Способ обработки биологических образцов для криоультратомии

 

Союз Советсиии

Социалистическими

Республик опт ие

Й ЗОБ РЕТ Е К Й" (>1) 557288 и АВТОРСИОМУ СВ 4ДИЕПЬ (,"ХВУ (61) Дополнительное к авт. свил-ву (22) Заявлено08.09.75 (21)2170786/13 с присоединением заявки Ме— (23) Приоритет (43) Опубликовано05.05.77, Бюллетень N 17 (45) Дата опубликования описания30.06.77 (51) М. Кл.о 01 М 1/28

Госудерстоеииый комитет

Совета Миииотров СССР по делам иэобретеиий и открытий (53) УДК 615.475 (088.8) (72) Авторы изобретения

E. Я, Панков, А, С, Капрельяпц, В, С. Журавлев, И. И. Чемерис и В. А. Кобыляков

Институт проблем криобиологии и к"помедицины

АН Украинской ССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОБРАБОТКИ БИОЛОГИЧЕСКИХ OBPABUOB ДЛЯ

КРИО ЛЬТРАТОИИИ

1

Изобретение относится х области медицины и может найти применение в криобиологии для изучения функциональной анатомии ультраструктуры клеток и тканей.

Известен способ обработки биологических образцов для криоультратомии путем фиксации образца, пропитки его желатиной, капсулировм|ия в желатине, обработки криопротектором и замораживания (1).

Однако известный способ является длительным и не обеспечивает получение ультратонких срезов.

Целью изобретения является уменьшение артефактов при резке срезов.

Эта цель достигается тем, что в качестве криопротектора используют полиэтиленоксид-400 и обрабатывают образец вначале

50-60 ным его раствором и затем чистым полиэтилепоксидом-400 нри комнатной температуре с последующим охлаждением со скоростью 1 град/мии до температуры о

-5 -10 С, а затем со скоростью 9001000 глад/сок до а пературы -120

- 150 С.

Способ осутцествляют следующим образом. Перед нэ»чалом обработки ткань режут па образцы объемом пе более 1 мм . Затем с целью сохранения морфологической и химической структуры ткани ее фиксируют. Для фиксации применяют глутаральдегид илп четырехокись осмия в зависимости от пели исследования. После этого промывают в фосфатном буфере в течение 11-12 час при температуре 2-4 С. Затем образец о пропитывают в 2-2,5%ном растворе желатины в течение 1-1,5 час при температуре

36-37 С и заключают в 2-2,5 /-ный рас о вор желатины при температуре 2-4 С. Затем образец обрабатывают полиэтиленоксидо -400 в 50-60%-ном растворе в течение 15-20 имн при комнатной температуре, затем в 100%-ном растворе полиэтиленоксида-400 в течение 25-30 мин при той же температуре.

Затем образец примораживают к съемному столу путем медленного охлаждения со скоростью 1 град/мин до температуры

-5 -" -10 С, а, начиная с этой температуры, ск:. pость за к(111. ) жива|и! я резко увели Ивают о5 /288

Составитель С. Малютина

Редактор О, Иванова Техред И. Асталощ Корректор А. Гриценко

Заказ 840/56 Тираж 1101 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„д, 4/5

Филиал ППП Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 до 900 1000 грац/сек и таким образом образец охлаждают до температуры -120+ .нь 150 С»

Пример . Биологическую ткань (роговицу глаза человека) перед началом обработки режут на образцы объемом 1 мм.

Затем образец фиксируют глутаральдегидом (5%-ный раствор в 0,1 М фосфатном буФеур в течение 1 час при температуре

13 С). Затем образец пропитывают в 2%ном растворе желатины в течение 1 час о прн температуре + 37 С и заключают в

2%-алый раствор желатины при температуре

+ 3 С. После этого образец обрабатывают о полиэтиленоксидом«400 в 50% ном растворе в течение 15 мин при комнатной температуре, затем. в 100%-ном растворе полиэтиленоксида-400 в течение 30 мин при. той же температуре. После этого образец примораживают к съемному столику путем медленного охлаждения со скоростью 1 град/мин до- температуры -50Ñ, а, начиная с этой температуры скорость замораживания резко увеличивается до 1000 град/сек и такиом образом образец охлаждают до

-150 C».

Предлагаемый способ обработки биологических образцов полиэтиленоксидом-400 при двухэтапном режиме охлаждения обеспечивает повышение эластических, свойств

Мобразца, вследствие чего получают ультратонкие высококачественные серийные срезы необходимой, толщины, что необходимо для выполнения качественного электронно-микроскопического исследования.

Формула изобретения щ Снос 5 обработки биологических образ цов для риоультратомии путем фиксации образца, пропитки его желатиной, капсулирования в желатине, обработки криопротек тором и замораживания, о т л и ч а ю— у шийся тем, что, с целью уменьшения артефактов при резке срезов, в качестве

1 криопротектора используют полиэтиленоксид

400 и обрабатывают образец вначале 5060%-ным его раствором и затем чистым

20 полиэтиленоксидом-400 при комнатной теььпературе с последующим охлаждением со скоростью 1 град/мин до температуры (-Е)фд.0 С, а затем со скоростью 900-1000 град/сек до температуры f-120) е

25 (-150, С.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

f.Reed я-"Frееz,eetched co ec ve %issue -3zt. Реч.cow ect ve Т ssue

30 Res. vn8-6, d4 - 1o c1on,1973,р.25 7-303.