Способ выделения l-аспарагиназы

 

! (;.r 1„

) (11а !"-,:,ъ

ОП И ИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

404277

К flAТЕНТУ

Зависимый от патента №вЂ”

М. Кл. С 12d 13/.10

С 07g 7/028

Заявлено 24,1Ъ .1969 (№ 1323069/28-13)

Пр.иоритет 06Х.1968, № P 1767390.4, ФРГ

Опубликовано 26.Х.1973. Бюллетень № 43

Дата опубликования описания 5.IV.1974

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

УДК 577.15.07(088.8) Авторы изобретения

Иностранцы

Отто Вагнер, Клаус Бауер, Вильфрид Кауфмаин, Эрих Рауэнбуш, Альфред Аренс и Эккарт Ирион (Федеративная Республика Германии) Иностранная фирма

«Байер АГ» (Федеративная Республика Германии) Заявитель

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ L-АСПАРАГИНАЗЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности.

Известен способ выделения L-аспарагиназы из культуральной жидкости, полученной Tlðè культивировании Escherichia соК,предусматривающий осаждение L-аспарагиназы органическим растворителем, например ацетоном.

Предлагаемый способ позволяет более полно выделить фермент из культуральной ж,ид каст,и.

Для этого перед осаждением L-аспарагиназы органическим, растворителем, производят осаждение клеток Escherichia coli в виде хлопьев из культуральной жидкости добавлением в нее органического основания с молекулярным весам более 1000 или его соли с последующим отделением, клеток, например, центрифугированием и экстратированием водой, а добавление органического,растворителя осуществляют в полученный экстракт.

В качестве основания можно применять акрамин,общей формулы (CONH (СН,) 6 — NHCO — NH (СН2) з — N—!

СН, (СН2) 6 — ХН1п с молекулярным весом выше 1000, который

:можно получать путем реакции обмена ди-(3амина-и-пропил) -метиламина с гександиизоцианатом; протамин; гистон; катионоактивный крахмал, полученный путем обменного разложения крахмала с гидрохлоридом р-див алкиламиноэтилхлорида.

Сущность способа заключается в следующем.

Выращивают клетки Escherichia co/i на питательной среде, содержащей неорганиче10 ские ио ны и смесь,из аминокислоты .и пептнда в форме клеточных автолизов или проте:ингидролизов в качестве, источника азота, а в качестве источника углерода — соответствующие органические. кислоты.,В качестве питательной среды можно использовать замочную кукурузную воду. Хорошие результаты получают, если концентрацию молочной кислоты, содержащейся в замочной кукурузной воде, повышают и добавочно пр,ибав чяют ХН -ионы Вместо мо чочной кпс чо ты могут быть также применены янтарная кислота, фумаровая кислота .или L-яблочная кислота. Добавление способных под,действием Escherichia coli к сбраживанию углеводов, íа приме р глюкозы, фрчктозы, маннозы, мальтозы, галактозы или аминокислот DL-ралин, ПУ.-серии, L-цистеин, L-триптофан и DLнорвалин подавляет синтез, а добавление Lглютаминовой кислоты, L-аопарагиновой кис404277

3,0

6,0(рН 7,0)

0.20

3,00

0,30

0,15(рН 7,0)

0,15

0,20

2,00

1,00

0,20 лоты, DL-аланина и гликоколла способствует синтезу L-аспарагиназы.

Ка|к основа для:питательных растворов может быть использован дрожжевой экстракт.

Хорошие результаты показали следующие питательные растворы, содержащие, %..

1. Воду от замочной кукурузы (в отношении к сухой субстанции)

Молочнокислый натрий (NH4) gSO4

11. Воду от за,мочки кукурузы (в отношении к сухой су бстанции)

Молочнокислый натрий

L-r.÷þòà,ì Híîâóþ кислоту — Na

Гл,и K о колл (ЯН4) $О, I1I. Дрожжевой экстракт

Молочнокислый натрий (КН4) ISO;

Эти питательные растворы засевают куль турой с косого агара Escherichia coli АТСС

9637,и культивируют на вибрационной машине около 20 час при 30 С. Значение рН возрастает за это,время до 8,5 — 8,9.

После окончания выращивания в питательный бульон, добавляют органическое основание с молекулярным весом свыше 1000 или его соль.,В результате клетки осаждаются хлопьями н могут быть легче це нтрифугированы. После двойного суспендирования клеток в воде,их осаждают снова, добав.пяя ацетон. При этом клетки переводятся в удобную для,переработки форму,и так .изменяются, что образовавшаяся /.-аспарагиназа может быть выделена с водой из раствора в следующей ступени. Эта ступень состоит из ,по вторного отделения центрифугированием, еще одного двойного суспендирова ния,и

=-- .IñòðàöHH водой.

