Продуцент ксиланазы

 

ОПИСАН И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союа Советских

Социалистических

Республик

Зависимое от авт. свидетельства №

Заявлено 16.VI.1970 (№ 1449697/28-13) с присоединением заявки №

Приоритет

Опубликовано 07.II I.1972. Бюллетень № 9

Дата опубликования описания 13.1Ъ .1972

М. Кл. С 12d 13/10

С 121< 3/00

Комитет по делам ивобретеиий и открытий при Совете Мииистров

СССР

УДК 577.151.07(088.8) Авторы изобретения

Л. Г. Логинова, И. Г. Головина и Э. В. Болтянская

Институт микробиологии AH СССР

Заявитель

ШТАММ АСТ!ХОМУСЕ8 SI . 7-ПРОДУЦЕНТ КСИЛАНАЗЫ

Изобретение относится к области микробиологической промышленности.

Известны штаммы микроорганизмов, продуцирующие ксиланазу, например Streptomyces xylophagus.

Предлагаемый штамм отличается от известного своими морфологическими, физиологическими и культуральными признаками. Он обладает высокой осахаривающей способностью. Под действием ксиланазы ксилан расщепляется на 60 — 70% за 15 мин, а под действием фермента Streptomyces xylophagus степень гидролиза субстрата составляет 40,о за 30 мин и 64% за 24 час при одинаковых оптимальных условиях действия фермента.

Для выращивания Actinomyces sp. 7 используют дешевую и простую по составу среду.

Отличительной особенностью Actinomyces

sp. 7 является также его способность накапливать ксиланазу за более короткий период культивирования (34 — 48 час вместо 72 — 120) у Streptomyces xylophagus, что может быть связано с наличием у этой культуры повышенного температурного оптимума роста 40 С.

Повышенная температура культивирования способствует успешному проведению ферментации. По сравнению с другими известными продуцентами ксаланазы Actinomyces sp. 7 по активности этого фермента превосходит более чем в 1,5 раза наиболее активные мезофильные штаммы грибов Тпс11ос1еппа

viride 35, Chaetemium trilaterall 2264.

В препарате-сырце, который выделяют пз культуральной жидкости путем высаливания

5 сернокислым аммонием или осаждением этиловым спиртом, наряду с ксиланазой присутствуют активные ферменты С, типа, входящие в комплекс целлюлаз, а также C> — фермент и целлобиаза.

10 Предлагаемый термотолерантный штамм

Actinomyces sp. 7 культивируют при рН

6,8 — 7,0 с водопроводной водой на среде, содержащей, г/л:

Пшеничная солома со свеклович15 ным жомом (1: 1) 21,35

К1 Оз 5,0

КН2РО4 3,5

NgSO4 ° 7Н20 0,625

С аС12. 2Н20 0,1

20 Длительность культивирования 48 час в лабораторных условиях, 34 час — в ферментере на 100 л. Температура культивирования

40 С.

Штамм имеет следующую характеристику.

25 Морфология. Мнцелий несептнроьанный.

Средняя толщина гиф 0,6 — 0,8 мк. Споры формируются на спороносцах, которые располагаются одиночно и образуют хорошо выраженные спирали с 3 — 4 растянутыми завит30 ками. Величина спор 0,5 — 0,8)(0,7 — 0,9 мк.

331087

Поверхность спор покрыта небольшими шипами.

Культур альные призн а к и. На агаризованных питательных средах образует тонкие, плотные бесцветные колонии, покрытые рыхлым порошковидным слоем воздушного мицелия. Воздушный мицелий сначала имеет белый цвет, затем на третьи — пятые сутки роста становится серым. Часто сохраняются небольшие белые участки. Растворимого пигмента не выделяет. Споры в массе темно-бурого цвета, вследствие чего колонии с нижней стороны буроватые. Темпер атур а культивирования 30 — 50 С, оптимальная 40 С, при 60 С рост отсутствует. Хорошо развивается на простых синтетических средах с крахмалом или целлюлозой в качестве источника углерода. На богатых органических средах, а также на синтетических средах с сахарами рост заметно слабее.

