Способ получения кетозы или ее производного
О Д-"И=-(:-.-А Н И E
ИЗОБРЕТЕНИЯ ""697057
К ПАТЕЦТУ
Союз Советских
Соцналнстмческкх
Республик (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено160776 (21) 2384244/28-13 (23) Приоритет — (32) (31) (88)
Опубликовано 05.11.79. Бюллетень,% 41
Дата опубликования описания 05-11.79 (51) М. Кл.
С 13 К 11/00
Государственный комитет
СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 664.165 (088. 8) Иностранцы
Сидней Алан Баркер, Питер Джон Сомерс, Робин
Росс Вудбери и Джоффри Гарри Стаффорд (Великобритания) (72) Авторы иэобретенкя
Иностранная фирма к Ю
Империал Кемикал Индастриз Лимитед (Великобритания) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЕТОЗЫ ИЛИ ЕЕ ПРОИЗВОДНОГО
Изобретение относится к способу конверсии альдозы или производных альдоэы до кетозы или производных кетозы в присутствии оксианиона и, в частности, к способу конверсии глюкозы во фруктозу, манноэы-во фруктоэу, 6-фосфата глюкозы в 6-фосфат фурктозы, а также другим аналогичным реакциям. Процесс может протекать в присутствии энэима, катализирующего реакции превращения или беэ него °
Если конверсия глюкозы во фрукто эу проводится в присутствии энзима изомераэы глюкозы, очень часто равновесное состояние наступает по достижении.50-55%-ной степени конверсии глюкозы, содержащейся в реакционной среде, во фруктоэу. Поэтому до сих а0 пор было невозможно осуществить конверсию глюкозы во фруктоэу на основе реакций, протекающей без .энзима, не сопровождающейся образованием побочных продуктов реакции. Известны способы неэнзиматического превращения глюкозы во фруктоэу, сопровождающегося щелочным распадом образуюшейся фруктозы и накоплением других продуктов, образующихся в результате чис- © то химической неэнзиматической реакции (1) .
В процессе энэиматической конверсии, по мере увеличения доли фруктозы в реакционной среде, скорость ее образования снижается. Поэтому в промышленном масштабе выход фруктозы оптимизируется путем компенсации потерь при образовании фруктозы за счет снижения скорости реакции, в результате чего доля фруктозы в реакционной среде может быть повышена. В следствие оптимизации промышленного процесса мок<но получить сироп, в котором примерно 40Ъ глюкозы преврашено во фруктоэу. В большинстве химических неэнзиматических реакциях преврашения глюкозы во фруктоэу количество обраэуюШейся фруктозы падает после достижения некоторого максимума.
Поэтому совершенно очевидна необходимость повышения доли глюкозы, которую при помоши такой реакции можно экономически выгодно превратить во фруктозу.
Этого можно достичь эффективным выводом фруктозы иэ реакционной среды путем введения в последнюю реагента, который образует более стабильный комплекс с фруктоэой, а не с глюко69!057 о температуре 50-100 С и рН раствора
6-10.
Предложенный способ заключается в следующем.
Раствор альдозы или ее производного, содержащий 30-50 вес.-. глюкозы или ее производного, подвергают иэомеризации в присутствии катализатора и реагента, образующего более ,устойчивое комплексное соединение ,с кетозой или ее производньж, чем с альдозой или ее производным.
При изомеризации может быть использован энзимный катализатор, обеспечивающий более мягкие условия реакции или другие прЕимущества, такие как селективное действие используемого знзима по отношению только к одному изомеру (D или L) альдозы или ее производного. При проведении конверсии, катализируемой энзимом, последний может находиться в виде раствора или в иммобилиэованном виде на твердой матрице, которой может быть живая клетка, инактивированная клетка или любой другой приемлемый
25 носитель. Энэим может быть также в растворимой форме.
В качестве комплексообразующего агента используют оксианион германия или олова.
Оксианион германия или олова вводят в виде альдозооксианионного KQMплекса или производного альдозооксианионного комплекса, или в виде соли или оксида, или соединения, образующего оксианионы или смешанныс комплексы оксианионов в условиях реакции.
Может быть использован оксианион германия или олова, предварительно связанный с полиолом или ионообменной смолой, при нерастворимым носителем, образующим хелатные связи с комплексообразующим агентом или содержащим последний в виде противоионов.
Смешанный сложный оксианион получают на основе взаимодействи-: оксианиона германия или олова с ионом какого-либо другого элемента IY, или YI группы периодической системы.
Оксианион или смешанный сложный оксианион содержит германий. Преимущест.венными комглексообраэующими агентами являются ионы германата или полигврманата, вводимые в виде, наприЦель изобретения заключается в ускорении процесса и повышении выхода целевого продукта. ЗО
Для этого в качестве комплексообраэующего агента используют оксианион германия или олова.
Оксианион германия или олова целесообразно вводить в виде альдоэо- 35 оксианионного комплекса или в виде соли или оксида, или соединения, образующего оксианион или смешанные комплексы оксианионов в условиях реакции. 4О
Можно использовать оксианион -ермания или олова, предварительно связанный с полиолом или ионообменной смолой, или нерастворимым носителем, образующим хелатные связи с комплексообраэующим агентогл, или содержащим последний в виде противоионов. Оксианион можно вводить в виде комплекса оксианиона германия или олова с ионом какого-нибудь другого элемента IY Y или YI группы периодической систегы.