Из этой суспензии добавлением одной .из названных органических основ осаждают экстрагированные клетки, нуклеиновые кислоты и балластные протеины и удаляют центри фугированием. Из отстоявшегося водного ,раствора L-аспарагиназа может быть осаждена при добавлении большого количества ацетона.

Вместо ацетона для переведения клеток в другую форму и для осаждения Е;аспараги:н азы могут быть применены также другие смеши ваемые .или только ограничено смешиваемые с водой органические,растворителн (метанол, этанол, изопропанол, метилэтилкстон л диметилсульфокснд).

Относительную активность L-аспарагиназы определяют следующим образом.

15,0 см питательного,,раствора центрифуглруют, отстоявшийся раствор удаляют. Клетки бактерий повто рно суспендируют в дважды дистиллированной воде до объема 15,Осла.

Зо

3,0 сл этой суспензии клеток разбавляют

12,0 см дважды дистиллированной воды и добавляют 15,0 ся 2ОО-ного раствора L-аспарагина в 1 10 смолярном буферном растворе фосфата со значением .рН 7.

Затем добавляют 0,2 сл толуола.

Изготовленную таким образом реакционную смесь, которая содержит 1,0О/о аспарагина и 1/10 и 1/б первоначально находившегося в питательно и р аство р е концентр а та клеток бактерий (1/10. ч .или 1/6N), закрыв, резиновой пробкой, встряхивают в течение 3 час при

30 С. По истечении этого времени смесь в течение 5 мин нагревают до 100 С, снова охлаждают и центрифугируют. Отстоявшийся раствор арименяют для калориметрического определения NH3-азота с,реактивом Неслера в отношении стандартного ра створа а.ммонийсульфата. При этих условиях опыта от выросших в питательном растворе двух клеток

0,035 до 0,065 /о Х; от выросших в питательном,растворе трех клеток — 0,04 /О,N (максиli aльно отщепляемый N при содержании 1,0 /о

L-аспарагина в,реакционной смеси равен

0 01О6% У, 1) .

Чтобы получить значение относительной а ктивности L-аспарагиназы Escherichia coli умножают калориметрически определенную

N-концентрацию на фактор, разбавления,концентрации находящихся с опытной реакцион ной смеси клеток бактерий. Относительная активность /.-аспарагиназы выращенных клеToIK в,питательном растворе 1 смта вляет

0,025 (0,04) Х 10 = 0,25 (0,4); клеток, выращенных в,питательном р астворе I I—

0,035 (0,065) Х 1О = 0,35 (0,65); клеток, вы,ращенных в растворе III — 0,04 Х 6 = 0,24.

П р и м ер !. 10 /о-ный раствор замочной кукурузной |водь1 из,расчета íà eyzoe,вещество посредствам 2N раствора КОН устанавливают на значение рН 7, нагревают в течение

20 яин до 120 С и .после охлаждения освепляют в центрифуге с верхним отводом жидкости .или фильтрованием методом Зейтца.

30 л этого прозрачного раствора заимочной ку курузной воды, разбавляют водопроводной водой;в,количестве 170 л.

Для изготовления питательного раствора 1 добавляют 1,2 кг лактата натрия и 0,4 кг сульфата аммония, для изготовления питательного раствора II добавляют 0,6 кг лактата натрия, 0,3 кг 1-глютаминовой кислоты-Na, 0,3 кг гликоколла и 0,4 кг сульфата аммония.

Полученный питательный раствор стерилизуют в ферментаторе 40 мин при 110 С, затем охл ажда ют и и но кули руют 500 см выросшей в течение 18 час .при 30 С, и встря хивании:культуры Escherichia cali АТСС 9637 в питательном растворе с рН 7,0, состоящем из 1,5 О экстракта дрожжей,и 0,5ОО лактата натрия. Фер мента ционный затор при 30 С аэрируют воздухом со скоростью 80 л/мин .при 150 об!мин мешалки.

По .истечении времени роста от 16 до

18 час, когда рН,культуры повысился нрибли404277 вительно до 8,8, культуральный бульон охлаждают примерно до 20 С. Бактерии, которые содержат L-аспарагиназу, коагулируют, доба вляя 4 л 2,5Я>-ного раствора акримина R, имеющего формулу (СОЫН (СН2) 6 NiHCO — NÍ (СН2) 3 Х (СН3 — (СН2) 6 — NH)n с .молекулярным весом выше 1000, который образуется,при.,реакции обменного разложе,ния ди- (3-амино- и-пропил)-метиламина с гександиизоцианатом; затем отделяют в центрифуге с,верхним отводом жидкости и повторно суспендируют, добавляя водопроводную воду до общего объема 20 л.

В полученную суспензию клеток, размеши.вая, вливают 80 л ацетона, добавляют 20 см

25%-ного акрамина R, отделяют выпавшие бактерии в центрифуге с,верхним отводом жидкости .и клеточную массу повторно суспендируют в:водопроводной воде,,добавляя ее до общего объема 20 л.

