Патент ссср 362871

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

36287I

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Зависимое от авт. свидетельства №

Заявлено 09.Х1I.1970 (№ 1498043!28-13) с присоединением заявки ¹

Приоритет

М. Кл. С 12d 13l10

С 12k 3 00

Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Микистров

СССР

Опубликовано 20.XII.1972. Бюллетень №,3 за 1973.

Дата опубликования описания 27.I I.1973

УДК 557.15.07 (088.8) Авторы изобретения

P. В. Фениксова, Н. А. Родионова, И. М. В. Итомленските, И. В. Улезло и Н. Я. Кобзева

Ордена В. И. Ленина институт биохимии им. А. Н. Баха

Заявитель

ШТАММ ASPERGILLUS NIGER 15 — ПРОДУЦЕНТ

КСИЛАНАЗЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству ферментных препаратов.

Известны штампы Aspergillus niger — продуценты ксиланаз.

Цель изобретения — получение наиболее активной ксиланазы.

Штамм Aspergillus niger 15 выделен .из почвы Московской облас1и и отнесен к виду

Aspergil 1 us niger на основании соответствия его с характеристикой вида Asp. niger, приведенной в определителе «The genus Aspergillus Kenneth В., Raper, Dorothy S. Tennel.

The Willianis à Wilkins Company Baltiniore» (1965, USA) .

Особенностью штамма Aspergillus niger 15 является то, что при поверхностном культивировании он синтезирует активную систему ферментов: экзо- и эндоксиланазу, ксилозидазу, арабофуранозидазу, способных расщеплять ксиланы, входящие в состав растительной клеточной стенки разного происхождения, например, ксиланы ржи, пшеничной соломы и древесины березы.

Кроме системы ферментов, действующих на ксилан, штамм синтезирует пектиназу, целлюлазу (Сх — компонент), амилазу и протеин азу.

Штамм имеет следующую характеристику.

Морфология. Конидиеносцы несептированные, неветвящиеся, на конце вздутпя в виде пузыря, на поверхности которого расположены цилиндрические клетки — стеригмы, несущие

s шаровидные головки — конидии. Конидиеносцы бесцветные, размер 200 — 400);7 — 10 л к.

Спороносная зона колоний черная. Конечный пузырь круглый, диаметр 20 — 50 л к. Стеригмы двурядные, причем первичные длиннее

10 вторичных. Конидиальные головки радиальные.

Культуральные признаки.

Штамм растет прп 20 — 37 С и рН среды

2,8 — 8,0. Оптимальная температура роста

15 28 — 30 С и рН среды — 5.

На твердой среде Чапека прп 24 — 26 С через 10 суток роста колонии круглые, диаметр 2,5 — 3,5 сл. Мицелий белый, неокрашенный, споры угольно-черного цвета.

20 На среде Чапека с 1% кукурузного экстракта колонии слегка окрашены в коричневый цвет.

На сусло-агаре колонии гладкнс. За неделю роста при температуре 24 — 25 С колонии бе25 лого цвета, диаметр 6 — 7 с.я, конпдии черные.

На жидкой среде Чапека прп выращивании в течение 2 недель прп температуре 24 — 26 С колонии белого цвета, слегка складчатые, диаметр 3 — 4,5 см, споры черного цвета.

362871

20 г5

Биохимические признаки штамма. Гидролизует крахмал, пектин. Разжижает растворы желатина, Na — карбоксиметилцеллюлозы, ксилана. Использует в качестве единственных источников углерода глюкозу, лактозу, ксилозу, пектиновую кислоту, целлюлозу, ксилан.

Наиболее интенсивный рост наблюдается на ксилане. На средах Чапека, Раулина, Пфефера и Ричарда элемент азота можно использовать в разных формах. Азот аммония легче усваивается культурой, чем азот нитрата. На солях аммония наблюдается более интенсивный рост, образуется большая масса мицелия.

Культура Aspergillus niger 15 может использовать при росте разнообразные фосфорные соединения, но не может усваивать фосфор в трехвалентной форме.

Для получения ксиланазы предлагаемый штамм может быть культивирован как поверхностным, так и глубинным способами.

Для поверхностного культивирования используют среду, состоящую из 90 пшеничных отрубей и 10 пшеничной соломы или пивной дробины. Влажность среды целесообразно поддерживать 60 — 67 /р.

Для глубинного культивирования используют среду, содержащую свекловичный жом в качестве источника углерода, в присутствии мочевины и минеральных солей.

Пример 1. Для получения посевного материала штамм Aspergillus niger 15 выращивают в колбах емкостью 250 мл в течение

3 — 4 суток.

Штамм культивируют поверхностным способом в металлических кюветах на среде с высотой слоя 2 — 3 см, содержащей 90 jo пшеничных отрубей и 10Р/р измельченной пшеничной соломы или пивной дробины при влажности 60 — 67 /р и температуре 28 — 30 С в течение 2 — 3 суток.

Выращенную культуру экстр агируют четырьмя объемами дистиллированной воды в течение 30 мин при 30 С.

