Способ усиления роста нежвачных животных

 

Союз Советскнк

Соцналнстических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (ю 75 13О9 (61) Дополнительный к патенту— (51)М Кл 3 (22) Заявлено 100876 (21) 2137352/15/

/2388104/30-15 (23) Приоритет — (32) 17. 01. 75

А 23 К 1/17

Государственный комитет

СССР ио делам изобретений и открытий (33) 541800 (33) США

Опубликовано 230780Бюллетень М9 27

Дата опубликования описания 2$0780 (53) УДК 815. 77Э . Э:

:б41.18(088.8) Иностранцы

Вальтер Даниель Селмер, Вальтер Патрик Каллен, Джон Бродерик Раутин (США), Чарльз Эдвард Моппетт (Великобритания), Риичиро Сибакова и Дзюнсюке Тоне (Япония) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Пфайзер Инк" (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ УСИЛЕНИЯ РОСТА НЕЖВАЧНЫХ

ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к способу усиления роста нежвачных животных, например, свиней.

Известны способы усиления роста животных путем введения в корм препаратов антибиотиков (1j .

Недостатком известных способов является их незначительная эффективность.

Цель изобретения-повышение эффективности способа усиления роста . нежвачных животных путем улучшения использования ими корма.

Это достигается тем, что в качестве препарата антибиотика исполь- 15 зуют смесь основного макроциклического лактона и депсипептида в соотношении 1:2-1, продуцируемую штаммом

Act i nop cranes au raut i co Eor ATCC 31011.

Новые синергетические смеси анти- 20 биотиков, охватываемые изобретением, дополняют семейство других описывавщихся синергетических смесей микамйцина, пристинамицина, остреогрицина, стрептограмина, P.A. 114, вернамицинз

25 и виргиниамицина.

Изобретение охватывает применение смеси. антибиотиков, получаемой при проведенном в погруженном состоянии аэробном росте Actinopganes aurauticotor ATCC 31011 в водной питательной среде. Эта смесь, содержащая макроциклические лактоны и депсипептиды, может быть выделена и рекуперирована иэ ферментационного бульона путем экстракции растворителем, противоточного распределения,.колоночной хроматографии или комбинацией этих способов. Индивидуальные компоненты антибиотиков обладают существенной бактерицидной активностью. Сырая смесь антибиотиков или комбинация чистого макроциклического лактона и чистого депсипептида, полученных из сырой смеси, показывает значительную синергетическую бактерицидную активность. Сырая смесь антибиотиков, чистые индивидуальные компоненты и смеси чистых макроциклических лактонов и депсипептидов являются эффективными агентами увеличения роста цыплят и свиней и терапевтическими агентами при лечении дизентерии у свиней. у4икрооргани3И, пригодный для получения антибиотиков, изобретением, был выделен из образца почвы из

Египта. Для выращивания пользовались картофельно-"морковным агар-агаром

751309 и было установлено, что он принадлежит к классу антиномицетов, дающих спорангий, подобный спорангию вида

Actlnopkanes. Поэтому для роста пользовались различными средствами, применявшимися при выращивании этйх видов. Суспензии культуры готовили путем дробления кусков культуры, снятой с пластинок с агар-агаром. Эти суспензии употребляли для выращивания культуры в пробирках, на пластинках или в чашках Петри, на различных средах. Температура инкубации составляла 28 С. Результаты опытов фиксиро. вали через интервалы вплоть до 22 дней при некоторых опытах, но большинство результатов регистрировали через

14 дней. Окраска культуры оценивалась по Иэрцу и Паулю (" Словарь окрасок", 2-ое издание, 1950.). Эта новая культура (Пфизер Г. 24090) была доставлена в Американскую Коллекцию Типов 20

Культур в Роквилле, Мэриленд, 11 марта 1974 и получила название Actinoplanes auraut i condor АТСС 31011.

Среды для итендификации, применявшиеся для охарактеризования культуры 25 и ссылки на их состав, приведены ниже:

23-ный агар-агар на водопроводнойводе

Картофельно-морковный агар-агар (следует испольэовать только 30 r картофеля и 2,5 r моркови на 20 r агар-агара)

Сахарный агар-агар Чапека

Глюкозно-аспарагиновый агар-агар

Агар-агар с экстрактом дрожжей и солодом

Агар-агар Хики и Треснера

Картофельно-глюкоэный агар-агар

Крахмальный агар-агар

Желатина ¹0

Тирозиновый агар-агар

Железо-пептоновый агар-агар Дифко

Снятое молоко Дифко

Декстрозно-нитратный бульон

Среды Р 1 с 3,0 г глюкозы вместо сахароэы и без агар-агара

Бульон на основе органического соединения и нитрата

Среда АТСС 172

Использование углерода„

Агар-агар на водопроводной воде:. рост слабый, колонии тонкие, плоские, примерно 902 (очень слабо-розовые); воздушный мицеллий отсутствует,субстрат мицеллия от бесцветного до

902; растворимый пигмент отсутствует.