Для экстракции .из клеток бактерий L-аспарагиназы суспензию размешивают в течение 4,5 час при ЭО С. В течение этого времени посредством добавки 1N патронного щелока ил и 10%-ной уксусной кислоты поддерживают рН на значении. 7,5 — 7,8. Затем охлаждают до 20 С.

:В экстрагированную клеточную суспензию,,размешивая, вливают 5 л 2,5%-ного акрами.на R è отделяют в центр и фуге с верхним отводом жидкости образовавшийся сильный осадок, состоящий .из экстрагированных бактерий и нерастворимого «основания» — комплекса нуклеиновой кислоты,и протеина. Осадок выбрасывают. Получают приблизительно

17 л,прозрачного .раствора, в котором наряду с другим и содержащимися в клетках матери алами находится L-аспараг,инала.

Из полученного раствора, добавляя 68 л ацетона, осаждают сырую L-аспарагиназу.

Образовавшийся осадок изолируют, промы вают ацетоном и просушивают в вакууме при

25 — 80 С. Получают пр иблизительно 100 г сырой L-аспарагиназы с активностью приблиз ительно 3,3 (при применении питательного раствора I) .или 4,0 — 5,5,ин. ед. на 1 мг (при применении питательного раствора II). При применении питательного, раствора 111,сырая

L-аспарагиназа содержит приблизительно

2,5 ин. ед..на 1 мг.

Пример 2. KBTzoHQBIKTHBHbIfI крахмал является .высокомолекулярным продуктом с молекулярным .весом свыше 1000, который образуется при реакции обменного разложения,крахмала с .гидрохлоридом р-диалкиламиноэтилхлорида.

10 $-ной,раствор замочной .кукурузной воды (из расчета на сухое вещество) посред:ством 2N,pacIaopa едкого калия устанавливают на значение рН 7, нагревают 20 мин до

ЯС

120 С и после охлаждения осветляют в центрифуге с верхним отводом жидкости,или фильтрованием методом Зейтца. 30 л этого прозрачного раствора замочной кукурузной воды разбавляют 170 л водолроводной,воды.

Для изготовления питательного раствора

1 добавляют 1,2 кг лактата натрия и 0,4 кг сульфата аммония, для,изготовления, питательного раствора II добавляют 0,6 кг лактата натрия 0,3 кг L-глютаминовой кис.тоты Na, 0,3 кг гликоколла и 0,4 кг сульфата аммония.

Полученный питательный, раствор стерилизуют в ферментаторе 40 мия при 110 С, затем охлаждают,и,инокулируют 500 см выросшей в течение 18 час при 30 С, и встряхивании культуры Escherichia coli АТСС 9637 при значен ии рН 7,0, состоящем из 1,5% экстракта дрожжей,и 0,5% лактата натрия.

Фер ментац ионный затор при температуре

30 С, аэрируют воздухом со скоростью

80 лlмин,при 150 об мин мешалки.

По истечении времени роста от 16 до

18 час, когда рН культуры повысился приблизительно до 8,8,культуральный бульон,охлаждают примерно до 20 С. Бактерии, которые содержат L-аспарагиназу, коагулируют посредством добавки 2 л 2,5 jp-ного раствора катионоактивного .крахмала, отделяют в центрн,фуге с верхним отводом жидкости .и повторно суслендируют, добавляя водопроводную воду до общего объема 20 л.

В полученную суспензию,клеток,,размешивая, вливают 80 л ацетона, добавляют 20 смР

2,5% -ного раствора катионоактивного а рахмала, отделяют выпавшие бактерии в центрифуге с верхним отводом жидкости,и клеточную массу повторно суспендируют iB водопроводной, воде, добавляя ее до общего объема

20 л.

Для экстракции из клеток бактерий L-аспарагиназы полученную суспензию размешивают в течение 4,5 час при 30 С. В течение этого времени посредством, добавки 1Х натронного щелока,или 10%-ной у ксусной кислоты поддерживают рН 7,5 — 7,8. Затем охлаждают до 20 С.

;В экстрагированную клеточную суспензию, размешивая, вливают 5 л 2,5%-ного катионоактивного крахмала .и отделяют в центрифуге с верхним отводом жидкости образовавшийся сильный осадок, состоящий из экстрагированных бактерий и нерастворимого «основания»вЂ” комплекса нуклеи новой кислоты и протеина.

Осадок выбрасывают. Получают,приблизительно 17 л прозрачного раствора, в котором наряду с другими содержащимися в клетках материалами находится L-аспарагиназа.

Из полученного раство|ра, добавляя 68 л ацетона, осаждают, сырую L-àñïàðагиназу.