Из полученного экстракта в течение 20 мин удаляют мицелий центрифугированием при

3000 об/мин. Из полученного фугата выделяют ферментный препарат осаждением четырех объемов этилового спирта при температуре +4 С. Выход составляет 30 — 35 г на

1 кг воздушно-сухих веществ исходной среды.

Ксиланазная активность на 1 г сухой культуры — 50 — 70 ед.

Пример 2. Выращивают штамм Aspergillus niger 15 в глубинных условиях на среде, содержащей следующие компоненты, г/1 л среды:

Свекловичный жом 30

Мочевина 0,3 (NH4) $04 1,4

КН2Р04 2,0

MgSO4 0,3

СаС1 0,3 и 100 мл раствора микроэлементов: FeSO4 °

-7Н О вЂ” 1у; ZnC1 — 0,8у; MgSO4 Н О вЂ” 0,5у;

СоС1 6Н О вЂ” 0,57; CuSO4, 5Н О вЂ” 10у; (NH>) MoO4 — 10у, при аэрации (1 м /мин среды) и 28 — 30 С в течение 4 суток.

Активность 1 мл культур альной жидкости составила 20 ед. ксиланазы.

Из культуральной жидкости осаждением спирта получают препарат ксиланазы. Выход составляет 4 — 5,2 г на 1 л среды, активность его — 2000 ед. ксиланазы.

Активность фермента определяют следующим образом.

15 мг ксилана пшеничной соломы инкубируют с 1 мл раствора фермента, содержащего

0,1 мг белка и 0,5 мл 0,1 М ацетатного буфера, рН 4,2 в течение часа при 40 С.

По окончании инкубации в инкубационной смеси определяют содержание редуцирующих сахаров методом Нельсона. Активность выражают в миллиграммах образовавшейся ксилазы. 3а единицу ксиланазной активности принимают количество фермента, образующее

1 мг ксилазы в данной инкубационной смеси за 1 «ис при 40 С.

Полученный ферментный препарат ксиланазы при инкубации с разными ксиланами в оптимальных условиях расщепляют за сутки арабоглюкуроноксилан из пшеничной соломы на 60, 4-О-метилглюкуроноксилан из березовой древесины на 80, О-метилглюкуроноксилан подсолнечной лузги на 75 /р и арабоксилан из ржаной муки на 70Р/р.

Предмет изобретения

Штамм Aspergillus niger 15 — продуцент ксиланазы.

Морфология. Конидиеносцы несептированные, неветвящиеся, на конце вздутия в виде пузыря, на поверхности которого расположены цилиндрические клетки — стеригмы, несущие шаровидные головки — конидии. Конидиеносцы бесцветные, размером 200 — 400)( 7 — 10 мк. Спороносная зона колоний — черная. Конечный пузырь круглый, диаметром

20 — 50 мк. Стеригмы двурядные, причем первичные длиннее вторичных. Конидиальные головки радиальные.

На твердой среде Чапека при 24 — 26 С через 10 суток роста колонии круглые, диаметром 2,5 — 3,5 см, мицелий белый, неокрашенный, споры угольно-черного цвета. Конидии круглые, диаметром 2,5 — 4,0 мк.

На среде Чапека с lр/р кукурузного экстракта колонии слегка окрашены в коричневый цвет.

На сусло-агаре колонии гладкие. При выращивании в течение недели при 24 — 25 С колонии белого цвета, диаметр 6 — 7 см, конидии черные, На жидкой среде Чапека при выращивании в течение 2 недель колонии белого цвета, слегка складчатые, диаметр их достигает

3 — 4,5 см; образует споры черного цвета.

Штамм растет при 20 — 37 С и рН среды

2,8 — 8,0. Оптимальная температура роста

28 — 30 С и рН среды 5.

362871

Составитель Т. Полянская

Техред Т Миронова

Редактор Н. Данилович

Корректор Т. Гревцова

Заказ 385/4 Изд. № 69 Тираж 404 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, К-35, Раушская наб., д. 4 5

Типография, пр. Сапунова, 2

Биохимическая характеристика. Гидролизует крахмал и пектин, разжижает растворы желатины, Ма — карбоксиметилцеллюлозы и

- ксилана.

Отношение к источнику углерода. Использует в качестве единственных источников углерода глюкозу, лактозу, пектиновую кислоту, целлюлозу, ксилан. На последнем наблюдается наиболее интенсивный рост.

Отношение к источнику азота. Азот аммония усваивается легче, чем азот нитрата.

Наиболее интенсивный рост наблюдается на солях аммония, при этом- образуется большая масса мицелия.

Отношение к источнику фосфора. Использует разнообразные фосфорные соединения, 5 но не усваивает фосфор в трехвалентной форме.

На среде, содержащей ксилан, гриб синтезирует систему ферментов — эндоксиланазу, ксилозидазу, арабофуранозидазу, способную

10 расщеплять ксиланы различного происхождения (ксиланы ржи, пшеничной соломы, древесины березы и др.) ..