Способ вьщеления ферментовпротеолитических

 

Ф ° Ф

Взамен ранее изданного

Союз Соввтских

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 13,01,72 (21)1737418/28-13 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 05. 10.77 Бюллетень №37 (45) Дата опубликования описания 21.11.77 (11 412248 (51) М. Кл.

С 12 D 13/10

Гааударстеенный намнтет

Савета Мнннатрав СССР па делам изабретеннй и аткрытнй (53) УДК577.15.07 (088.8) В. Г. Кирсе, С. Я. Скуиня, Р. Я. Радзинь, А. А. Пинне, A. М. Ирген, н р, Э, Эвирбуле (72) Авторы изобретения

Латвийский филиал Всесоюзного научно-исследовательского института химических реактивов и особо чистых химических вешеств (71) Заявитель (54) СПОСОБ ВЬДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕ< КИХ

ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к ферментной пр ом ышле н нос ти, в час тнос ти к с и ос обам выделения ферментов из микробиологичеа к огo сырья, а им е н н о из мицели я плесневых грибов, 5

Известны способы выделения протеолитических ферментов из мицелия нлесневых грибов или нз культуральной жидкости, полученной при культивировании плесневых грибов, таких как

AepergiBue niger, AepeririBus ergeae, Аарвгд hfus aAApamorf. Мраг1т Ииа 5a.vue, Аа г itue fumi atue. Aeper iR цб 00 Вцф. $5pfr g A Us sgLÏoi, А pcrgietus tarPitoaa ° y.(ij

11елью изобретения является расширение сырьевой базы для получения протеолитических ферментов.

Для достижения псставленной цели выделение ферментов осушествляют измицелия грибов вида Asp6rg (Ио теггюоа, полученного при производстве итаконовой кислоты. целесообразно экстракцию фермента осушествляют буферным раствором при рН 4,0>,0 и т" л ier атуре 0 — С.

Способ выделения ферментов заключае ся в следуюшем.

Отделенный от питательной среды мицелий

АарещЖоа 1еттаОз, культивируемый для получения итаконовой кислоты, промывают водой обО Ф рабатывают ацетоном при 0-5 С, высушивают и измельчают; затем экстра гируют фермент фосфатнымили ацетатным буфером при р Н 4,0-8,0 и температуре 0-8 С, при этом соотношении мицелия к буферному раствору устанавливают р авным 1;6, Из полученного экстракта осаждают фер менты, осадок отделяют центрифугированием при 0-8 С и . высушивают.

В качестве осадителей ферментов исполь-. зуют сернокислый аммоний (при насышении

30-657), метанол, этанол, изопропанол, при этом соотношение экстракта и осадителя

Пример 1, 0,6 кг 14-дневного мипелия отделяют or питательной среды, промывают два ра. а водопроводной водой, затем деминерализованной водой, Мицелий отсушивают фильтровальной бумагой и обрабатывают 3 раза 10 л холод412248 ного ацетона (5 С). Отделяют ацетон, мио целий высушивают в течение 1 ч. Воздушносухой мицелий размельчают, и проводят экс ракцию 0,1М раствором буфера (рН 7,6) в течение 2 ч при 5 С. Отделяют твердую фазу, белок осаждают сернокислым аммонием при 65%-ном насыщении, Диализуют и лиофильно высушивают. Выход: 1,36 г, активность при рН 1,4-7,1 1 ед/г препарата—

17,5 ед/г белка. о

Пример 2. 0,4 кг 12-дневного мицелия отделяют от питательной среды, промывают водопроводной водой два раза и окончательно - деминерапиэованной водой.

Отжимают и обрабатывают 3 раза 10 л о холодного ацетона при 5 С. После отделения ацетона мицелий высушивают и проводят аксгракцию 0,1М фосфагным буфером с рН 7,6 в течение 2 ч при 5 С. Отделяют о твердую фазу, осаждают белок сернокислым аммонием при 40%ном насыщении.

Диализуюг и лиофильно высушивают.

Выход: 0,15 r препарата с активностью: при pH - 1,4 13 ед/г белка - 5 ед/г препарата при рН - 7,5 13 ед/г белка - 5 ед/г препарата.

