Способ получения фракции сывороточного альбумина

 

о Ы ). л"н и к

ИЗОБРЕТЕНИЯ

1 (ii) 736861

Сеюз Соаатскмя

Сфцмапнстнческмя

Респубяик

К ПАТЕНТУ (6I ) Дополнительный к патенту (22) Заявлено21.07,77 (2!) 2528199/28-13 (23) Приоритет -, (32) 22.07. 76. (8t) 707906 (33) С1))А (5!) М. Кл.

А 61 К 37/02

) осударственн))и аоми е

ГГГР по лелач м)пбрегепнй и открытий (53) УДК 615. 361. .018.51/55 (088.8) Опубликовано 2505,80. Бюллетень № 19

Лата опубликования описания 26.05,80 (721 Авторы

Иностранцы я ар (Н ) Левис Ир и, эмс Михаел Шук (CtOA) Ф (7!) Заявитель

Иностранная фирма Монсанто Компани (США) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРАКБИИ СЫВОРОТОЧНОГО

АЛЬ БУМИНА

Изобретение относится к медицине„а именно гематологии.

Известен способ получения фракции сывороточного альбумина путем адсорбции на нерастворимых в воде поперечно, сшитых полиэлектролнтных сополимерах этилена с ангидридом малеиновой кислоты с содержанием дополнительных диметиламинопропиловых функциональных групп с последующим элюированием целевого продукта (1) .

Однако известный способ не обес-, печивает высоких чистоты и выхода целевого продукта (67%) .

Белью изобретения является повышение чистоты и выхода целевого продукта, Это достигается тем, что адсорбцию проводят на сополимере при рН

5,0-5,5 и температуре 65-72 С в течение 1-4 ч и затем устанавливают рН смеси 3,5-4,5.

Сывороточный альбумин получают из крови, кровяной плазьы, кровяной сыворотки и их фракций, содержащих альбумин, Так как при нагревании возможно денатурирование содержащихся в обрабатываемом материале глобу, лииов, то сначала выделяют определенные необходимые глобулиновые фракции, как у -глобулины. другие фракции крови, как факторы свертывания крови, и протромбиновый комп-

6 лекс также выделяют иэ плазменного исходного материала, Нерастворимые в воде поперечносшитые полиэлектролитные сополимеры являются сополимерами этилена

10 с ангидридом малеиновой кислоты с содержанием дополнительных диметиламинопропиловых функциональных групп. Основной сополимер этилена с ангидридом малейновой кислоты

15 (ЭАМК) получают путем взаимодействия этилена с ангидридом малеиновой кислоты в присутствии катализатора на бснове перйкисй" s "соответствующем растворителе. Основной сополиQO мер этилена с ангидридом малеиновой кислоты затем подвергают взаимодействию с метилиминобиспро)тиламином, содержащим две первйчные амйновые группы, получая поперечно

26 сшитый ЭАМЩ-сополимер. Желательные диметиламинопропиловые функциональные группы могут быть затем добавлены в поперечно сшитый полимер путем взаимодействия диметиламинопро40 )))ламина с ангидридными группами

736861

ЭАМК-сополимера. Полиэлектропитный сополимер предпочтительно превращают в солянокислую соль для достижения большей технологичности продукта.

Предпочтительный полиэлектролитный сополимер содержит около 5 метилаьынобиспропиламиновых сшивающих групп и около 90 дополнительных диметиламинопропиламиновых функциональных rpynn на 100 ед. ангидрида малеиновой кислоты в ЭАМК-сополимере. Полкэлектролитный сополимер способен в Основном полностью адсорбировать Весь альбумин кровяной фракции, после чего альбумин можно выделять с выходом выше 90% с 94%-ной чистотой, применяя способ горячей обработки и селективного элюирования.

Полиэлектролитные сопалимеры смешивают с кровяной плазмой или сывороткой, или альбуминсодержащими фракциями крови, предпочтительно в концентрациях 1-5% сополимера. Ре гулировкой значения рН смолисто-белковой смеси на разные уровни вначале удаляют выборочные белки, При рН 5,5-7,5 смолой адсорбируются альоумин, OC и р -глобулины и фиб риноген, в то время как большая| часть у -глобулина остается не поглощенной и может быть выделена из остатка для терапевтических целей.

Первоначальное выделение " -глобуJIHHa осуществляют при рН 6. Часть поглощенных о(и g, -глобулинов и фибриногена выделяют доведением рН смоли сто-белковой смеси примерно дб

4,7 с последующим сбором десорбированного остатка.

Значение рН смолисто-белковой смеси затем доводят до 5,0-5,5 с нагревом до температуры примерно

65-72 С в течение 1-4 ч, рН регулируют в пределах 5,2-5,3 с нагреванием смолисто-белковой смеси примерно при- 72аС в течение 1 ч.

При осуществлении стадии горячей обработки остаточные глобулины, в основном с и р «глобулины, денатурируются, в то время как альбумин не денатурируется и легко поддается выделению. После обработки нагревом рН доводят до 3,5-4,5 для элюирования из смолисто-белковой смеси желательного альбумина. Смолисто-белковую смесь перед регулировкой рН охлаждают, после чего значение рН доводят до 4. Выделяют альбумин осаждением, фильтрацией или цеитрифугированием, предцочтивельным способом является фильтрация смолисто-белковой смеси с отрегулированным рН, промывка жмыха и сбор фильтрата в виде желательной альбуминовой Фрак:ции,высокой степени чистоты. Регулировку рН на необходимый уровень осуществляют обработкой кислотным или щелочным буфером, например буфером на основе ацетата натрия - уксусной кислоты или же лимонной кислоты, в целях подкисления или обработкой бикарбонатом натрия или гидроокисью натрия для подщелачивания. Предпочтительным является применение стабилизаторов альбумина, как натрийацетилтриптофанат и натрийкаприлат смеси смола-белок во © время обработки нагревом с учетом их стабилизирующих свойств.

