Способ получения динуклеотидов

 

673 691

Союз Советсккх

Соцкалисткческих

Республкк

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свиЛ-ву (22) Заявлено 13.07.77 (2l ) 2509187/23-04 (51)М К

С ОT Н 21/00/l

А 61 К 31/00 с присоед,инением заявки РЙ

Государственный комитет (23) Приоритет

Опубликовано 30.04.80. Бюллетень И 16

Дата опубликования описания 30.04.80 по делам изобретений и открытий (53) УД К 547. . 963.32 (088.8 ) (72) Авторы изобретения

В. Ф. Зарытова, Т. С. Ломакина и В. П. Старостин

Новосибирский институт органической химии Сибирского отделения (71) 3ааВНТеаН АН СССР и Новосибирский государственный университет (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИНУКЛЕОТИДОВ

Недостатком известного способа является применение на стадии образования

)Лель изобретения — упрощение процесса.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения динуклеотидов применяют 2-3 кратный избыток цианэтанола, а в качестве конденсирующего агента стадии цианэтилирования — триизопропилбензолсульфонилхлорида, что позволяет избежать применения Д11К, обладающего аллергенными свойствами и уменьшить пожаро41Л P).

Изобретение относится к усовершенст- вованному методу получения динуклеотидов, которые используются для синтеза фрагментов нуклеиновых кислот, необходимых для исследований в молекулярной биологии, биохимии, и генной инженерии.

Известен способ получения динуклеотидов, включающий цианэтилирование (получение моноцианэтильного производного) нуклеотида избытком (18-60 крат1о ным) цианэтанола и присутствии конденсирующего агента — дициклогексилкарбодиимида (ДИК); цианэтильное производное выделяют из реакционной смеси

15 экстракцией Д11К циклогексаном и осаждением производного из раствора серным эфиром при -10 С, с последующей конден0 сацией полученного цианэтильного производного нуклеотида с нуклеотидным компонентом в присутствии конденсирующего агента триизопропилбензолсульфонилхлорида (ТПС). Выход целевого продук цианэтильных производных конденсирующего агента ДЦК, обладающего ярко выраженными аллергенными свойствами (особенно опасны его пары и эфирные растворы), и повышенная взрыво- и пожаро-опасность процесса вследствие применения больших количеств огнеопасных растворителей (серный эфир и циклогексан для удаления jLUK).

730691 4 опасность процесса при выделении цианэтильного производного в результате замены экстракции циклогексаном (ДИК) и осаждения в серном эфире обычной хроматографией, например на силикагеле в системе хлороформ-метанол.

Кроме того, в качестве фенил (низший) алкилпроизводных применяют триизопропилбензолсульфонилхлорид или меэитиленсульфонилтриазолид (МСТ).

Выход целевого продукта 32-40%.

Пример. 1. Синтез 5 -фосфорилI I деэокситимидилил-(3 -5 ) дезокситимидина Д (рТ-Т) с исполыованием дицианэтилового эфира (б CE рТ), полученного с помощью ТПС, 2 а) Бианэтилирование О рТ.

Смесь 1,37 r (4 ммоль) дезокситимидин-5 фосфата (5pT), 0,68 мл цианэтинола (CEOH) высушивают упариванием с абсолютным пиридином.

Остаток после упаривания растворяют в 16 мл пиридина, добавляют в раствор

3,64 г (12 ммоль) ТПС и встряхивают реакционную смесь 20 ч при комнатной температуре в условиях, исключающих попадание влаги. При охлаждении до 0 С

О к смеси прибавляют 16 мл предварител - но охлажденной воды, выдерживают 3 ч при 4 С. Реакционную смесь концентрио руют в вакууме до минимального объема и упаривают трижды с 30 мл воды. Добавляют 4-5 мл воды и отфильтровывают осадок. Фильтрат упаривают досуха, высушивают упариванием с бензолом. Остаток после упаривания растворят в 40 мл смеси хлороформ-метанол (9:1Ч/Ч ) и наносят на™колонку с 200 мл силикагеля (0,146-0,315 мм). Хроматографируют сначала в линейном градиенте метанола в хлороформе (400 мл СНСр3-400 мл смеси CHC6> — СН ОН, 8;2 V/ ), затем

