Способ определения холина в биологических объектах

 

l l

О П И-т-." -А Н И Е

ИЗОбРЕТЕНИЯ

377I63

Союз Советских

Социалистических

Ресоублик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕПЬСТВУ

Зависимое от авт. свидетельства №

М. Кл. В Old 15/68

Заявлено 15.Х1.1971 (Ф 17147 74," 33-15) с присоединением заявки №

Пр пор итет

Опубликовано 17.I V.1973. Бюллетень М 18

Д та опубликования описания 29Л 1.1973

Комитет ло делам изобретений и открытий ори Совете Министров

СССР

УДК 6i36:543.544:577. .164.18 (088.8) Автор изобретения

Заявитель

А. Д. Пелевин

Всесоюзный научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛИНА

В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

Изобретение относится к области животноводства.

Известный способ определения холина в биологических объектах, включающий размельчение исследуемой ткани, гидролиз фосфатидов, отделение холина на бумаге методом хроматографии и его количественное определение имеет существенный недостаток— на гидролиз холинфосфатидов 6N соляной кислотой затрачивается 48 час, а для приготовления подвижной фазы н-бутанол — диэтиленгликоль — вода требуются дефицитные химические реактивы.

С целью сокращения времени гидролиза и повышения точности определения по предлагаемому способу гидролиз фосфатидов производят насыщенным раствором гидрата окиси бария, а для отделения холина используют подвижную фазу н-бутанол — уксусная кислота — вода, в соотношении 144: 13: 43. При этом количество холин а определяют элюацией проявленных фосфомолибдатом пятен холина смесью метанол — уксусная кислота, в соотношении 4: 1, а при калориметрировании к элюату добавляют 0,5 мл 0,4%-ного хлористого олова в 3N соляной кислоте.

Предлагаемый способ определения холина в биологических объектах заключается в следующем.

Анализируемую ткань в количестве 10 г гомогенизируют (для мучнистых кормов животного происхождения эту операцию не производят), экстрагируют три раза по 30 мин смесью хлороформ — этанол (2: 1), чтобы отношение общего объема экстрагирующей смеси к весу ткани составляло 20: 1. Затем экстракт выпаривают досуха при пониженном давлении на водяной бане, к остатку добавляют 30 лгл

l0 насыщенного раствора гидрата окиси бария и проводят гидролиз в кипящей водяной бане в течение 2 час. Охлажденную после гидролиза смесь нейтрализуют 20%-ным раствором уксусной кислоты по фенолфталеину, фильтруют

15 для отделения жирных кислот и выпаривают снова досуха. Осадок растворяют в 0,5 — 1 лг г соляной кислоты рН вЂ” 1, переносят в конические пробирки и при необходимости центрифугируют.

20 На линию старта в 2,5 см от нижнего края листа хроматографической бумаги (18<50) микропипеткой наносят по 0,01 — 0,02 мл растворы образцов и холин — хлорида — «свидетеля» — в виде пятен диаметром 0,5 — 1 см на

25 расстоянии 4 см друг от друга. Нанесенные пробы на бумагу подсушивают в токе холодного воздуха при помощи фена. Бумагу помещают в камеру и проводят хроматографирование в течение 24 час восходящим способом, 30 применяя подвижную фазу: н-бутанол — уксус377163

Т0

Предмет изобретения

Составитель В. Фогельман

Техред 3. Тараненко

Корректор H. Стельмах

Редактор В. Новоселова

Заказ 174878 Изд. Лге 1437 Тираж 678 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, 7К-35, Раушская наб., д. 475

Типография, пр. Сапунова, 2 ная кислота — вода (144: 13: 43), которую пал гвают за 1 час до начала работы.

Хроматограмму вынимают из камеры, сушат 30 мин при комнатной температуре и

20 мин при 100 С в термостате. Затем быстро ее погружают в 2о/о-ный раствор фосфомолибденовой кислоты на 1 мин, после чего промывают в проточной воде 5 мин и высушивают при комнатной температуре. Окрашенные в желтый цвет пятна обводят карандашом, вырезают, измельчают ножницами и элюируют

5 мл смеси метанол: уксусная кислота (4: 1) в течение 1 час при 37 С три раза (1-й раз—

1,5 мл; 2-й — 1,5 мл; 3-й — 2 мл), После каждой элюации пробирки центрифугируют и элюаты объединяют. К элюату добавляют

0,5 мл 0,4 -ного раствора хлористого олова в ЗХ соляной кислоте, доводят объем до 5 мл элюирующей смесью и измеряют оптическую плотность при 350 — 360 ммк на ФЭКе с рабочей длиной кюветы 10 мм. Рассчитывают концентрацию холина по калибровочной кривой, построенной путем хроматографирования различных количеств холин-хлорида, рабочий раствор которого содержит 10 мг стандарта в

1 мл.

Для качественной оценки холина хроматограмму после обработки раствором фосфомолибденовой кислоты и промывания слегка протягивают через свежеприготовленный 0,4о/оный раствор хлористого олова в ÇN соляной кислоте. Проявленные пятна имеют темно-синий цвет с четкими границами на голубоватом фоне (Rf — 0,31).

При размерах камеры 55)(25)(20 анализируют одновременно 15 — 20 образцов в течение

30 час.

Ошибка метода + 5 /о.

1. Способ определения холина в биологических объектах, включающий размельчение исследуемой ткани, гидролиз фосфатидов, отде15 ление холина на бумаге методом хроматографии и его количественное определение, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени гидролиза и повышения точности определения, гидролиз фосфатидов производят на20 сыщенным раствором гидрата окиси бария, а для отделения холина используют подвижную фазу н-бутанол — уксусная кислота — вода, в соотношении 144: 13: 43.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что

25 количество холина определяют элюацией проявленных фосфомолибдатом пятен холина смесью метанол †уксусн кислота, в соотношении 4: 1, а при колориметрировании к элюату добавляют 0,5 мл 0,4 /о-ного хлористого

30 олова в 3 N соляной кислоте.