Пример 1. Полиэлектролитный полимер состоит из смолистого продукта взаимодействия в основном зквимолярных частей этилена с ангидридом малеиновой кислоты (АМК), поперечно сшитого метилиминобиспропиламином (МИБПА) н затем подвергнутого взаимодействию с диметиламинопропилаиином (ДИПА) таким образом

20 чтобы образовалось около, пяти МИБПАсшивающих групп и около 90 ДМПА-дополнительных групп на 100 ед. АМК в

AMK-сополимере, н превращенного в солянокислую соль. Вначале полиэлектролитный сополимер промывают в

0,04 М хлористом натрии. Плазму, полученную из смешанной человеческой крови, разбавляют с применением

3 частей воды на 1 часть плазмы,после чего примешивают 2 вес,В промытого полиэлектролитного сополимера (2 г/100 мл) . Значение рН смеси смола-плазма доводят до 6,0, затем

30 мин перемешивают, фильтруют н промывают 0,002 M хлористым натрием.

Фильтрат, в основном состоящий из г-глобулинов, В -глобулинов,фибриногена и ассоциированных кровяных факторов, выделяют нз полученного смолисто-белкового остатка на фильтре.

40 ))оследний, содержащий адсорбнрованный anьбумин, подкнсляют до рН 5,2, Для достижения 0,012 М концентрации к адсорбированному смолой белку примешивают над45 лежащее количество стабилизатора на основе каприлата натрия, для достижения 0,002 М концентрации добавляют хлорйстый натрий. После этого в течение 1 ч при 70 С поглоо

50 Шейный смолой белок нагревают, потом материал фильтруют, фильтрат выбрасывают °

Альбумин элюируют из оставшегося смолисто-белкового жмыха путем под55 кисления до РН 4,0 в 0,002 М хлористом натрйи лимонной кислотой, затем 30 мин перемешивают и фильтруют. Фильтрат собирают в виде желательной альбуминовой фракции с выходом 96,6% (в пересчете на кон60 центрацию альбумина в первоначальной плазме) при степени чистоты

98,5%. Степень чистоты элюированного из смолы альбумина определяют

У агар-гель-электрофорезом в буфере

45 на основе диэтилбарбнтуровой кисло736861

Формула изобретения

1. Патент CIA 9 3555001, кл. 266-112, опублик. 1969.

Составитель С. Малютина

Редактор Т. Смирнова Техред H.Êîâàëåâà Корректор С. Щомак

Заказ 2 456/49 Тираж 673 Подписное

БНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская иаб., д, 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, Ул,.Проектная, 4

4 ты при рН 8,6 с применением электро фореэного устройства, Счет производят прн 600 нм с помощью денситометра, Синий типа Соо мс зе1е Br(N.iant

Slue R 250 является протеиновым кра» сителем высокой чувствительности.

3а счет высокой степени чувствительности синий типа Coo asie вг и Ьл1

B ue R 250 допускает определение белковых примесей в альбуминовом продукте с очень большой точностью, а проведенный количественный анализ подтверждает получение альбумина высокой степени чистоты.

Пример 2. Повторяют способ примера 1 эа исключением того, что исходная плазма представляет собой

AHF-обедненную плазму. Выход и степень чистоты альбуминового продукта в основном такие же, как в приме. ре 1.

Пример 3. Повторяют способ примера 1 за исключением того, что включают промежуточную стадию между первой фильтрацией и горячей обработкой в целях удаления дополнительных глобулинов и фибриногена из плазмы, На этой промежуточной стадии рН смолисто-белкового остатка на фильтре от первой фильтрации доводят до 4,7 в 0,002 М хлористом натрии лимонной кислотой, перемешивая затем в течение 30 мин. Смесь фильтруют, проьывают и потом подвергают обработке нагревом, затем стадиям примера 1. Фильтрат от обработки с достижением рН 4,7 содержит Ф и р -глобулины и фибриноген, которые собирают для использования в различных известных терапевтических и диагностических целях. целевой альбумин получают с выходом и степенью чистоты в основном аналогичными примеру 1.

Следуя способу выделения очищенного альбуминового продукта, альбуми B концентрируют до требуемого уровня рй концентрированного продукта доводят до физиологически приемлемого значения и содержания электролита, затем нагревают для уничтожения вирусов, доводят до прозрачного состояния фильтрацией или иными способами для получения клинически пригодного вещества, соответствующего требованиям, предъявляеьим к обычному сывороточному материалу. К прецаочтительному спосо бу концентрироваиия ггрнменяемому на практике, отвертятся лиофилиэацня с последующим перерастворением до желательной концеверацин, например

15 5 или 25%-ная удьерафильтрация.

Предлагаемый сиесоб позволяет повысить выход целевого продукте дб

96,6% при степени чистоты 98,5%.

Способ получения фракции сывороточного альбумина путем адсорбции

25 на нерастворимых в воде цоперечяо сщитых полиэлектроаитных сополимерах этилена с ангидридом маленковой кислоты с содержанием дополнительных диметиламинопропиловых фун

30 RoHcUzbHHx групп с последую ироваьием целевого продукта, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повьиаения чистоты и выхода це. левого продукта, адсорбцию проводят на сополимере при рН 5-5,5 и температуре 65-72оС в течение 1-4 ч и затем устанавливают рН смеси 3,54,5.

Источники информации, 4Q принятые во внимание при .экспертизе