Рост н а синтетически х с р ед ах. Минеральная среда с глюкозой или сахарозой (СРТ: среда Чапека) — рост слабый, колонии бесцветные. Воздушный мицелий скудный, белый или серый, среда не окрашивается.

Среда с крахмалом (среда Гаузе № 1: крахмально-аммиачная среда; СР1 с крахмалом), Рост хороший. Колонии бесцветные. Воздушный мицелий темно-серый. Среда не окрашивается.

Минеральная среда с клетчаткой. Рост хороший. Образуется серый воздушный мицелий. Субстрат не окрашивается.

Рост на органических средах. Картофельный агар. Рост умеренный. Колонии сероватые. Воздушный мицелий пепельно-серого цвета.

Ломтики картофеля. Рост хороший, Колонии мелкие, бесцветные или сероватые. Иногда среда слегка темнеет.

Глюкозо-аспарагиновая среда, Рост слабый.

Колонии тонкие, бесцветные. Воздушный мицелий скудный, серый.

Сусло-агар. Рост умеренный, Колонии мелкоскладчатые; пористые, рыхлые, грязножелтоватые. Воздушный мицелий скудный, белый.

Мясо-пептонный агар. Рост умеренный, воздушный мицелий скудный, белый. Среда и колонии не окрашены.

Физиолого-биохимические свойства.

5Келатину разжижает.

Молоко коагулирует и пептонизирует.

Крахмал гидролизует. Нитраты восстанавливает, клетчатку разлагает. Водород на среде Треснера — Кореняко не выделяет. Меланоидный пигмент на средах с тирозипом не обр азует.

Отношение к источника и углер о д а. Хорошо усваивает глюкозу, фруктозу, крахмал, декстрин, мальтозу, галактозу, маннит, глицерин, рамнозу, инозит, а также натриевые соли уксусной, лимонной, яблочной, янтарной, пировиноградной кислот. Хуже ус55

5

Зо

4 ванвает лактозу, арабинозу, ксилозу, маниозу, эскулнн и фумарат натрия, Слабо усваивает сахарозу, не усваивает инулин, дульцит и лактат.

Отношение к источникам азота.

Использует как минеральные (KNO3, (NH4) >SO4), так и органические — пептон, алании, аспарагин, глицин и мочевину.

Культура обладает слабой антибиотической активностью.

Пример использования данного штамма для получения ксиланазы. Культивирование в лабораторных условиях проводят в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл, с 50 л4л среды на качалке с 180 — 200 об!мин, Состав среды с водопроводной водой следующий, г/л:

Пшеничная солома со свекловичным жомом 21,35

К1 1Оз 5,0

КНгРО4 3,5

MgSO4 ° 7Н О 0,625

СаС1 2Н О 0,1

Посевной материал выращивают на агаризованной среде, состоящей из 50 /О картофельного отвара и 0,5О/р глюкозы, в течение 4—

6 сут. Темпер атура культивирования 40 С.

Длительность глубинного культивирования

48 час.

Культивирование в полупроизводственных условиях ведут v, ферментерах емкостью на

100 л с 45 л среды. Аэрация 1 объем воздуха на 1 объем среды в 1 л4ин, скорость вращения мешалки 300 об/иин. Длительность культивирования 34 час, Посевной материал для ферментации выращивают в колбах на качалке в течение 1,5 — 2 суток на среде указанного выше состава. 3 а единицу активности ксиланазы принимают такое количество фермента, под действием которого образуется 1 мг редуцирующих веществ в реакционной смеси.