Сахарозный агар-агар Чапека: рост от умеренного .до хорошего, колонии плоские, .примерно 966! (светло-оран-жевые);воздушный мицеллий отсутству- фо ет; субстрат мицеллия около 906; растворимый пигмент отсутствует.

Глюкозно-аспарагиновый агар-агар: рост умеренный, колонии воэвышанициеся, шероховатые, примерно 9L9 (светлооранжевые); воздушный мицеллий отсутствует, растворимый пигмент отсутствует. Агар-агар с экстрактом дрожжей и солодом: роста не наблюдается. . Агар-агар Хики и Треснера: рост от умеренного до хорошего, колонии слегка возвышаются и шероховаты, примерно 9F9 (мутно-оранжевые); слабый беловатый налет на поверхности: субстрат мицеллия примерно

918, бледно-коричневатый растворимый пигмент.

Картофельно-глюкоэный агар-агар . рост умеренный, колонии возвышающиеся, шероховатые, примерно 9L9 (светлооранжевые), воздушный мицеллий отсутствует: субстрат мнцеллия примерно

9L9; растворимый пигмент отсутствует.

Тирозиновый агар-агар: рост от слабого до умеренного, колонии плоские, примерно 13А10 (мутный красноватооранжевый цвет),воздушный мицеллий отсутствует, субстрат мицеллия примерно 10011, коричневый растворимый пигмент.

Желатина: рост умеренный, колонии плоские, примерно 9К12 (красноватооранжевые), следы беловатого налета, субстрат мицеллия примерно 9К12; растворимый пигмент отсутствует.

Крахмальный агар-агар: рост от умеренного до хорошего, колонии возвышающиеся, примерно 9К10 (оранжевые), слабый беловатый налет, субстрат мицеллия примерно 9К10; светложелтый растворимый пигмент.

Крахмал подвергается слабому гидролизу; степень сжижения желатины высокая, нитраты не восстанавливались до нитритов, в любой среде, содержащей нитраты, даже за 22 дня (рост был очень слабым в декстрозно-нитратном бульоне, но хорошим в бульоне, содержащем органические вещества и нитрат); образование сероводорода — незначительное; в железо-пептоновом агар-агаре образования растворимого пигмента не .наблюдалось, в молоке не наблюдалось коагуляции или гидролиза даже через 2 дня; тирозин не дигерировался; рост в среде ATCC 172 наблюдался:при 21- 37 С, при наилучшем росте при 28-37 С; при температуре

45 С роста не наблюдалось. Арабиноэа, фруктоза, глюкоза, маннит, раффиноэа, рамноэа, сахароза и ксилоза потреблялись; иноэит не потреблялся. Ни для какой из сред. не наблюдалось запаха.

Спорангий образовывался лишь на картофельно-морковном агар-агаре. При этом образовывался палисадный слой.

Измерения указали на 5,5-11х4,5-8 мкм по ширине и широте и 9-12 мкм по высоте. Колонии были многочисленными, неправильными по форме и выбрасывали споры при постепенном размягчения.

Спорангий на картофельно-морковном агар-агаре по прошествии трех недель иикубации выделял споры за несколько

751309 часов при температуре около 21 С, если куски колоний погружали в «ебольшое количество раствора 1 r глюкозы и 1 мл "твина 80" в 1 л воды.

Споры образовывали цепочки «е«равильной формы в спорангии, но, будучи освобожденными от спорангия, становились субглобозными и имели шир««у от 1,6 мкм до эллиптической широкой формы 1,6-2,2х1,1 — 1,6 мкм. Почти все они были подвижными.

Попытка идентификации привела к сравнению этой культуры с A. aurauticoYor ATCC 15330. Новые штаммы А. айагaut i со1ог ATCC 31011 и А. айагallt icofor ATCC 15330 выглядели по существу сходными с морфологической точки зрения, окраски и растворимого пигмента на агар-агаре Беннета, питательном агар-агаре, агар-arape с экстрактом дрожжей, глюкозно-аспараги«овом агар-агаре, глицерино-аспарагиновом агар-агаре, агар-агаре с яблочно-кис.лым кальцием и агар-агаре с тирозином

Ни одна культура не восстанавливала нитратов до нитритов; обе они образовывали небольшое количество сероводорода и не образовывали меламина на железо-пептоновом агар-агаре, обе они вызывали гидролиз крахмала.