Кетоэу и/или смесь, содержащую кетоэу и остаточное колйчество альдОэЫ, отделяют от комплексообразующего агента, и последний вместе с остаточным количеством альдозы рецирку- 55 лируют 4 раствор.
Отделейие целевого продукта oò комплвксообразующего агента можно осуществлять при помощи по меньшей мвре одной ионообменной смолы. B ка- щ чвстве катализатора процесса изомеризации следует использовать энзим изомвраэу глюкозы. Исходный водный раствор содержит 30-50 вес.Ъ глюкозы. Иэомвризацию осуществляют при зой, хотя комплексообраэователь может при атом влиять на скорость реакции. В качестве комплексообраэователя могут служить соединения на основе солей борной кислоты, например арвнборонаты (2) .
Известен способ получения кетоэы или ее производного путем изомериэации раствора альдозы или ее произ"
-водного в присутствии катализатора и комплексообразующего агента íà основе борной кислоты, образующего более устойчивое комплексное соединение с кетозой или ее производным,чем .с альдозой или ее производным, и выделения кетозы или ее производного иэ раствора кристаллизацией (3), Однако соедичения солей борной кислоты токсичны, а бенэолборонаты, кроме того, малорастворимы не образуют комплексы с соотношением сахар: боронат =- 2:1 и не обеспечивают высоких концентраций фруктозы в продукте при высоком содержании са" хара. Такии образом, такие реакции комплексообразования не всегда целесообразно использовать для осуществле ния промьплленных способов конверсии, мер, германата натрия или.диоксида германия и используемые в виде растворов, иммобилизованных хелатов или. противоионов в ионообменных смолах.
В некоторых случаях могут быть успешно использованы такие смешанные ионы, как (Ge0> (БОд ) ) (HGe0< (РО ) ) или лактатгерманиевые остатки.
Известно, что поведение фруктозо-германатных комплексов при электрофорезе (PH 10,7) отлично or поведе69 705 7 ния глюкозидно-германатных комплексов,причем при темпера-уре 40 С подвижность первых в два раза превышает подвижность последних.
Ионы германата являются важными реагентами для осуществления конверсии глюкозы во фруктозу по следующим соображениям.
Для германата характерно равновесное состояние моногерманат пентагерманат д== гептагерма— нат, которое смещается вправо с увеличением концентрации германата и влево — с повышением рН выше 9. В промышленных условиях предпочтительно иметь минимальный вес германата для обеспечения максимальной скорости конверсии, а также для избежания щелочного распада побочных продуктов реакции.
Диоксид германия и германат натрия 20 обладают очень незначительной раст„воримостью в воде: растворимость Се02 в воде составляет 31-33 мМ. Растворимость германата натрия составляет
870 мИ. 25
В реакционной среде, используемой для энзиматической конверсии глюкозы во фруктозу, обычно присутствуют ионы магния. Ортогерманат магния (Мд Се04) черезвычайно трудно растворим в воде ЗО и применяется для аналитического определения германия.
В описанных выше условиях он не высвобождается из раствора.
Для протекания реакции изомеразы глюкозы с d — D — глюкозой необходимо выполнение некоторых стерических требований. Глюкозидно-германатный комплекс, который,как известно, будет образовываться, частично или полностью ингибирует энзиматическую реакцию. Для комплексообраэования с германатом более пригоден 1,2-цис-клюколь d. — D — глюкозы по сравнению с сС вЂ” D — глюкозой.
Комплексы маннозы более устойчивы по сравнению с комплексами глюкозы и германата.
Конверсию глюкозы во фруктозу мож но осуществить на основе чисто химической реакции при использовании комплексов германата или станната. Однако предпочтительно проводить ее на основе энзиматически катализируемой реакции в присутствии иэомераэы 55 глюкозы. Для осуществления конверсии может быть использована любая изомераза глюкозы, но выбор этих энзимов зависит от их оптимальных рН и температуры.Приемлемые изомеразы получают 60 из бактерий видов Acrobacter, Pseudomonas, LactobaciKCus Streptomyces, Curtobacterium. Приемлемыми. также являются изомеразы глюкозы из термофильных микроорганизмов видов
Thermoactinomyces, Thermopdyspcra, Thermono pora u Pseudonocardi а. Для
Оптимальногo действия HeKQTophlx из вышеуказанных изомераз глюкозы необходимо наличие ионов кобальта.
Конверсии глюкозы во фруктозу мож1
»о осуществлять непрерывным способом, пропуская раствор, содержащий глюкозу, через колонну, в которую загруже 3 иммобилизованный энзим или другой катализатор. Знзим иммобилизуется путем связывания его флоккулирова»;ымя целыми микробиологическими клеткам », Комплексообразующий реагент, например германат или станнат, мажет содержаться в растворе, проходящем через колонну, или загружаться в колонну вместе с иммобилиэованным энзимом или другим катализатором. В последнем случае колонну можно загрузить иммобилизованным энзямо. :: или другим катализатором, предварительно смешанным с комплексообраэователем и гомогенно распределенным по высоте колонны, и наборот, в колонне могут находиться чередующиеся слои иммобилизованного энзима или другого ката |иэатора и реагента, разделенные решетками, Будучи загруженным в кОлонну, комплексообразующий
pear å»T находится там в нерастворимой форме, например в гель-форме, как, например, цеолит или неорганическое или органическое полимерное производное.
