Способ изготовления препаратов зародышевых мешков растений

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

CoIos Советских

Социалистических

Реслу блик

<и>689643 (61) Дополнительное ает. сеид-ву (22) Заяелеио09,1177 (21) 2543332/30-15 с прнсоединением заявки М (23) Приоритет

ОлублнкоеанОО 310.79, Бюллетень Но37

Дата опубликования описания 0 1029 (53)М. Кл.

А 01 G 7/00

G N 1/28

Государственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий (53) УДК 81,6:578. а6 (088.8) (72) Авт ы ор

ИЗОбрЕтЕИИя, М. П.Солнцева и В. П. Левковский (71) Заявитель (54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ

ЗАРОДЬЫЕВЫХ МЕШКОВ РАСТЕНИИ

1О

Изобретение относится к области микроскопической техники и может быть использовано при приготовлении наглядных пособий для школ, техникумов и вузов, а также в сельском хозяйстве для интенсификации генвтико-селекционных работ и в научных учреждениях ботанического профиля для ускорения научных исследований.

Известен способ выделения зародышевых мешков растений путем мацерации тканей. Его сущность сводится к мацерации фиксированных семяпочек ферментами желудочной железы улитки, нарушению целостности окружающих тканей путем использования специальных мешалок и центрифуг, последующему окрашиванию взвеси в пробирках ацетокармином и изготовлению .временных препаратов (1).

Этот способ изготовления препаратов целых зародышевых мешков имеет ряд недостатков: препараты являются временными, т.е. пригодными лишь и кратковременному использованию (в течение 2-3 недель); требуется применение специальной аппаратуры — центрифуг, мешалок, электромоторов и т.п.; в процессе центрифугирования часть зародышевых мешков неизбежно подвергается механическим повреждениям и только несколько десятков их остаются целыми; на препарате получается суспензия соматических клеток и зародышевых мешков, что мешает изучению зародышевых мешков; препараты не являются контрастно окрашенными

Наиболее широко распространенным в эмбриологических исследованиях является способ приготовления микротомных (разрезанных на ряд срезов), постоянных препаратов (2).

Данный способ Заключается в следующем. Исследуемый материал (чаще всего завязи или семяпочки) фиксируют, например ГАА (формалин, спирт, уксусная кислота), промывают от фиксатора 70%-ным спиртом, обеэвоживают спиртами повышающейся концентрации от 70 до 100%, далее спирт замещают хлороформом или ксилолом для последующей пропитки исследуемого ма689643 териала парафином, которую проводят в термостате в течение 7-10 суток.

Пропитанный парафином материал охлаждают, монтируют в парафиновые блоки и режут на микротоме на ряд тонких срезов, которые монтируют 5 на предметных стеклах и сушат в термостате в течение 1-3 суток. Высушенные срезы, смонтированные на предметном стекле, окрашивают, для чего,. предварительно с них удаляют парафин ксилолом, ксилол спиртом и срезы промывают водой. Окрашенные препараты обезвоживают 100%-ным спиртом, обрабатывают ксилолом, заключают в канадский бальзам и закрывают покровным стеклом.

К недостаткам укаэанного способа относятся черезвычайная длительность и трудоемкость (при максимальной скорости работы готовый препарат можно получить лишь через 16-18 суток), невозможность получения целых зародьпаевых мешков растений, так как при резке исследуемого материала на микротоме зародышевый мешок оказывается разрезанным на несколько частей, что затрудняет его исследование под микроскопом.

Целью изобретения является ускорение и упрощение изготовления препаратов целых зародышевых мешков растений (контрастно окрашенных в массовом количестве}.

Указанная цель достигается тем, что окрашивание исходного материала осуществляют непосредственно после 35 фиксации и промывки, а после мацерации препарирование семяпочек проводят путем надрыва их кутикулы и извлечения зародышевых мешков, последние

1 переносят капилляром на фильтровальную бумагу, помещая ее на предметное стекло, а обезвоживание этанолом и обработку их ксилолом производят путем прокапывания .

Для эакрепленйя зародышевых мешков на месте во время обезвоживания их кладут на отрезок фильтровальной бумаги, расположенной горизонтально на предМетном стекле.

Для сохранения целостности пропитанных ксилолом зародышевых мешков при переносе на чистое предметное стекло зародыш вые мешки собирают прикосновением к ним капли густого (тянущегося ) канадского бальзама, расположенной на конце тупой

55 препаровальной иглы, и последующим погружением этой капли с объектом в ксилол, нанесенный на предметное стекло.

Для отделения зародышевых мешков иэ суспензии соматических клеток в цитазу помещают каплю воды и переводят зародышевые мешки из цитазы в воду при помощи препаровальной иглы,65

Указанные отличия позволяют исключить применение специальной аппаратуры — микротомов, термостатов, центрифуг и т.п., ряд операций и часть реактивов (например, замену спирта хлороформом или ксилолом, пропитку материала парафином, резку на микротоме) и, следовательно, ускорить процесс (не 16, а 4 суток), упростить его, снизить трудоемкость изготовления препаратов, избежать нарушения целостности зародышевых мешков раотений и освободить их от соматических клеток.