A.aurauticoEor ATCC 15330 не вызывал изменений снятого молока в пробирках, в то время, как новая культура вызывала осветление трех из шести пробирок с молоком и по прошествии

21 дня образовывался желто-кремовый пигмент.

A.àurautico lor АТСС 31011 потреблял глюко=-у, арабинозу, фруктозу, маннит, раффинозу, рамнозу, сахарозу и ксилозу. А.аогautico lor ATCC

15330 потреблял все эти сахара, за исключением раффинозы. Спорангий и споры двух культур были сходными причем споры A. au raut i co lo r 15330 были более сходными со стерженьками.

A.auraut i color ATCC 15330 не проявлял какой-либо бактерицидной активнг>сти в условиях ферментации.

А.auraut i color ATCC 31011 образовывал смесь антибиотиков, охватываемую изобретением.

Культивирование A.aurauticoior

АТСС 31011 предпочтительно происходит в водной питательной среде при 28-36 С в погруженном, аэробном состоянии, при перемешивании.

К числу питательных сред, полезных для этих целей, относятся те, в которые включаются источник усваиваемого углерода, такие как сахароза, крахмал, и мелассы; источник органически связанного азота, такие, как казеин, продукт энзиматического дигерирования казеина, соевая мука, мука из семян хлопчатника, мука из арахиса и глютен пшеницы. Источниками роста могут так60 б5 дованием различного типа, например, фильтр-прессы, центрифуги и т.д.

Полезным способом является метод тонкослойной хроматографии на силикагеле; этот метод служит для анализа смеси антибиотиков, полученных в фериентационной среде, и дает возможность установить состав сырых и очиже явиться отходы винокуренных заводов, рыбья мука и экстракт дрожей, — также соли такие, как хлористый натрий и карбонат кальция и следовые «еорга«ические вещества, такие как железо, магний, цинк, кобальт и марганец, которые также дают хорошие результаты. Если во время ферментации происходит черезмерное пенообразова«ие, то можно вводить такие антипе«ообразователи, как растительные масла или силиконы, добавляемые к питательной среде. Аэрация среды в резервуарах при выращивании культур B погруженном состоянии, предt5 почт«тель«о проводится со скоростью около 1/2-2 объема свободного воздуха на объем бульона в минуту. Скорость перемешивания поддерживается при помощи мешалок, обычно сходных с теми, которые употребляют в бродиль2О Hoif промышленности. Само собой разумеется, что следует поддерживать асептические условия ва время переносов организма и в течение всего его роста.

25 Агент инокулирования для приготовления смеси антибиотиков может быть получен путем использования культуры с пластинки культуры на среде, например, ATCC 172.

30 В колбах при перемешивании рост обычно достигает своего максимума по прошествии примерно 4 дней, в то время как при инокулировании в резервуарах наиболее благоприятным периодом является период от 2 до

3 дней. Значительная бактерицидная активность достигается на конечной стадии ферментации примерно за

20-30 час.

40 Способ производства антибиотиков во время процесса ферментации обычно контролируется биологическими проверками бульона в применении чувствительного штамма Staphylococcus

aureus. При этом применяется стандартный метод испытаний на пластинке, при котором зона ингибирования, окружающая кружок фильтровальной бумаги, насыщенной бульоном, принимается за меру бактерицидной активности. После того, как бактерицидная активность сбраживаемого бульона достигла желаемого уровня, продукты выделяют либо из всего бульона, либо из профильтрованного бульона.

В последнем случае мицелий удаляют путем отфильтровывания или центрифугирования. Можно пользоваться о6ору751309 щенных материалов, выделенных экстракцией из сбраживавшихся бульОнов. Разделение компонентов смеси антибиотиков, само собой разумеется, зависит от содержания антибиотиков в системе.

Слишком малая бактерицидная активность 5 не дает возможности обнаружить те компоненты антибиотика, которые присутствуют в малых количествах; слишком высокая бактерицидная активность приводит к эффекту сопротивления с вытекающим из этого неудовлетворительным разделением.

Система проявителей при тонкослойной хроматографии представляет собой смесь хлороформа с этанолом

13 и ° (9:1). Тонкослойные хроматограммы после проявления могут осматриваться в ультрафиолетовом свсте при длине волны 254 и 366 ммк.Биоавтографическое обнаружение бактерицидных компонентов может быть осуществлено путем наложения тонкослойной хроматограммы на агар-агар с питательными веществами, в который внесены зародыши чувствительного штамма AtaphyEococcus aureus или другого чувствительного организма.