После ко»версии глюкозы во фрукто:-у последню:i можно выделить из смеси, содержащей комплексообразующий агент, и вывести ";:s сферы реакции как таковую или в смеси с глюкозой. В результате проведения такого процесса получают фруктозу, сироп, содержащий смесь глюкозы и фруктозы, и оба этих продукта, т ° е, фруктозу и сироп иэ смеси глюкозы и фруктозы. Комплексообраэователь может быть возвращен в реакционный цикл как таковой, вместе с глюкозой или вместе с глюкозой и связанный глюкозой. Извлечение и рециркуляция могут быть осуществлены любыми пригоцнымн для этих целей методами; а) Иетод, согласно которому начальный продукт кo»Bерсии глюкозафруктоэа пропускается через колонну, загруженную катионообменной смолой с катионньгли противоионами металлов II группы периодической системы или ионами водорода. При этом начальный продукт разделяется на фруктоэу, которая выводится в виде конечного продукта реакции, и глюкозу с комплексообразующим реагентом, который вновь используется в реакционном цикле.
Предпочтительными ионами металлов II группы являются ионы кальция.
69 705 7. б) Метод, согласно которому продукт конверсии глюкоза-фруктоза пропускается сначала через колонну, загруженную катионообменной смолой с кар èîííûìè противоионами металлов E или II группы периодической системы, предпочтительно ионами натрия. При этом исходная смесь разделяется на две фракции. Фракцию, содержащую =ироп, состоящий из глюкозы и фруктоЭы, выводят из процесса, а фракцию, содержащую фруктозу и комплексообРазующий реагент, пропускают через колонну, как описано в подпункте для разделения фруктозы и комплексоОбраэующего агента и рециркуляции последнего.
B обоих вышеописанных методах используется предпочтительно сульфинированная по ядру полистирольная катионообменная смола, содержащая вулканиэующий агент.
Для этих целей могут быть использованы и другие методы, такие как разложение комплекса, содержащего фруктоэу, с помощью Борасорба
{торговая марка) — полимера, содержащего длинную цепь цисгидроксильных групп, присоединенных через третичный атом азота. к дивинилбенэолполистирольной матрице, и предназначенного для абсорбции .бората. Если 30 реакция с комплексообразующим реагентом протекает в растворе в реакционНой среде, то этот реагент может быть повторно использован в процессе. Таким образом, германат, абсорби.-35 рованный Борасорбом, может быть элюирован щелочью или кислотой.
Однако все эти операции можно избежать, если использовать комплексосбразующий реагент (например,германат) в рр иммобилиэованной форме.
Конверсия глюкозы во фруктозу протекает преимущественно энэиматически и непрерывно при использовании колонны, загруженной микробиологическими клетками, содержащими энзим, что описано выше. Когда комплексообразующий реагент находится в реакционной среде, поступающей в колонну, то его содержание состав.ляет от 200 до 800 мМ, предпочтительно от 500 до 600 мМ. В реакционной среде, поступающей в колонну, содержится предпочтительно от 30 до 50 вес.Ъ глюкозы, и реакция протекает таким образом, что концентрация фруктозы в растворе,выходящем из колонны, составляет от 40 до
85%, предпочтительно от 75 до 803, Предпочтительное значение РН реакционной среды лежит в пределах от 60
6 до 10, причем оптимальная активность наблюдается в области рН 8, в частности 7, 8, которая несколько меняется в .зависимости от типа используемого энзима; значения РН до б5
7,8 относятся к энзиму, полученному из организмов вида Arthrobacter.
Предпочтительно температурный диапазон реакции составляет от 50 до
100 С, лучше от 45 до 80 >C. РН элюата, как правило, ниже чем РН питающего раствора, поскольку образующая фруктоза составляет комплексы с оксианионом.
Помимо глюкозы и различных соединений с германат-ионом в реакционной среде содержатся также части: +
Ng — ионы в количестве примерно
4 мМ с ионом хлора в эквивалентном количестве и Na0H для создания соответствующего РН. для других энзиматических реакций (например, фосфоглюцизомеразы, в присутствии которой осуществляется конверсия 6-фосфат глюкозы в
6-фосфат фруктозу и для которой повышенные выходы продукта наблюдаются при температуре 25 С в присутствии ионов германата), условия будут совершенно отличны и должны быть оптимизированы для каждого отдельного энзима. Для конверсии
D-ксилозы в D-ксилулозу также может быть использована иэомераза глюкозы, представляющая приемлемый вариант для этой технологии, а германат смещает равновесие в сторону образования больших количеств ксилулозы., Использование в качестве KQM плексообразующего реагента ионов германата имеет преимущество по сРавнению с использованием соединений бора, предложенных ранее, выражающееся в том, что ионы германата образуют сильные комплексы с фруктозой и обладают более селективным стерическим действием при комплексообразовании с сахаром в сравнении с боратом.
В этом случае также исключаются проблемы, связанные с токсичностью.
В отличие от аренбороновых кислот германат может образовывать хелатные соединения, содержащие германатфруктозу в соотношении 1:2, таким образом снижая. расход комплексообраэующего реагента. Обычно .оптимальное значение рН в случае использования одного энэима может не соответствовать оптимальному значению рН для энзима, смешанного с комплексообразующим реагентом. Таким образом, снижение оптимального значения
РН энзима, например, для изомеразы глюкозы с 8,5 до 7„ обеспечивает снижение затрат на удаление окрашенных соединений, образующихся в процессе энэиматической реакции,Предпочтительно также добиться снижейи>*температур реакции при сохранении той же степени конверсии за то же время. Введение германата резко повы9
69 705 7
0,12
0,12
0,528
0,528 25
0,10
0,10
0,11
0,11
0,11
0,11
8,3
4,65
25
8,1
4,58
0 47,5 7
25 80,5 6,8
122
118
44,5 6,8
337
6,7
270
63
0,11
6 5
259
6,3
0 11
0,11
0,11
0,11
265
53
300
59,5 6,4
72 5* 7,2
284
100
275
200
+ — 55,5% при равновесии
* — 82% при равновесии (конечное значение рН 6,5). шает начальную скорость реакции изомеризации глюкозы во фруктоэу,так что эа более короткое время достигаются экономически выгодные степени .изомериэации.
