Способ получения полирибонуклеотидов

 

О П И С А Н И Е (iiie012S7

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союэ Советских

Социалистических

Ресяублик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6)) Дополнительное к авт. санд-ву— (22) Заявлено 12.05.76 (21) 2363256/23-04 (5f л. с прис единением заявки Ит

С 07 Н 21/02

Гваударатнннний наинтат

Фаветв Мнннатраа СССР. на делан наааратаннй а атнрнннй (23) Прйоритет

{43) Опубликовано 05.04.78. Бюллетень М 13 (45) Дата опубликования описания 15.03.78 (53) УЙК 547.963.3 (088.8) (72) Авторы изобретения

EI. Э. Гравите, И, А. Шмите, M. Я. Хейслере и С. Э. Ансберга (7l) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИРИБОНУКЛЕОТИЛОВ

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения соединений, ко горые находят широкое применение в биологии и медицине.

Известны способы получения полнрибонуклвотидов биохимическим синтезом из рибонуклеотид-5 -дифосфатов. Конденсацию проводят с использованием фермента полирибонуклеотидфосфорилазы (ПНФ) . Источником фермента служат микроорганизмы: Мi ct осо- )p

cus Ь воде МБсив, Azotobacter рте Pcxndpi, E cbevi cbia соРт.ИЗ и С22 .

К предлагаемому способу наиболее близок по технической сущности и достигаемому результдту известный способ получения )5 полирибонуклеотидов путем биохимической поликонденсации рибонуклеозид-5-дифосфата л в присутствии фермента ПНФ, выделенной из Евсее сЬ а coR<. .По такому способу биосинтез прот зкает 20 при температуре около 60 С в течение 5 ч.

Очистку полученного продукта реакции проводят фенолом и смесью изоамилового спирта с хлороформом (1:2,5) с последующим диализом против 0,2 М раствора хлористого иа Л рия, содержащеГо 0,001 моль ЭДТА или офнлизацней целевого продукта. Выход 50%.

Недостаткамй этого способа являютсясложность процесса очистки синтезированного полирибонуклеотида от ферментных белков при использовании фенола, изоамилового спирта н хлороформа, а также недостаточно высо;1 кий выход, поскольку часть рибонуклеоэид-5-дифосфатов, не вступившая в реакциюбеэ-возвратно теряется при очистке целевого продукта.

С целью упрощения процесса, а также повышения выхода целевого .. продукта по предлагаемому способу реакционную смесь после достижения равновесия реакции последовательно подвергают взаимодействию с гелем g --42(ОН ),предварительно обработанным трис-НС1 буфером, а затем с ионообменной смолой, содержащей, группу — Х

-(CH ), для разделения целевого продукта

3 и не вступивших в реакцию рибонуклеозид-5-дифосфатов, которые повторно возвращают в процесс.

Предлагаемый способ заключается в том, что рибонуклеозид-5-дифосфаты подвергают

3 биохимической поиикоденсации в присутствии поиирибонуклеотидфосфориивзы, выделенной иэЕьспЕг(сЬ|а eoPt при 55-65 С и реакционную смесь после достижения равновесия реакции последовательно подвергают взаимодействию с гелем g 4И(ОН), предварительно обработанным тряс-НС1-буфее ром, а затем и ионообменной смолой, содержащей группу - N -(СН ) . 22елевой продукт выделяют лиофилизвцией. 10

Обычно соотношение гель g А1: (OH)>.. реакционная смесь составляет 1:1. РибоФ нукиеоэид-5-дифосфаты, не вступившие в реакцию, как правило, повторно возвращают в процесс. Суммарный выход 74%. 15

Введение геня g - +g(OH)> в процесс)

-в момент достижения равновесия реакции конденсации иии накопления фосфатов до

50-60% обеспечивает стабилизацию равновесия реакции, устраняет обратный процесс 20 деконденсацни с одновременной адсорбцией на поверхности геля ферментных белков.

Предварительная обработка геля 0,01 M трис-HC -буфером повышает специфическую адсорбционную сйособность геля и ускоряет И процесс адсорбции до 5-10 мин. Адсорбированные на геле ферментные белки удаляют центрифугированием.

Использование ионообменной смолы, содержащей группу — )(-(СН ) позволяет 30 выделить не вступившие в реакцию рибоf. нукиеоизид-5-дифосфаты и повторно вернуть их в процесс, что повышает выход целевого продукта на 12-14%.