Кроме того, эти отличия позволяют обезвоживание и окраску проводить в пробирках, а не на предметных стеклах, что уменьшает расход реактивов и позволяет одновременно обработать большое количество зародышевых мешков, которые могут монтироваться на одном предметном стекле.

Проведение окраски по Фельгену непосредственно после фиксации u ripoмывки исходного материала дает возможность окрасить зародьпаевые мешки внутри целых неразрушенных органов растений, что предотвращает возможность порчи и потери исследуемого объекта при его микроскопических размерах.

Использование фильтровальной бумаги при обезвоживании и мацерации позволяет закрепить микроскопические зародьпаевые мешки на предметных стеклах без помощи специального клеящего вещества.

Пример. Материал фиксируют фиксатором ГАА, промывают и хранят в 70%-ном спирте, Фиксированные колоски или цветки в пробирках промывают 4-5 ч дистиллированной водой при комнатной температуре. Затем проводят холодный гидролиз. В первой пробирке в 1 н. соляной кислоте материал выдерживают 1 ч и в 5 н. соляной кислоте — 1,5 ч, во второй в

1 н. соляной кислоте выдерживают

1 ч. После гидролиза материал помещают в реактив Шиффа и выдерживают 16-17 ч в холодильнике при о

2-4 С, промывают водопроводной водой

3-4 ч, подкрашивают гематоксилином

Эрлиха Или другими красителями (время подкраски устанавливают опытным путем в зависимости от концентрации красителя), промывают дистиллированной водой 1-2 ч, вселяют завязи (т.е. часть цветка, внутри которой располагается семяпочка с зародышевым мешком и соматическими клетками), помещают в концентрированный фермент цитаэу на предметное стекло с углублением и оставляют на 24 ч во влажной камере чашки Петри при комнатной температуре.

Мацерированный материал переносят

:.а предметное стекло. Препарируют .под

689643

Формула изобретения

Составитель М. Дранишников

Редактор Т. Uàðãàíîâà Техред М. Келемеш корректор Ю.Макаренко

Заказ 5808/1 Тираж 755 Подписное

ЦИНИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113835 Москва, Ж-35д Раушская наба< д 4 5

Филиал ППП Патент, г, Ужгород, ул. Проектная,4 бинокулярной лупой. Наружную оболочку семяпочки осторожно надрывают тонко отточенными препаровальными иглами и зародышевый мешок вычленяют из

* семяпочки вместе с частью соматических клеток. Затем в суспензию клеток в цитазе вводят 1-2 капли дистиллированной воды. Соматические клетки, удерживаемые остатками цитазы, остаются на стекле. Зародышевый мешок с помощью иглы в капле воды переводят о во взвешенное состояние, затем переносят капилляром (диаметр 0,2 мм) на отрезок фильтровальной бумаги

2х2 см, лежащий на предметном стекле и предварительно увлажненный дистиллированной водой. Зародышевый мешок оказывается на бумаге почти без суспензии соматических клеток. Перенеся на бумагу несколько зародышевых мешков, их обезвоживают непосредственно на предметном стекле, расположенном горизонтально. Сначала с одного края бумаги наносят несколько капель 40%-ного спирта, а с противоположной стороны подводят сухую фильтровальную бумагу, которая всасывает 25 избыток жидкости. В этом спирте выдерживают 10 мин. Таким же образом проводят операции с 50, 70, 96 и

100%-ным спиртом, выдерживая объект по

10 мин в каждом из спиртов.Все работы Щ по обезвоживанию на предметном стекле проводят в чашках Петри. Предметное стекло с материалом, заключенным в ксилол, переносят под бинокуляр и тупой иглой, предварительно смоченной густым канадским бальзамом, осторожными прикосновениями к зародышевым мешкам собирают их на кончик иглы, переносят в каплю ксилола на чистое предметное стекло и покрывают покров- о ным. Полученные препараты сушат в термостате при 42 С.

Предлагаемым способом изготавливают постоянные препараты, которые могут храниться длительное время, что позволяет вернуться к их изучению и создать документированность эмбриологического исследования.

Способ изготовления препаратов зародышевых мешков растений, включающий фиксацию исходного материала, промывку, обработку его ферментом цитаза при мацерации завязей или семяпочек, препарирование, окрашивание, обезвоживание.этанолом, обработку ксилолом, заключение в канадский бальзам, помещение объекта на предметное стекло для,последующего микроскопирования, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью ускорения и упрощения изготовления препаратов целых зародышевых мешков, окрашивание исходного материала проводят непосредственно после фиксации и промывки, а после мацерации препарирование семяпочек проводят путем надрыва их кутикулы и извлечения зародышевых мешков, последние переносят капилляром на фильтровальную бумагу, помещая ее на предметное стекло, а обезвоживание этанолом и обработку их ксилолом проводят путем прокапывания.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Еналаева Н.Х. и др. Цитология и генетика, т.6, вы.п5, 1972.

2. Дженсен У. Ботаническая гистохимия, Мир, 1965, с. 59-77 (про-. тотип).