Пример 3. 0,4 кг 12-дневного мице- о лия отделяют от питательной среды, промывают водопроводной водой (два раза) и окончательно деминерализованной водой. Мицелий отжимают и 3 раза обрабатывают 10 л холодного ацетона. Отделяют ацетон, мицелий высушивают и проводят аксгракцию 0,1М фосфатным буфером (рН 7,6) в течение 2 ч при 5 "C. Отделяют твердую фазу, осаждают белок сернокислым аммонием при 65%-ном насыщения. Диалиэуюг и лиофильно высу- 4о шивают;

Выход; 0,41 г препарата с активностью; при рН - 1,4 12,3 ед/г белка - 7,6 едlг препарата при рН - 7,5 9,5 ед/г белка - 6,6 ед/г 45 препарата.

П р и M е р 4. 0,6 кг 16-дневного мицелия отделяют or питательной среды, промывают ilaa раза водопроводной водой, затем деминерализованной водой. Отжимают мицелий.и обрабатывают 3 раза 11 л холодного ацетона, отделяют ацетон, мицелий высушивают на воздухе под тягой 1ч, размельчают и проводят экстракцию в 0,1 M фосфатном буфере рН 8, при 8"С в течение

2 ч. Отделяют твердую фазу, осаждают белок атиловым спиртом. Иентрифугируют при пониженной температуре. Осадок растворяют и лиафильно высушивают.

Выход: 1,1 г препарата с активностью; при рН-1,4 16,1 ед/г белка — 6,6 ед/г препарата при рН - 7,5 19,3 ед/г белка - 6,9ед/г препарата.

Пример 5. 0,4 кг 12-дневного мицелия отделяю т or пи тательн ой среды, прсьмываюг водопроподной водой (два раза) и окончательно — деминерализованной водой, мицелий отжимают и обрабатывают три раза холодным ацетоном. Отделяют ацетон и мицелий высушивают в вытяжном шкафу под тягой 1 ч. Размельчают и проводят экстракцию в ЗМ ацетагном буфере при рН 5,4 и 3 С в течение 4 ч. Отделяют твердую фазу, осаждают белок метанолом, центрифугируюг и осадок лиофильно высушивают.

Выход: 0,95 г препарата с активностью: при рН-1,4 19,6 ед/г белка - 5,0 ед/г препарата при рН - 7,5 13,0 ед/г белка — 7,3 ед/г препарата.

Пример 6. 1,2 кг 12-дневного мицелия отделяют от питательной среды, промы.вают 2 раза водопроводной водой и деминерализованной водой. Затем мицелий обрабатывают три раза холодным ацетоном с температуо рой 0 С. Отделяют ацетон и мицелий высушивают в вытяжном шкафу на воздухе под тягой, размельчают и проводят эксгракцию в 0,1 М фосфатном буфере при 3 С.

Отделяют твердую фазу, осаждают белок изопропиловым спиртом, центрифугируют, оса« док растворяют, диализуюг и лиофилизируют.

Выход: 5,6 препарата с активностью: при рН-1,4 30 ед/г белка — 9,6 ед/г препарата при рН - 7,5 20 ед/г белка — 8,2 ед/г препарата.

Пример 7. 0,2 кг 4-дневного мицелия отделяют от питательной среды, 2 раза промывают водопроводной водой, затем деминерализованной водой Мицелий отжимают и обрабатывают 3 раза 5 л холодного ацегона. Отделяют ацетон, и мицелий высушивают в вытяжном шкафу под тягой. Отделяют твердую фазу, осаждают белок этанолом, ценгрифугируюг при 5оС и осадок лиофилизируют.

Выход: 0,45 r препарата с активностью: при pH - 1,4 23,8 ед/г белка — 8,4 ед/г. препарата.

Ф ормула из обре re ния

1. Способ выделения прогеопитических ферментов из плесневых грибов, предусматривающий экстракцию и осаждение Из них

412248

Составитель Т. Серебренников

Редактор П. Горькова Техред М. Uyrra Корректор С. Гарасинии

Заказ 4086/44 Тираж 541 Подписное

БНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-Э5, Раушская наб,, д. 4/6

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ферментов, отличаюшнйся тем, что, с целью расширения сырьевой базы, выделение ферментов осушествлиют из мицелия грибов видаМ йтфИм terreus, полученного при производстве итаконовой кислоты.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а num и и с я тем, что екстракцию фермента осушест вляют буферным раствором при рН 4,0-8 0 и температуре 0-8 С.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Сборник докладов на Всесоюзной конференции Внедрение ферментных препаратов в народное хоэяйс зо . Ч 1, М., 1961 с. 49.