Сущность изобретения поясняется следующими примерами, Пример 1. Энэиматическая изомеризация глюкозы во фруктозу.
Ряд водных растворов глюкозы, содержащих различные концентрации ее вместе с ионами магния и германатионами, пропускали через колонку длиной 32 см и внутренним диаметром
0,4 см, снабженную флокулированными клетками, содержащими изомеразу глюкозы. Для сравнения ч рез колонку также пропускали соответствующие растворы, не содержащие германат.Процент иэомеризации глюкозы во фруктозу в злюате, выходящим иэ колонки, оценивали на автоанализаторе методом, основанным на использовании реэорцина. Реакции проводили при начальном значении рН 8,5 и при температуре 60 С, концентрация хлористого магния в водном растворе глюкозы составляла 0,004 М.
При приготовлении растворов глюкозы, имеющих концентрацию до 100 мИ, в целях предотвращения осаждения магния из раствора в присутствии ионов германата в растворы глюкозы, посту5 пающие в колонку, перед введением хлористого магния добавляют растворы, содержащие германат-ионы, поскольку магний не осаждается глюкоэидно-германатным комплексом, образующимся в растворах. Растворы, содержащие германат-ионы, готовят суспендированием диоксида германия в воде, добавлением концентрированного раствора щелочи до рК 10,5 с последующим введением раствора глюкозы и хлористого магния. По достижении конечного значения PH 8,5 раствор становится прозрачным.
Для получения субстрата растворы, содержащие 200 мМ германата или нес20 колько большее количество диоксида германия, добавляют к 1 М раствору глюкозы, так что при медленном введении щелочи вплоть до рН 8,5 гер.манат постепенно переходит в раст25 вор. После добавления хлористого магния раствор слегка мутнеет, но выходящий из колонки злюат совершенно прозрачен. Полученные результаты представлены в табл.1.
30 Таблица 1
697057
Та блиц а 3
Питанис колонки (c вв< дением 4 мМ
МЧС8,}
Расход мл/мин
47,8% в/о глюкозы +
+ 800 мМ германата
51,2% в глюкозы
0,015
0 i 030
0,050
53
5 69
36 50
В конверсии глюкозы во фруктозу
Таблица2
I Концентрация
Степень конверсии ГлеОКОЗЫ ВО фруктозу,Ъ
Количество фрукт Оэы ъ в/о
Начальная кон центрация
ГЛЮКОзы, % в/о германат-ио30 нов, мМ
43,5 696
В следующем эксперименте, результаты которого оценивались реэорцияовым методом, проведенным на колон- 6() ке тех же размеров при 60 С и рН 8,5 с различными расходами, получены следующие результаты (см.табл.З) °
Как видно из табл.1, концентра-ция фруктозы в присутствии германатконов во всех случаях выше по сравнению с контрольными растворами, не содержащими германат ионы.
Пример 2. Энзиматическая кон"
„5 версия глюкозы во фруктоэу.
Для изучения влияния более высоких концентраций глюкозы повторяют те же операции, что и в примере 1, на колонке тех же размеров. Расход снижа10
@т до 0,08 мл/мин, чтобы обеспечить максимально возможное время нахождения в сфере реакции (125 мин) для достижения равновесия в течение нескольких часов, при этом определяют равновесные значения в этой серии опытов. После приготовления смеси определяют концентрацию глюкоЗЫ, чтобы внести поправку на разбавление щелочью и магниевой солью. 20
Полученные результаты представлены в табл.2, 47,4 0 25,6 54
45,6 64 32 70
43,7 524 35 80
36,5 84 40
50 800 39,7 79,4
Как видно из табл.2, в присутст- 45 вии герм<анат "ионов резко повышается степень конверсии глюкозы во фруктоэу, Количество Фруктозы определяют 5(3 методом Чаплина-Кеннеди, Величины, определенные этим методом, несколько выше, чем полученные методом на о=нове использования реэорцина, примененных во всех последующих примерах 55 для определения количества фруктозы.
ПрОдукт р пОлученный при испОльзОвании глюкозы (концентрация 4 3, 5%) подвергают фракционированию на аниснообменной смоле Леал Лтд в боратной форме, создавая градиент элюирования боратными буфферами (от 0,13 М бората при рН 7 до 0,35 N бората При рН 9,8} для обеспечения разделения продукта на глюкозу и фруктозу.Такое же разделение проводят после удаления германата на колонке БОРАСОРБ ; Отношение фруктоза: глюкоза составляет 3,31:1 без предварительного отделения германата.
Количественное определение глюкозы и фруктозы осуществляют м тодом, основанным на использовании цнстеина и серной кислоты.
Пример 3, Химическая конв рсия глюкозы Во фруктоэу.