Пример 1. 125 мг адеиозин-5- Зб дифосфата (А-5-Дф) растворяют в 5 мл воды, к раствору приливают 1,5 ми 1М тряс-

° НС1 (pH 8,1), 0 15 ми 0,05 М раствора ,ИЯ (CHj COO)<,25 ед. фермента ИНФ изЕьсЬеesca i а со 0 j и воду до 15 мл. Биосинтез проводят при 60 С. 3а ходом полимеризации . о следят по приросту неорганического фосфата. Реакцию заканчивают через 2,5-3 чвс, Прирост неорганического фосфата при этом достигает 55% — момент равновесия реакции. 5

В реакционную смесь вводят -А1(ОН} в

0,01 М трис-НС1-буфере (pH 7,5) до исчезновения фиолетовой окраски по биурету (1:1 ). .После центрифугирования полученный раствор разделяют на ионообменной смоле

APA-5, элюцию проводят 0,015 н. раствором соляной кислоты и 0,025 н. раствором ,хлористого натрия. Фракцию поиинуклеотида цоспе диалиэа лиофиииэуют. Фракцию А — 5

Х

ДФ осаждают 10 объемами этилового спирт та. получают 60 мг поли-А (52%) и 22 мг

А-5 - ДФ(25%) или 1 2% поли-А дополнительно. а а 163714

661287

Й р и м е р 2. 125 мг уридин-5-дифосА фата (У..5 ДФ) растворяют в 5 мл водй, к раство ру приливают 1,5 мл 1 М трио-НС l (pH 8„1 ), l,5 мл 0,05 М раствора Ю ф (С Н С ОО H ), 125 ед. фермента ПНФ и воду до 15 мл.

Биосинтез и очистку проводят в .условиях примера 1. Получают 50% поли У и 20%

У-4» -ДФ (или 12% поли-У), Пример 3. Проводят биосинтез шоли-.А поликонденсацией А-5 ДФпо примеру 1Яос ле отцентрифугирования адсорбированного белка на геле g At(OH) .полученный раствор разделяют нв ионообменный смоле БАК.

Элюцию A-5-ДФ проводят 0,02 М раство2 ром упористого натрия и 0,01 М раствором соляной кислоты. Фракцию поииаденозина после дивииза ииофилизуют, фракцию А-5 -ДФ осаждают 10 объемами этилового спирта. Получают 60 мг поли-А (52%) и 22 мг

А-5-Дф (иии 12% поли-А).

Пример 4. Проводятбиосинтезполи-У по примеру 2. После центрифугирования полученный раствор разделяют на ионообмен-! ной смоле 2) -1. Зиюцию У-5-ДФ проводят орех

0,2 н. раствором соляной кислоты. Фракцию поли-У после диализа ииофииизуют, фракцию У- б -ДФ осаждают. 10 объемами

1 этилового спирта. Поиучают 52% поли-У и 25% У-5 -ДФ (иии 12% поли-У).

Формула изобретения

1. Способ получения поиирибонукиеотидов путем биохимической поликоденсации рибо- к ф нукиеоэид-5 — дифосфатов в присутствии по лир нбонук иеоти дфосфори лазы, выде пенной изЕьсЬег(сна со6 при 55-65 С, с последующей ииофилизацией готового продукта, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с цепью упрощения процесса и увеличения выхода целевого продукта, реакционную смжь пос; ле достижения равновесия реакции последова- . тельно. подвергают взаимодействию с гелем .Я-. А 1 (OH)>, предварительно обработанным трис-НС1-буфером, .а затем с ионообменной смолой, содержащей группу — $ —.(СНй)

2. Способ по п. 1, о т и и ч а ю- . шийся тем, что соотношение гель - А E (0H) .реакционная смесь составляет f .l

3. Способ по и. 1, о. т л и ч а юшийся тем что рибонукиеозид-5 — ди7

1, фосфат, не вступивший в реакцию, повторно возвращают в процесс.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Микельсон А. Химия нуклеоэидов и нуклеотидов М., 1966, с. 315-323.

2. Авторское свидетельство СССР

¹ 401667, кл. С 07 Н 21/02, 1974. ираж 559 Подписное филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4