400 мл смеси (CHCO.З вЂ” СН ОН, 1:1V/ ), собирая фракции по 8 мл/10 мин. Фракции 70-90 (32000 О Е 7) упаривают, получают маслообраэный остаток, содержащий 2,7 ммоля СЦдрТ (67,5% в расчете наД рТ). б) Конденсация нуклеозидного компонента (6CE pT) с нуклеотидным компонентом (дрТ-ОАс).

1,9 г (4,2 моль) 3-0-ацетилтимидин-5 -фосфата (6pT-OAc) высушивают упариванием с абсолютным пиридином.

Остаток растворяют в 10 мл пиридина, добавляют в раствор 4 r (13,2 моль)

ТПС и выдерживают реакционную смесь

1-3 ч при комнатной температуре в условиях, исключающих попадание влаги.

К полученному активному производному нуклеотидного комчонента приливают раствор 2,7 мольс1СЕ рТ в 6 мл пиридин» и выдерживают смесь 6 ч при комнатной температуре, При охлаждении до О С к о реакционной смеси прибавляют предварительно охлажденные 20 мл воды и выдер10 живают 12 ч при 4ОС. Охлаждают реакционную смесь до ОоС, приливают 48 мл охлажденного до 0 С раствора 2 н.

МаОН и выдерживают 45 мин при О С.

Нейтрализуют реакционную смесь 300 мл

t5 смолы КРС-2П (P> Н )до рН 8, переносят массу в колонку со 100 мл смолы

КРС вЂ” 2П (Р Н+) и промывают колонку

1,5 л 30%-ного раствора пиридина в воде. Элюат упаривают досуха, растворяют ро в 500 мл раствора триэтйламмонийбикарбоната (ТЭАБ) и наносят на колонку с 200 мл ионообменной смолы ДЭАЭмолселект А-25 (НСО, 2,6. 34 см).

Хроматографируют в лйнейном градиенте г5 ТЭАБ (3 л 0 05 М вЂ” 3 л 0 35 М), собирая фракции по 20 мл/20 мин. Иэ фракций 276-350 выделяют 260000.Е. динуклеотида д(рТ-Т). Выход 32% (в расчете надрТ). В (pT-Т) относительно

30 брТ в системе NH4OAc: ЕС.ОН (3:7) 0,9;

Ей о/Е бо = 0,663 Е280/Емо=0,72;

Е о< /Е о=0,26. Содержание нуклеотидного материала в полученном продукте

94,3k, содержание динуклеотида по данным микроколоночной ионообменной хроматографии 97%.

Пример 2. Синтез 5 -фосфорил- N -анизоилдезоксицитидилил-(3 -5 )1

An — И-иэобутирилдезоксигуанозин д (рС

ibv

) с использованием моноцианэтилового эфира (ОСЕрС ), полученного с помощью ТПС. а) Ыианэтилирование дрС

An

Смесь 1,66 r (3,2 моль) пиридино7 вой соли N -аниэоилдезоксицитидин-5—

-фосфата (CilpC ), 3,2 ммоля трибутиламина (ТБА) в пиридине и 0,68 мл (9,2 ммоль) цианэтанола (CEOH) высушивают упариванием с абсолютным пиридином. Остаток после упаривания растворяют в 16 мл пиридина, прибавляют к раствору

3,64 г (12 ммоль) ТПС и выдерживают реакционную смесь 1,5ч при комнатной температуре в условиях, исключающих попадание влаги. При охлаждении до (-20) С о к смеси добавляют 16 мл воды и выдерживают 12 ч при 40 С. Упаривают рео акционную смесь досуха, остаток вы5 .73О6 сущивают 3-кратным упариванием с диоксаном, растворяют в 20 мл смеси хлороформ-метанол (1:1V/V). B рествор добавляют 50 мл сипикегеля.(0,140-0,315мм) .( тщательно перемешивают массу и с помо- 5 щью вакуума уделяют из нее растворитель, Полученную сухую массу наносят на колонку с 200 мл силикагеля (0,1400,315 мм). Хроматографируют сначала в линейном градиенте метанола в хлоро- 10 форме (700 Мп СНСЬ вЂ” 700 мл смеси