Чисто химическую конверсию глюкозы во фруктозу в присутствии германат-ионов проводят нагреванием раствора, содержащего 50% в/О глюкозы, 4 мМ магниевой соли и 600 мМ германат-ионов при 60 С и рН 8,5.КОнцентрации фруктозы, определенные через различные промех<утки времени, составляют следующие значения,%:
Время,мин Фруктоэа
90 3,3
180 5 7
Опыт повторяют гри температуре
90 С (концентрация г; кжозы 48, 450-о в/о и концентрация герман ата
600-582 мМ) Ъ конверсии фруктозы, полученный через рг.зличные временные промежутки, представлены в табл,З, Количественное Определение фруктозы проводят резорциновым методом,В процессе проведения Опыта в нагретом сиропе присутствует азат, Во всех случаях начальное значение рН, измеренное при темпера †у 31 ", падает и доводится до первоначального в указанные моменты времени.
697057 ные, полученные резорциновым методом, представлены в табл,4.
Т а б л и ц а 4
4,3
9,1
0,5
0,5
0,5
8,2
3,8
9,7
1,5
1,5
4,7
1,5
6,8
2,5
7,4
12,6
3 5
7,8
3 5
3,5 (рН 6,74) 18 3
8,3
6,0 12,2 4,5
18,3
8,7
4,5 (конечное значение рН 6,37) 4 мИ М9Ы, иллюстрируют отношения глюкоза-германат.
Время, час
0 5 1
1,5 2 2,5 (PH 7, 48) Степень конверсии во фру o % 19 8 316 36 2
38,6 38,6
Время (час) 4 33 6
6,5
Степень конверсии во фруктозу,Ъ 46,1 48,5 48 ных положениях колонки получают практически одинаковые значения степени конверсии глюкозы во фруктозу, составляющие 39,7Ъ.
Аналогичные опыты были проведены в присутствии добавок NgCCg, ДанСледующие результаты,полученные при нагревании до 90 С и рН 8,5
1,245 N глюкозы, 600 мК германата и
Затем полученный продукт разделяют (с и беэ предварительного отделения германата) на боратной колонке. При элюировании в определенглюкозы рН 8 вления
0 мИ а тепень онверии во руктоyð,Ú
12,5
14,4
15,2
15,45
15,4
69 7057
Таблиц а 5
Ъ в/о глюкоз хоцное рН 8, 004 М ihgCK
0 мМ германа
Вр ча
30,3
19,5
0,5
0,5
35„3
35,7
2,)7
2„83
16„9
2,83 29,8
36,7
18,8
3,33
27,2
3,33 (рН 6,42) 35,8 (pH 6,37) 2?„1
34,3
3,67
36 2
4,83 23
5,33 22,7
35,5 лимическая конверсия глюкозы во фруктозу протекает очень медленно при низких концентрациях германата при температуре 90оС и рН 8,5 без щ добавления хлористого магния.
После нагревания 553 в/o глюкозы, о 00 мМ германата, О, О 0 4 мМ М.-,СЕ, при 90 С и начальном значении peal: 7, 5 в течение б час степень конверсии во фруктозу определенная резорциновым методом, составляет 13,7%.
Т а б л и ц а 6
20 мМ глюкозы 20 мм глюкозы
10 мМ германата 20 мМ германата
100 мМ глюкозы
10 мМ германат. I
Бремя, час
Степен
Степень
Время,, Степень час, конвер)сии,Ъ конвер сии,Ъ конверCION о
0,5
4,3
0,5
4,3
7,6
8, 1 8,5
2 15,5
l1,7
10,7
1,5
2,67
18,2
18,8
18,7
19,8 (рН 8,16) (рН 7,78) 21, 5
3,5
3,5
25,3
19,8 (рН 8,22) 50% в/о глюкозы
Исходное рН Б
0,004 М МАСС
600 мМ германата
Степень конверсии во фруктозу,%
Степень конверсии во фруктоОЪ в/о глюкозы сходное РН ,004 М МуСС
00 мМ германата ремя, Степень ас конверсии во фруктозу,Ъ
2 33
2,67 (рН 6,98)
3,33
18
69 705 7
Продолж е ни е т абл . б
24,2
29,1
315
20,4
25,6
4 5
25,6
27 5
33,4
29„7 (РН 7„8) 5,5
29,1
5,8 32,2 (РН 8,0) 30,3 б
31,8
36,8
33 5
37,3
7,5
31 9
7,5
39,7 (РН 7,82) 8,5
33,4
34,6
40,6 8
40,6 9
39,4
38,9
8,5
РН
Продолжен и е т абл . 7
170 (РН с
7,25 доводят 8,5)
280
13,4
15 4
15 9
20,4
20,6 таблица7
3,44
6,42
Пример 4. Конверсия глюкозы во фруктозу в присутствии растворимой изомераэы глюкозы.
Были исследованы начальные скорости реакций, протекающих в присутствии изомеразы глюкозы в растворимой форме (200 мл) при 60 С и
PH 8,5 с субстратом D-глюкозы в количестве 0,5 мМ и добавлением 4 мМ .MgCK и 0,5 мМ СоС, оставшихся постоянными во всех растворах (25 мл), содержащих различные количества германата. Растворы анализировались с помощью резорцинового метода.
Пример 5. Конверсия манно эы во фруктозу.
Раствор, содержащий 50% в/о ман,нозы, 4 мМ MgCC q и 600 мМ германата нагревают до 90 С при РН 8,5.Концентрации фруктозы, определенные реэорциновым методом, представлены в табл.7.
Время, Степень конверсии маннозы ми н во фруктозу, Ъ
Пример 6. Конверсия б-фосфата глюкозы в б-фосфат фруктозы.
