно использовать неорганические соли, такие, как (NH4) SO4 и NANO> в количестве соответственно, равном по 0,15%.

В качестве стимуляторов роста можно ис- 25 пользовать 10%-ный экстракт из пшеничных отрубей или муку из хлопковых семян в ко;шчестве 1%.

Гриб Geotrichum candidum выделен из гниющей древесины. 30

Гриб синтезирует и выделяет в среду высокоактивную систему ферментов, состоящую из

Сь С, ферментов и целлобиазы, способных расщеплять нативную, высокоупорядоченную форму целлюлозы до растворимых сахаров с преобладанием глюкозы (70% от количества всех образуемых восстанавливающих сахаров).

Токсическими свойствами гриб Geotrichume

candidum не обладает.

Культурально-морфологическая характеристика штамма Geotrichum candidum ¹ Зс на

10 сутки роста.

На синтетической среде Чапека с сахарозой и ХаХОз колонии диаметром 25 — 30 лглт с ровным краем, радиально складчатые. Воздушный мицелий порошистый, скудный, прижатый, белый. Обратная сторона колонии желтоватая, пигмента нет.

На сусло агаре (сусло 5 по Баллингу) колонии диаметром 35 лглт с глубокими радиальными складками, с ровным краем слегка вдавленным в агар, слабо зональные.

Воздушный мицелий белый, тяжистый, шерстистый. Обратная сторона колонии желтовато-бурая, пигмента нет. В центре колонии крупные капли желтовато-коричневого эксудата.

10%-ный экстракт из отрубей получают следующим образом. 100 Г пшеничных отрубей в

1 .г воды автоклавируют (1 атлг, 30 лтин), отжимают через капрон и полученный экстракт используют для приготовления среды. Экстракт из отрубей можно заменить добавлением 1% муки из хлопковых семян.

Температура выращивания 28, аэрация

1 — 2 объема воздуха на 1 объем среды в

I,чин, скорость вращения мешалки 200—

400 об/.иин, длительность культивирования

3 — 4 суток.

368303

30

Заказ 66979 Изд. № 210 Тираж 467 Подписное

ЦНИИПИ

Сапунова, 2

Типография, пр.

Лктивность полученного фермента. 1 мя культуральной жидкости этого гриба расщепляют с образованием восстанавливающих сахаров хроматографическую бумагу Ватман № 1, взятую в количестве 20 мг на 5 мл реакционной смеси при 40 С за 1 час на 6,0% и за 24 час на 70 %.

Сульфитная беленая еловая целлюлоза осахаривается неразведенной культуральной жидкостью при 40 и концентрации субстрата в

5 /о за 6 суток на 60 и за 12 суток на 75,2 /, накапливая до 3,5% сахаров в инкубационной смеси.

Культуральная жидкость этого гриба способна расщеплять до сахаров нативную высокоупорядоченную целлюлозу, такую, как хлопковое волокно, при концентрации су бстрата

0,07 и 40 С, рН 4,7 за 7 и 20 дней на 53 и

90 соответственно.

Линт при концентрации в 5 /о, рН4,7,40 С расщеплялся неразбавленной культуральной жидкостью за 8 дней на 39% и за 14 дней на

57 /о, давая 1,9 и 2,8% восстанавливающих сахаров в реакционной смеси соответственно.

При действии на карбоксиметилцеллюлозу

1 мл культуральной жидкости дает 4 условные единицы активности по методу Витакера при

40 С и 15 мг восстанавливающих сахаров за 1 час при 40 С, рН 5,6 и 1% концентрации су 6стр ата.

На среде состава (в %):

Фильтровальная бумага (измельченная) 1

NaNO3 0,15 (МН,) з504 1,5

КН2Р04 0,1

MgSO4 7Н О 0,05

500 мл 10% -ного экстракта из пшеничных отрубей на 1 л среды

Вода водопроводная До1л

Колонии диаметром 25 — 30 мм с ровным краем, не складчатые, слегка зональные, белые, с порошистой массой артроспор.

Воздушный мицелий белый, шерстистый, слегка прижатый. Обратная сторона колонии желтоватая. Пигмента нет.

Морфологическая характеристика Geotrichum candidum на всех указанных средах сходна. Гифы стелющиеся, слабо септированные. Мицелий слаборазвитый. Спороносные гифы короткие прямостоящие или приподнимающиеся, септированные. Конидии, образующиеся по типу артроспор, короткоцилиндрические с усеченными (обрубленными) концами 5 — 10)(4 мк, бесцветные в цепочках.

Пример культивирования гриба и получения ферм ентного п реп ар ата.

Посевным материалом может служить водная суспензия конидий (10в конидий в 1 мл) или мицелиальная культура двухсуточного возраста.

Выращивание гриба проводят на среде следующего состава (в o ):

Фильтровальная бумага (измельченная) или жом (отмытый) 2

NaNO3 0,15 (NH4) $0,. 0,15

КНаР04 0,1

MgSO4 ° 7НгО 0,05.

Среду готовят на водопроводной воде с добавлением 300 мл 10о/о;ного экстракта из пшеничных отрубей на 1 л среды.

Жом отмывают от пектиновых веществ следующим способом.

100 г жома в 1 л воды автоклавируют (1 атм, 0,5 час), затем промывают горячей водой и сушат на воздухе.

Выход фермента из культуральной жидкости при осаждении 4 объемами этилового спирта составляет 7 г из 1 л; осаждение фермента при 80%-ном насыщении сернокислым аммонием дает 3,5 г препарата из 1 л культуральной жидкости гриба с активностью, в

2 раза превышающей активность препарата, осажденного спиртом.

В процессе получения сухого препарата в обоих случаях активность целлюлолитических ферментов снижается примерно на 30%.

Предмет изобретения

1. Способ получения целлюлазы путем выращивания ее продуцентов на питательной среде, содержащей источник углерода, азота в присутствии минеральных солей и стимуляторов роста, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и стабильности фермента, в качестве продуцента целлюлазы используют гриб вида Geotrichum candidum.

2. Способ по п, 1, отличающийся тем, ччо используют штамм Geotrichum candidum № Зс.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве источника углерода,используют свекловичный жом в количестве 2%.

4. Способ по пп. 1,и 2, отличающийся тем, что в качестве источника углерода используют фильтровальную бумагу в количестве 2%.

5. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве минеральных солей используют КН Р04, MgSO4 7НаО в количестве, преимущественно равном 0,1 и 0,05в/О.

6. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве источника азота используют неорганические соли, такие, как (NH4) SO4 и

МаИОа в количестве, соответственно равном по 0 15%

7. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве стимуляторов роста используют 10%-ный экстракт из пшеничных отрубей.

8. Способ по пп. 1,и 2, отличающийся тем, что в качестве стимулятора роста используют муку из хлопковых семян в количестве 1%.