К числу главных компонентов смеси антибиотиков, выделяемой A.aur uticoFor АТСС 31011, относится ряд макроциклических лактонов и депсипептидных бактерицидных компонентов. Появление или непоявление или процентный состав смеси этих антибиотиков меняется от ферментации к ферментации и является функцией времени., величины рН,, соста- »»

;"4 » ва среды и т.д. При наборе условий приведенных в примерах, главными бактерицидными компонентами смеси анти.биотиков являются Соединения 37277, (депсипептид) и 39926 (макроцикли- 40 ческий лактон), в то время, как к числу бактерицидных компонентов, присутствующих в незначительном количест. ве, относятся Соединения 37932 (депсипептид) и 35763 (макроциклический 45 лактон).

Компоненты смеси антибиотиков могут быть разделены и выделены из ферментациойного бульона при применении самых различных способов„ вклю- 50 чающих экстракцию растворителей, противоточное распределение по Крэгу, колоночную хроматографию или комбинацию этих способов. При экстрации антибиотиков из бульона можно поль- 55 зоваться различными органическими растворителями, такими как хлороформ, этилацетат и метилизобутилкетон.

Экстракцию растворителей предпочтительно проводят путем двукратнои экстракции бульона при величине рН

7 при помощи объема растворителя, примерно равного 1/3-1/2 объема бульона, из которого желательно выделить смесь антибиотиков. В зависимости от применяемого объема бульона пользуются различным оборудованием, таким как делительные воронки, резервуары с мешалками и механическим оборудованием для экстракции, например, центрифужные сепараторы, которые дают возможность осуществить процесс экстракции.

Рекомендуемый метод выделения и рекуперации компонентов смеси антибиотиков заключается в следующем: либо не осветленный, либо осветленный бульон доводят до величины рН около 7 и экстрагируют двумя порциями метилизобутилкетона, объем которых составляет от примерно 1/3 до 1/2 объема экстрагируемого бульона.

Экстракт в растворителе концентрируют в вакууме и концентрант обезжиривают путем экстракции его гептаном или петролейным эфиром. После этого обезжиренный экстракт в растворителе выпаривают досуха в вакууме.Твердые вещества подвергают противопоточному распределению по Крзгу (6 тарелок) с,использованием 5 ч. толуола, 2 ч. этанола, 3 ч. водного фосфатного буферного раствора c pH 4,5. Разделившиеся слои образуют верхнюю и нижнюю фазы системы противоточного распределения. После распределения слои анализируют методом тонкослойной хроматографии. Разделенные фракции выпаривают досуха в вакууме.

Твердые вещества, содержащие депrèïåïòèäû, растворяют в хлороформе, обрабатывают активированным древесным углем, фильтруют и выпаривают в вакууме. Остаток, полученный после выпаривания хлороформа, растворяют в ацетоне. Твердые вещества, осадившиеся при прибавлении гептана, растворяют в небольшом количестве хлороформа и вносят в колонку силикагеля, забуференного до рН 6, изготовленную в присутствии хлороформа и н-пропанола, в соотношении 99:1 об/об. Колонку проявляют той же системой растворителей под давлением 5600 н/м . Отдельные участки колонки контролируют методом тонкослойной хроматографии.

Фракции, содержащие разделенные депсипептиды, объединяют, выпаривают в вакууме и содержимое их кристаллизуют из ацетона-гепатана.

Фракции, полученные противоточным методом, содержащие макроциклические лактоны, объединяют, выпаривают в вакууме и твердые вещества растворяют в этилацетате. Раствор перемешивают с силикагелем, фильтруют и растворитель удаляют в вакууме. Остаток растворяют в этилацетате и производят осаждение гексаном. Твердые вещества разделяют в небольшом количестве хлороформа и хроматографируют под давлением 5600 н/м на колонке силикагеля, забуференной до рН 6,0 и изготовленной в присутствии этилацетата.

751309

Для проявления пользуются системой из этилацетата тетрагидрофурана и гексана в соотношении 80:20:20. Участки колонки контролируют методом тонкослойной хроматографии, фракции, содержащие разделенные макроциклические 5 лактоны, объединяют и выпаривают в вакууме. Отдельные фракции обрабатывают дополнительным противоточным распределением по Крэгу и/или колоночной хроматографией с использовани- 10 ем различных систем проявителей.Тщательное контролирование каждой стадии очистки дает воэможность выделить индивидуальные макроциклические лактоны в достаточно чистом состоянии, так что фракции в растворителе могут быть выпарены досуха с получением чистых компонентов.