СНС.С вЂ” СН ОН, 8:2V/V), затем 300 мл смеси (СНС ., — СН ОН, 1:1 V/V), собирая фракции по 10 мл/10 мин, Из фракций 55-76 выделяют 14700 О.Е.

<еСЕ рС "р (21в в расчете чай рСвав<, из фракций 78-155-32000 О.Е.qgz

5СЕрС (46% в расчете неорС "<1).

6) Конденсацич: нуклеозидного компонента (дСЕрС4") с нуклеотидным компонентом (дрС<, .,"„).

Смесь 0,7 ммольЦрСЕрС и 2,18r (3,9 моль)th/(О-диизобутирилдезоксигуанозин-5 -фосфата (дрЯ0 " ) высушивают упариванием с абсолютным пиридином, растворяют в 7 мл пиридина. Прибавляют к раствору 1,95 г (7,8 . моль)

МСТ и выдерживают реакционную смесь

30 в течение 5 сут. в темноте в условиях, исключающих попадание влаги, При охлаждении до(-20)QC к реакционной смеси прибавляют предварительно охлажденные

16 мл 1 м раствора триэтиламина (ТЭА) . в пиридине и 8 мл воды и выдерживают .

12 ч при 4 С. Охлаждают реакционную о смесь до (-10) С, прибавляют 39 мл предварительно охлажденного дэ (-6) С о раствора, 2 н. <1еОН и выдерживают о 40

20 мин при 0 С. Нейтрализуют реакционную смесь 200 мл смолы KPC-2П (P Н+) до рН 8, переносят массу в.колонку со 100 мл смолы KPC-2П (Р, Н+) и промывают колонку 1 л 20%-ного раст

45 воре пиридина в воде. Фильтрат уперивеют досуха, растворяют в 200 мл 0,05 М

ТЭАБ и наносят на колонку с 200 мл ионообменной смолы ДЭАЭ-молселект

А-25 (HCO 2,6 34 см). Хроматогра50 фируют в лийейном градиенте ТЭАБ в

10Ъ-ном спирте (1,5 л 0,05 М—

l,5 л 0,4 М), собирая фракции по

12 мл/8 мин, Из фракций 155-220 выделяют 13000 О.Е.2 0. динуклеотида

О(рС - C< ). Выход 64% (в расчете

Щц 2В0 55 наi3CEpC""); К д (рС "n — С< Ь<.() в системе NH4OA<- ° Е<. OH 0,7; 2260 Е280

4 E260/E 00 1 13 ColiepMaHHe

91 6 нуклеотидного материала 95%, содержание динуклеотида по данным микроколо-, ночной ионообменной хроматографии 97%.

Пример 3. Синтез 5 - осфорил— И -изобутирилдезоксигуанилил-(3 -5 )l

-(< -анизоилдезоксицитозина д (рб (AU

С"") с использованием моноцианэтилового эфира (dCEpC "), полученного с помощью ТПС. <В( а) Пианэтилирование о<рС<

Бианэтилирование М-ивобутирилдезоксигуанозин-5 -фосфата (др(„ 8<() проводят. кек описано в примере 2 за исключением того, что смесь 2 r (4, моль) трибутиламмонийной солидрб ", 0,68 мл (9,2 ммоль) СЕОН выдерживают в течение 1 ч с 3,64 r (12 моль) ТПС.

После обработки реакционной смеси пр< водят хроматографию на силикагеле элюируя сначала 700 мл раствора смеси

СНСК>-СН ОН (8:2,VjV), зетем линейным градиентом метанола в хлороформе (500 мл смеси CHC6g — СН5ОН, 8:2, 500 мл смеси CHCE> — CH OH, 2:3, V/Y ), собирая <фракции(по 7 мл/10, мин.