Состав реакционной смеси 50 мг ксилана (в виде порошка), 5 лл фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5+1 л4л 0,1 /о-ного раствора фермента или 1 ял фильтрата культуральной жидкости. Температура гидролиза 55 С, время гидролиза 15 мин, Редуцирующие вещества определяют по методу Нельсона. Активность ксиланазы Actinomyces sp. 7 по степени гидролиза ксилана 60 — 70 /о за 15 мин (или 36 единиц редуцирующих сахаров, в пересчете на ксилозу), на 1 л4л фильтрата культуральной жидкости.

Предмет изобретения

Штамм Actinomyces sp. 7 — продуцент ксил аназы.

Морфология. Мицелий несептированный.

Средняя толщина гиф 0,6 — 0,8 л4к. Споры формируются на спороносцах, которые располагаются одиночно и образуют хорошо выраженные спирали с 3 — 4 растянутыми завитками. Величина спор 0,5 — 0,8+0,7 — 0,9 л4к. Поверхность спор покрыта небольшими шипами, 331087

Составитель М. Ларина

Техред 3. Тараненко

Корректоры: Т. Бабакина и Т. Гревцова

Редактор T. Рыбалова

Заказ 918/6 Изд. М 341 Тираж 448 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий нрп Совете Министров СССР

Москва, 7Ê-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

Культуральные признаки.

На агаризованных питательных средах образуются тонкие, плотные бесцветные колонии, покрытые рыхлым порошковидным слоем воздушного мицелия. Воздушный мицелий сначала имеет белый цвет, затем на 3 — 5-е сутки роста становится серым. Часто сохраняются небольшие белые участки. Растворимого пигмента не выделяет. Споры в массе темно-бурого цвета, вследствие чего колонии с нижней стороны буроватые. Температура культивирования 30 — 50 С, оптимальная 40 С, при 60 С рост отсутствует.

Рост на синтетических средах.

Минеральная среда с глюкозой или сахарозой (СРТ: среда Чапека) — рост слабый.

Колонии бесцветные. Воздушный мицелий скудный, белый или серый, среда не окрашивается.

Среда с крахмалом. (Среда Гаузе Мв 1: крахмально-аммиачная среда; СР1 с крахмалом). Рост хороший. Колонии бесцветные.

Воздушный мицелий темно-серый, Среда не окрашивается.

Минеральная среда с клетчаткой.

Рост хороший. Образуется серый воздушный мицелий. Субстрат не окрашивается.

Рост на органических средах.

Картофельный агар. Рост умеренный. Колонии сероватые. Воздушный мицелий пепельносерого цвета.

Ломтики картофеля. Рост хороший. Колонии мелкие, бесцветные пли сероватые. Иногда среда слегка темнеет.

Глюкозо-аспарапшовая среда, Рост слабый.

Колонии тонкие, бесцветные. Воздушный мицелий — скудный серый. Сусло-агар. Ростумеренный. Колонии мелкоскладчатые, пористые, рыхлые, грязно-желтоватые. Воздушный мицелий скудный, белый. Мясо-пептонный агар.

Рост умеренный, воздушный мицелий скудный, белый. Среда и колонии не окрашены.

Физиолого-биохимические свойства.

Желатину р азжижает.

Молоко коагулирует и пептонизирует.

Крахмал гидролизует. Н итр аты восстанавливает, клетчатку разлагает.

Сероводород на среде Треснера — Кореняко не выделяет. Меланоидный пигмент на средах с тирозином не образует.

20 Отношение к источникам углерода. Хорошо усваивает глюкозу, фруктозу, крахмал, декстрин, мальтозу, галактозу, маннит, глицерин, рамнозу, инозит, а также натриевые соли уксусной, л»1монной, яблочной, янтарной, пировиноградной кислот.

Хуже усваивает лактозу, арабинозу, ксилозу, маннозу, эскулпн»» фумарат натрия.

Слабо усваивает сахарозу. *

Не усваивает инулш», дульцит и лактат.

Отношение к псточнпкам азота.

Использует как ы неральные (ККОа(КН»)

SO4), так и органические — пептон, алании, аспарапш, глицнн, мочевину.