A. auraut i со1ог АТСС 31011 по меньшей мере четыре депсипептида и по 20 меньшей мере четыре макроциклических лактона. Однако, первичными компонентами являются депсипептиды. Соединения 37 277 (основные) и 37 932 (побочные) и макроциклические лактоны-25

Соединения 36 926 (основные) и 35 763 (побочные).

Сырые смеси антибиотиков, получаемые непосредственно иэ бульона и очищенные индивидуальные компоненты 30 обладают широким спектром бактерицидных свойств.

Максимальная синергетическая активность у комбинаций очищенных макро-35 циклических лактонов и депсипептидов была достигнута при интервале соотно-, шений 1-2:1. Примерно такие же соотношения наблюдаются для ферментационных бульонов A. aurautico For АТСС,ц

31011 и для выделенных из них сырых смесей антибиотиков. Это открытие является противоположным тому, что наблюдается для других синергетических смесей антибиотиков, для которых синергетические факторы наблюдаются у ферментационных бульонов и сырых смесей при суб-оптимальных соотношениях.

Антибиотик представляет особый интерес в качестве агентов усиления роста домашней птицы и животных из-эа их широкого бактерицидного спектра. Промотирующая рост активность сырой смеси антибиотиков опрецелялась на молодых поросятах в течение 40 дней.

Средний дневной привес, потребление корма и эффективность оказались значительно улучшенными (р < 0,01) по сравнению с неполучавшими антибиотиков контрольными животными (табл.1.)

Сходные результаты были также получены при даче индивидуальных чистых Соединений 36 926, 27 932 и 37 277 или смесей чистых соединений, приближающихся по своему составу к составу сырых смесей антибиотиков.

Эффективность с очки зрения усиления роста была продемонстрирована при проведении опытов на цыплятах, в корм для которых вводили антибиотики. Значительное улучшение (р с 0,01) привеса по сравнению с не получавшими препарата контрольными цыплятами наблюдалась для цыплят, получивших в своей диете антибиотики (табл. 2).

Пример 1. Одновременно цыплята-бройлеры, самцы однодневного возраста, породы Хаббард, получали кормовые рационы, содержащие бацитрацин (10 г/т ) виргинамицин (10 ч. на 10 ) и сырую смесь данных антибиотиков, партия 1 (10 частей на 10 ) в течение 21-дневного

6 периода выращивания. Полученные данные показывают, Что виргиниамиция и сырая смесь антибиотиков являются по существу одинаковым с точки зрения улучшения характеристик за период времени в 21 день, а данные, полученные при употреблении бацитрацина, оказались несколько худшими (см. табл. 3).

Пример 2. Из 500 однодневных самцов цыплят-бройлеров породы

"Хаббард" были выбраны 360 цыплят для проведения экспериментов. После четырехднейной выдержки цыплят взвешивали„ и разделяли на группы для проведения обработки. Цыплят отдельных групп взвешивали через

3-7 дней (см. табл. 4. )

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что предложенные препараты антибиотиков способствуют усилению роста животных и птиц и вызывают эффективное использование корма по сравнению с другими препаратами антибиотиков.

751309

Таблица 1

2,57

0,35

0,91

2,15

1,35

0,63

1 кг корма на 1 кг привеса

Таблица 2

566

939

1,66

Контроль

608

1,56

949

Таблица 3

21

21

Сырая смесь предложенных антибиотиков

939

1,66

1,59

936

Виргиниамицин (10 частей на 10 ) 611

1,57

1,56

608

949

Формула изобретения

Контроль

Опыт (50 ч. антибиотиков на 10 ч. корма) Опыт (10 ч. антибиотиков на 10 ч. корма) Без антибиотиков

Бацитрацин

Виргиниамицин

Без антибиотиков 566

Бацитрацин (10 г/т) 590

Сырая смесь предложенных антибиотиков (10 частей на 10 ) Способ усиления роста нежвачных животных, включающий введение в корм препаратов антибиотиков, о т0 60

0 60

0 60

10 0 60

Т а б л и ц а 4 л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения эффективности способа путем улучшения использования корма животными, в качестве препара-

65 тов антибиотиков вводят смесь основ751309

Составитель Л. Мурая

Техреду„Ковалева Корректор И.Муска

Редактор Д. Пинчук

Заказ 467б 48 Тирам 569 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. агород, ул. Проектная, 4 . 3 ного макроциклического лактона и депсипептида в соотношении 1:2-1, продуцируемую штаммом Act f nop lanes

au r aut f co to r ATCC 31011.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

Ъ Патент США 93780174,кл.424-118, 1973.