Из фракций 40-95 выделяют 11300 О.Е.

О

6СЕ, р6 f 17% в расчете надpCj "), <- из фракций,190 240-27000 О E. 8 (4-0%) д CEpg

6) Конденсация нуклеозидного компо- нента (дСЕрЕ< ") с нуклеотидным компонентом (дрСог

Конденсацию проводят как описано в примере 26 за исключением того, что в реакцию берут 2,8 г (4,8 моль) пиридиновой соли 3 -С -ацетил- N -анизоил(L ( дезокспцитидин-5 -фосфета, 1,6 ммоль

5GEpg " и 2,51 г (l0,0 моль) МСТ.

После обработки реакционной смеси и удаления защитных групп хроматографируют в линейном градиенте ТЭАБ в

10%-ном спирте (3 л 0,05 М вЂ” 3 л

0,4 М) собирая фракции по 12 мл/8 мин.

Из фракций 155-220 вьщеляют 25000

О.Е. „динуклеотцда g(pQ u С An )

Выход 52% (в расчете надСЕ р );

Юц

Rg 0,7 в системе ЦН ОАс-Е(ОН (3:7, Содержание нуклеотидчого материала

95%, содержание динуклеотида по данным микроколоночной ионообменной хрометсрграфии 97%.

Пример 4. Синтез динуклеотида д рТ-Т) без предварительного дицианэтильного производного, полученного с помощью ТПС.

Получение динуклеотида проводят так семо как описано в примере 1 зе

1. Способ получения динуклеотидов, включающий цианэтилирование нуклеотида избытком цианэтанола в присутствии конденсирующего агента с последующей конденсацией полученного цианэтильного производного нуклеотида с нуклеотидным компонентом в присутствии фенил (нис ший ) алкилсульфонилпроизводных, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса, применяют 2-3 кратный избыток цианэтанола, а в качестве конденсирующего агента стадии цианэтилирования — триизопропилбензолсуль фонилхлорида.

2. Способпоп. 1, отличаю— щ. и и с я тем, что в качестве фенил (низший): алкилпроизводных применяют триизопропилбензолсульфонилхлорид или мезитиленсульфонилтриазолид.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Бадашкеева А. Г., Берлин Ю. A. и др. Синтез олиго- и полинуклеотидов, ХПС, 1973, М 3, 394 (прототип).

itú,;Ф. °:.. °, j.

7, ". 73069 исключением того, что к реакционной смеси, полученной при взаимодействии 2,07 г (6,4 ммоль) триэтиламмонийной соли брТ и 1 мл (14,9 . моль) СЕОН с

5,45 r (18 моль) ТПС, приливают

5 раствор активного производного нуклеотидного компонента, полученного при взаимодействии 5,85 r (13,2 моль) пиридиновой соли ДрТОЛс с 11,8 г (39:моль)

ТПС. После разложения реакционной 0 смеси, как описано в примере 1 б 50 мл воды, удаляют цианэтильные и ацетильные защитные группы с помощью обработки

60 мл концентрированной МН„ОН в тече-ние 5 ч при 60оС. Упаривают раствор ts и отфильтровывают осадок. Фильтрат разбавляют водой до 3 л и наносят на колонку с 750 мл ионообменной смолы

ДЭАЭ вЂ” молселект A-25 (НСО, 40" 5см), Хроматографируют в линейном градиенте 20

ТЭАБ (0,0 М 5 л — 0,5 М 5 л), собирая фракции по 42 мл/7 мин. Из фракций

230-272 выйеляют.49000 О.Е ре динуклеотидай(рТ-Т). Выход 40% (в расчете на ЙрТ). продукт идентичен по качеству продукту, полученному в примере 1.

1 8

Фор мула из об ретения

Составитель Л. Никулина

Редактор B. Зарванская Техред М. Кузьма Корректор М. Шароши

Заказ 1449/7 Тираж 495 Подписное

БНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4