5П На основе пРимера 1 проведены опыты с использованием 0,5 мМ раствора б-фосфат глюкозы, к которому было добавлено различное количество германат-ионов. Опыты проводились о при 25 С и при различных величинах
PH. В качестве энзима был использован энзим Сигма Грайд III из дрожжей (суспензия кристаллов), разбавленный в 220 раз и подвергнутый диализу для удаления буферных солей перед его непосредственным использованием.
Образующийся 6-фосфат фруктозы анализировался резорциновым методом.
69 7057
Таблица8
7 7
22 а б л и ц а 9
Исходно рК
Конечно рН после прохождени знзима через реактор епень
Время, час нвери но уктоо о
6,6
7,0
5 6
7,0
5,5
7,0
5,8
7,0
7с0
5,7
102
7,8
6 9
126
78,3
150
7,8
6,9
174
76 5
71,6
7,8
6,9
6,8
7,8
198
* — Конец первого периода — питающий колонку раствор очищается
** — Конец второго периода — восстанавливается начальное значение рН
200 84 86 84 63 56 48 36
100 Bl 81 77 68 48 40 36
50 82 81 77 62 48 40 33 29
25 89 81 78 60 50 39 ?9 23
12,5 76 69 64 56 40 29 25 22
6,25 62 55 48 40 32 25 ?.3 22
Как видно из приведенных данных, степень конверсии повышается в присутствии германат-ионов.
Пример 7. Энзиматическая конверсия глюкозы во фруктозу.
Питательный раствор, содержащий
41,2% глюкозы, 600 мМ германата и
4 мМ хлористого магния, с начальным значением рН непрерывно пропускают через колонку, загруженную энэимом. Колонка аналогична колонке, описанной н примере 1. Через различные промежутки времени измеряют конечные значения рМ и степень конверсии глюкозы во фруктозу. Весь опыт проводят в три стадии.
Через первые 43 часа питающий колонку раствор подвергают очистке через металлический фильтр для удаления небольшого осадка, образующегося в растворах глюкозы с германатом через длительные промежутки времени. Это приводит к повышению активности, незначительно падающей в процессе реакции. Через второй промежуток времени, составляющий от 43 до 10? час, рН питающего раст-. нора повышают до 7, 8. рН элюата существенно снижается при длительном прохождении через колонку, Оказывается, что можно поддерживать степень конверсии более 70=., если рН элюата в колонке не будет ниже 7.
Полученные результаты г ринедены н табл, 9 °
67,2
61,5
60,8*
64,9
65,5
76,5
69 7057
Продолжение табл. 11
9 4
2 9 4 5
1—
4—
65
9.1?.75
31,8
1-.
70
34,1
1
75 с
35,8
1 0-„
80
32,4 2
Т а б л и ц а 10
44% в/о глюкозы + 4
+600 мИ германата р ходе через энэим О, мМ MgCI +
Н 7, 1 при рас05 мл/мин
Степень конР ерсни но фруктоэу,Ъ (энзим промыт 2 дня назад
1—
15 85 ! l
25,,6
Температура процесса, С та
69,2
73,4
75,1
71 5
72,1
75,0
60,5
26.П.75
26.П.75
26.П.75
27.П.75
27,П,75
27.П.75
27.П.75 уляное хожия тночекокуr
48,7
44,6
35,2
35,6
51,8
40,3
34,2
26,9
2,2
8,9
11,1
1**
2,1
17,8
25,0
31,9*
14
23
27
* Эквивалентно конверсии 54%, Содержится только
3,1-о манноэы.
** Содержится 5% маннозы.
Влияние различнык температур на стабильность процесса оценивается с помощью той же колонки c энэимом, что описана выше. Полученные результаты приведены в табл. 10 и 11.
Условия реакций обозначены н графах таблиц. В таблице 10 приведены конверсии, достигаемые в равновесных условиях, тогда как в табл. 11 даны конверсии, достигаемые в начале.
Результаты, представленные в табл.10 и 11, свидетельствуют о кумулятинном эффекте.
Таблица 11
443 в/о глюкозы + 4 мМ MgCI + 600 мМ германата РН 7, 1 при расходе через энзим 0,05 мл/мин через энзим
55 8.12.75 22,7 1 — 12
7.
60 9,12.75 30,1
П р и и е р 8. химические конверсии сахаров а) Глюкозы но фруктозу
Были приготовлены растворы глюкозы (55-60 об.веc.),содержащие 600 мИ
25 германата и не содержащие его при рН 12 и температуре 20 С. Сразу же после приготовления были отобраны пробы 50 мкл, раэбанлены до 5 мл, после чего хранились при температуо ре -20 С до момента анализа. Затем растворы помещались н закрытые колбы и хранились н холодильнике при
4,5 С. Колбы ежедневна встряхивали и отбирали пробы через промежутки времени, указанные н табл.12, Все образцы анализировались путем их разделения на ионообмеиной смоле с боратсм, а характеристические пики записывались при помощи автоматического цистеинсернокислотного устрой40 стна. Было отмечено, что растворы, содержащие германат, приобрели незначительное белое окрашинание эа весь период, указанный н таблице
12, тогда как не содержащие герма45 ната растворы быстро приобрели зеленый цвет, интенсивность которого увеличилась по мере инкубации, Полученные результаты представлены н таблице. 12, Т а б ли ц à 12
697057 венно в табл,13, 16. Во всех случаях наличие германата-ионов обуславливает два эффекта: замедляется деструкция сахаров или меняется состав равновесной смеси.