Образовавшийся осадок изолируют, промы.вают ацетоном и просушивают в вакууме при

25 до 30 С.,Получают приблизительно 10О г сырой 1-аспарагиназы с активностью приблизительно 3,0 (при применении питательного раствора I) или 4,0 — 4,5 ин. ед. на 1 .яг (при

404277

П р е д м е т и з о б р е т е.н и я

Составитель В. Дуиье

Техред 3. Таранеико

Корректоры В. Брыксина и В. Жолудева

Редактор А. Бер

Заказ 214 Изд. № 201 Тираж 467 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открыз ий

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Тип. Харьк. фил. пред. «Патент» применении,питательного раствора I I) При применении, питательного раствора III сырая

L-аспарапиназа содержит приблизительно

2,5;ин. ед. на 1 мг.

iH р,и м е р 3. 10%-ный раствор замочной кукурузной воды (из,расчета на сухое вещество) посредством 2N раствора едкого калия устанавливают на значение рН 7, нагревают в течение 2О мик,до 120 С и после охлаждения осветляют в центрифуге с вер хн1им отводом жидкости .или фильтрованием,методом Зейтца. 30 л этого:прозрачного раствора заимочной ,кукурузной воды разбавляют 170 л водопроводной;воды.

Для,изготовления питательного раствора I добавляют 1,2 кг лактата натрия и 0,4 кг

c ëöôàòà аммония.

Для изготовления питательного раствора Il добавляют 0 6 кг лактата натр ия, 0 3 кг

L-глют амино вой кислоты-Na 0,3 кг гликоколла и 0,4 кг сульфата аммония.

Полученный питательный раствор стерилизуют в ферментаторе 40 мин при 110 С, затем охлаждают и инокулируют 500 см выросшей в течение 18 час при ЗО С,,и встря хива и им культуры Escherichia coli АТСС 9637 при значении рН 7„0, состоящем из 1,5% экстракта дрожжей и 0,5% лактата натрия.

Ферментационный затор при 30 С аэрируют воздухом со скоростью 80 л)мин ври скорости вращения мешалки 150 об!ьиин.

По истечении .времени .роста от 16 до

18 час, когда,рН культуры повысился .приблизительно до 8,8,,культуральный бульон охлаждают примерно до 20 С. Бактерии, .кото,рые содержат Z,-аспарагиназу, хоагулируют посредством добавки 1 л 2,5% -ного раствора основания

f — МН вЂ” (СНг) 3 — N — (СН2) 3 NH — (СН2) 3)n!

СНз с молекулярным весом свьгше 1000, который образуется .при,реакции обменното разложения ди-(3-амина-и-пропил1- метилам ина с,эпихлоргидрином; отделяют в центрифуге с верхним отводом жидкости, IH повторно суспендвруют, добавляя:водопроводную воду до общего объема 20 л.

Для экстраици и из клеток бактерий L-ас парагиназы полученную суспензию размешивают в течение 4,5 час при 30 С.,В течение этого времени посредством доба вин IN натронного щелока или 10%-ной уксусной кислоты поддерживают рН на значении 7,5 — 7,8.

Затем охлаждают до 20 С. В экстрагированную клеточную сус пензию, размешивая, вливают 2„5 л 2,5%-ного раство,ра основан ия и отделяют ia центрифуге с верхним отводом жидкости о бразовавшийся сильный осадок, состоящий из экстрапированных бактерий и нерастворимого основания-комплекса нуклеиновой кислоты и,протеина. Осадок выбрасывают. Получают, приблизительно

17 л прозрачного раствора, в котором наряду с др угими содержащимися в клетках, материалами находится L-аспарагиназа.

Из полученного, раствора посредством добавки 69 л ацетона, осаждают L-аспарагиназу, Образовавшийся осадочек изолируют, промывают ацетоном и .просушивают в вакууме при

25 — 30 С. Получают цри близ ительно 100 г сырой L-аспарагиназы с активностью приблизительно 3,3 (при применении питательного раствора I) или 4;0 — 4,5 .ин, ед. на 1 мг (при применении питательного раствора II), При применении питательного раствора ПI сырая

L-аспарагиназа содержит;приблизительно

2,5.ин. ед. на 1 мг.

Способ выделения L-аспарагиназы из культуральной жидкости, полученной при культивировании Escherichia coli, предусматривающий осаждение L-аснар агиназы органическим раство рителем, напр имер ацетоном, отличаюи1ийся тем, что, с целью более полного выделения фермента, перед осаждением L-acnapa пиназы органическим растворителем,,про изводят осаждение клеток Escherichia coll в виде хлопьев .из к ультуралыной жидкости добавлением в нее органического основания с молекуJIHpiHbIM весом более 1000 или его соли с последующим отделением клеток, напр имер, центрифугированием,и экстрагирован ием водой, а добавление органического растворителя осуществляют в полученный экстракт.