Т а бл и ц а 13
52,1Ъ .в/о 50,5Ъ в/о
Нет 600 мМ
Найденные компоненты,: .17 дней
17 дней
18,1
26,7
51,2
D — глюкоза
D — манноза
D — фруктоза
Таб лиц а 14
51,4: a/o
Нет
53, 3-о в/о
00 мМ
Найденные соединения 17 дней 30 дней
17 дней 30 дней
79„3 53,4
13,65 18,3
7,2 18,8
D — манноза
60,2
D — фруктоза
D — глюкоза
771
T а б л и ц а 15
9о в/о . 58,7Ъ в/о ет 358 мМ
Найденные соединения,Ъ 15 дней 27 дней 15 дней 27 дней
26,5
21,5
38,3
Мальтоза
13„9
67,9
24,5
51,9
4,39
22,1 22,8 следы
* Рассчитано как М.вес. с 0,5 моль глюкозы плюс
0 5 моль фруктозы
Таблица 16! в/o 58,7Ъ в/с 464 мМ
Начальная концентГ
3-0-метил D-глюк
Германат
41,8Ъ
Найденные соединения,Ъ 15 дней
3-0-метил фруктсза*+ 18,5
15 дней
29,7
3-0-метил глюкоза
36,1 46 очень устойчиво к действию щелочи
** — рассчитано на фруктозу б) Дяя ряда сахаров был исследован роцесс инкубации при рН 12 и температуре 5 С в присутствии германат-ионов и беэ них. Полученные результаты представлены соответстНачальная концентрация
D — фруктозы
Германат
Начальная концентрация
D — фруктозы
Германат
Начальная концентрацHH мальтозы
Германат
Мальтулоза"
Фруктоза
Глюкоза
36,4
22,8
27,8
30 дней
42,3
24,3
21,2
27,45
44,4
j3i36
69 705 7
Время, час епен нвер и во укто (%) з ст т-ио вертоисутМ стан20 риант б д
56,6
42,6
53,3
Т а б л и ц а 18
6„9
7,2
-8,5
49,2
8,5
49,3
40,2
6,9
8,5
38,2
7,2
8,3
6,6
8,3
6,8
8,4
4l,6
7,1
8,5
44,6
7,1
53,4
6,8
8,6
6,8
Пример 9. Конверсия глюкозы во фруктоэу в присутствии станнат-конов.
Через колонку, загруженную знзимом изомераэы глюкозы, использованную в предыдущих примерах, пропус- 5 кают два раствора, содержащих 44,6Ъ глюкозы и 4 мИ NgCCg при р11 8,5, В одном растворе не содержатся станнатионы, тогда как содержание их в другом растворе, полученных из крис- )Д таллического Na
Таблиц а 17 !
В образцах злюата, выходящего из колонки, смешанных с дополнительным количеством глюкозы, не происходит образования фруктозы, что свидетельствует о том, что активная изомераза глюкозы не вымывается из реактора °
П р и и е р 10. Знзиматическая конверсия глюкозы во фруктозу.
Влияние рН и содержания германата>
a) Было проведено две серии опытов на колонке с изомеразой глюкозы.
Колонка аналогична колонке, использованной в предыдущих примерах. В каждой серии сравнивались результаты, полученные для растворов, содержащих глюкозу и 4 мИ NqCC в присутствии 600 мИ германата и без него.
Расход растворов в колонке составлял 0,05 мл/мин, а температуре знзима — 60 С, Начальные значения рН исходных растворов отличались друг от друга в экспериментах различных серий, измерялись конечные значения рК злюата, выходящего иэ колонки. Результаты опытов представлены в табл.18.
0 48,2
0 49,6
0 49,2
0 49,2
600 76,5
600 70 3
600 74,6
600 72,5
600 71,2
0 54
0 . 49,3
0 54,9
600 67,4
GOO 66,7
69 705 7
Т а бл и ц а 19
Сост ав з3)юат а (;=.
<рруктозы) Зт рН 1
Б е з 1 +5P маната
Б присутствии
600 мМ
3 приnrтт С ГВ)ЛИ
200 мМ ! гермагерманата
Hc TcL
51
8,5
5а
70 г, 70
60
7,0
60
"7 О
6„5
5 с) 0
Та блиц а 20
Р а czo73;
Состав к арбогидрат".îãо ис .ОдНО.. О
Состав карбО гилратного исход-! ного раствоPа т @o B/О
)3омиН т)Ь—
Состав элюата
Исходный без ное,DHрас-. Bnp германавремя нахождения
B КО,ЛОНКЕ сутствии
600 мМ германатата раствора т
Ъ в/о (В ПР11сутствии германаТа) (без германата) 31,0
54.6
50.:
2?,5
51т2
36 т лю51 2
51,2
47,8
О,ОЗ
68,5
КОЗ с1
0,015
47,8
251.
53 б) Были проведены двс сер )и Опы тов на колонке с иэомеразой глюкозы °
Исходные растворы содержали
503 в/о глюкозы, 4 мМ NgC8 и 200 и 600 мМ германата соответственно.
Опыты проводились при различных значениях рН. Серии сравнительных опЫтов проводились на растворах, не содержащих германат. Во всех опытах растворы пропускались через колонку с иммобилизованньпл зязимом со скоростью 0,05 мл/мин (75 мин номинальное время нахождения в колонке) . Полученные результаты представлены в табл.19.
П р и )л е р 11, Знзимати -Iec—
КаЯ КОНВЕРСИЯ ГЛ)ОКО 311 — О фРтУКтОЗУ обратимость.
). OTOBHT РастВОРЫ ГЛЮКОЭЫ И 3РтттК— тозы, содержа);ие карбогидрат в количествах, <а32нных 13 табл.20., РаетВОРЫ жЕ, СОДЕРжаЩ-,)Е ГePIIc)H cIT, готовят путем pHcTBopeIII;II взве;))енного количества СеОg в небольж1)х порциях этих растворов при перемен:иВаНИИ С НЕбОЛЬ1))ИМИ КОЛИЧССтза)т1И
50-..-ного раствора И))ОН. Ко всем этим растворам доба)зляют раствор МсЛ с таким расче-ом чтобы его кс:)е ная концентрация составила 4 мМ, а рН всех растворов доводят до
8,5 при температуре 25 С.
Затем растворы пропускают через колонку с знзимом (ЗО х 0,4 cM) при температуре 60 (co скоростью, указанной в таблице, После разбав)о
I,1IeHHH определяют уровень со1)ержаНня <()руКтОЗЫ В ЭЛЮатC ВЬ)ХОдя1т)ЕМ т 3 к О лО н к и, Дл 11 к ал1 . бр с в а:"l 11 т o T o в ят растворы концентрацией 0, 55% в/о, которые пропуска;ст через всю аН алитическую си cт ему. 1(31я пров ер35 ки исходной концентрации глюкозы в исхоцных растворах отобранные из них пробы и ка))ибрсво. ные стандартные растворы разбавляют B 2 х 10 раЭО за и анализируют цистеиносернокислотным методом. Полученные результаты представлены в табл. 20.
>3 отсутствие германат=- равновесная точка располагается B диаЗ5 паэоне 5?-53Ъ фру-.тозы, независимо от того, используется ли в качест-. ве исходногО раствор глюке-ы или
11)руктозь), 11 в диапазоне 74-79 3 в присутствии 600 мМ германата т кже независимо от того, используется в качестве исход):огo раст)зор глюкозы или Оруктоэы.
69 705 7
Продолжение табл, 20
38 71 79
48,2
0,1 55
0,05 55
0,03 55
48,2
48,2
48,2
0,015 55
Т а блиц а 21 б-0-L-Dгалактопиранозил
D-фруктоза
3,2 9,8 12,8
11,0 Нет — 9,9 11,9
12,3
Галактоэа
Мелибиоэа б-0-Ь-D галактопиранозил
D-фруктоза
Галактоза
Извлечение укаэанных соединений
85,4 69,1
80,5
Пример 12. Энзиматическая конверсия глюкозы во фруктозу— концентрационная зависимость .
Через колонку с иэомеразой глюкозы при температуре 60 С пропусИзвлечение укаэанных соединений 95,4
Формула изобретения
1. Способ получения кетоэы или ее производного путем изомериэации раствора альдоэы или ее производного в присутствии катализатора и комплексообраэующего агента, образующего более устойчивое комплексное соединение с кетоэой или ее производным, чем с альдоэой или производным алъдозы, и выделения кетоэы или ее производного иэ раствора, отличающийся тем, что, с целью ускорения процесса и повышения выхода целевого продукта, в качестве комплексообраэующего агента используют оксианион германия или олова.
55,5 77,5 Фрук125 53,5 77 тоэа
251 52 77 кают серию растворов, содержащих
600 мМ герланата и 4 мМ МдСИди различное количество глюкозы. Полученные результаты представлены в табл. 21.
75с2 82 2 72 9
42,7 35,0 25,2
37,8 42,5 31,1 есть
7,9 12,8
2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что оксианион германия или олова вводят в виде альдоэооксианионного комплекса или в виде соли или оксида или соединения, образующего оксианион или сМешанные комплексы оксианионов в условиях реакции„
3. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что используют оксианион германия или олова, предва6О рительно связанный с полиолом или ионообменной смолой или нерастворимым носителем, образующим хелатные связи с комплексообразующим агентом или содержащим последний в виде
65 .противоинов.
697057
32
Составитель Г. Лошкарева
Редактор Н. Вирко Техред М. Келемеш Корректор Г. Решетник
Заказ 6613/60 Тираж 408 Подписное
ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035 Москва Ж-35L Раушская наб. д. 4L5 филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная,4
4. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что оксианион вво.дят в виде комплекса оксианиона германия или олова с ионом другого элемента IY, Y или YI группы периодической системы.
5, Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что кетозу и/или смесь, содержащую кетозу и остаточИое количество альдозы, отделяют от комплексообразующего агента и
Последний вместе с остаточным количеством альдозы рециркулируют в раствор.
6. Способ по п.5, о т л и ч а юшийся тем, что отделения целевого продукта от комплексообраЗующего агента осуществляют при помощи по меньшей мере одной ионоОбменной смолы., 7;°,,. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве катализатора процесса изсмеризации используют энзим изомеразу глюкозы °
8, Способ по п. 1, 7, о т л и5 ч а ю шийся тем, что исходный водный раствор содержит 30-50 вес.% глюкозы
9. Способ по п,1, о т л и ч а юшийся тем, что изомеризацию осуществляют при температуре 50100 С и рН раствора 6-10.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
1а Патент США Р 3558355, л, 127 46 опублик
2. Патент Англии Р 1369185, кл. С 2 Б, опублик, 1974.
3. Патент CIIJA Р 3689362, кл. 195-31, опублик, 1972, прототип.
