Способ отделения рецептора глюкокортикоидных гормонов печени крыс от транскортина и транскортинподобных белков

 

%« », «» .» ° .« . Г .,».« °

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ «!

Союз Советских

Социалистических

Ресттублик

<,767119

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ф ф ф (6l ) Дополнительное к авт. свил-ву (22) За и алеко 10.10,77 (21) 2564709/23.04 (51) М. Кл. с присоелинсйкем заявки .%

С 07 G 7/00

Государстваииый комитет (2;j) Приоритет

Опубликовано 30,09.80. Бюллетень ¹ 36

Дата опубликования описания 30.09.80 оо делам изобретеиий и открытий (53) УДК 547.964; .4.07 (088.8) А. А. Ахрем, В. Н. Барай, А. И. Зинченко, С. П. Марцев. и В. Л, Чащин (72) Авторы изобретения

Институт биоорганической химии АН Белорусской ССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОТДЕЛЕНИЯ РЕЦЕПТОРА ГЛЮКОКОРТИКОИДНЫХ

ГОРМОНОВ ПЕЧЕНИ КРЫС ОТ ТРАНСКОРТИНА И ТРАНСКОРТИНПОДОБНЫХ

БЕЛКОВ

Изобретение относится к способу отделения рецептора глюкокортикоидных гормонов пече.ни крыс от транскортина и транскортинподобных белков и может найти применение для исследовательских целей в химии, биологии и фарм ак ологии, В цитоэоле печени крыс среди суммы различных белков наибольший интерес представляет рецептор глюкокортикоидных гормонов, который может найти применение лишь при полном

О отсутствии сопровождающих его в печени транскортина и транскортиноподобных белков.

Для отделения рецептора глюкокортикоидных гормонов печени крыс от примесей применяют хроматографию на сефадексе g = 150 (1}.

Выход целевого продукта при этом достаточно высок (-90%).

Однако этот метод имеет и значительные недостатки:

Он трудоемок, длителен во времени и позволяет получать рецептор только в связанном состоянии (в комплексе с гормоном), так как свободный рецептор инактивируется при прохождении через сефадекс.

Известен также наиболее близкий к предлагаемому способ отделения рецептора глюкокортикоидных гормонов дробным высаливанием его большими концентрациями сульфата аммония (33% насыщение по (ИН4)з 804) (2), Сущность этого способа состоит в обработке цитоэола печени крыс, к которому предварительно добавляют дексаметаэон, водным сульфатом аммония. При этом образуется осадок, обогащенный рецептором и обедненный по отношению к транскортину и транскортинподобным белкам.

Недостатками такого способа являются: низкий выход (-50%), невозможность полного

/ разделения указанных белков и. необходимость последующей очистки от сульфата аммония.

Очистка проводится диализом и является процессом весьм» длительным (10-20 ч); Однако и этим способом не удается получить рецептор в несвязанном с гормоном состоянии, поскольку рецептор инактивируется сульфатом аммония.

Цель изобретения — упрощение процесса и повышение выхода целевого продукта. ч 4

Л- н В-белкам>i) киргиз>>:гсия ьььнзн>щзя активность сунсриатзнтз: крььььзн 3 дсксаметаэонсвяэыван>щая активиосгь осадка ((т-бслок);

1 кривая 4-тсрмостабильизя кортиэолсвяэывающая активность осадка (A- и В-белки).

В серию пробирок, содержащих по 0,8 мл цитоэола вносят ио O, l мл озствора La(N03) 3 до конечной концентрации, укаэанной ио оси абсцисс. Пробы инкубируют 5 мнн, центрифу.

> гуют 10 мин ири !0000,0>, после чего супернатаит оставляют для дальнейшего анализа, а осадок растворяют в 1 мл 0,005 М ЗДТА в ТДГ-буфере. В суиериатанте и препарате, полученном после растворения осадков, .определяют содержание А-, В- и 0-белков.

При анализе содержания А-, В- и G-белков в полученных препаратах исходят иэ следующих данных: а) G-белок способен связывать как дексаметзэон, так и кортиэол.

6) А- и В-белки связывают кортиэол, но не связывают дексаметазон. в) Прогревание при 40 С в течение 20 мин. полностью инактивирует Q-белок, не оказывая влияния на А- и В-белки.

Исходя из этого, о наличии в препаратах

6-белка судят по их дексаметазонсвяэующей активности. Наличие А- и В-белков определяют по кортиэолсвязывающей активности после прогрева препаратов в течение 20 мин, ири

40 С.

Анализ стероидсвяэывающих белков супернатанта.

Каждую пробу супернатанта (1 мл) делят на две равные части (по 0,5 мл). В первой определяют дексаметазонсвязующую активность, обусловленную 6.белком. Вторая, после 20 мин прогрева при 40 С;. служит для определения термостабильной кортиэолсвяэывающей активности, обусловленной А- и В-белками.

К навеске печени адреналэктомированных крыс прибавляют раствор следующего состава: 30

0,02 М трис-НС8-буфер, рН 7,5, 0,001 Ч дитиотреит, 10 об.% глицерина (в дальнейшем

TQI-буфер) (иэ расчета 3 мл буфера на 1 г печени) и ткань гомогенизирун т до получения однородной массы. Здесь и далее все операции о проводят при 0-4 С. Цитрзол-раствор цитоплазматических белков, содержащий рецептор глюкокортикоидных гормонов, получают, отбирая надосадочную фракцию после центрифугирования ! гомогената печени при 105000 Р в течение ! ч.

К 0,9 мл полученного цитозола приливают

0,1 мл 0,05 М водного раствора а(ЙОэ)э.

После 5 мин инкубации йомутневший цитозол центрифугируют при 10000 р в течение 10 мин. . 45

Супернатант отбрасывают, а осадок, содержащий рецептор, дважды промывают небольшими порциями ТДГ-буфера н растворяют в 1 мл

О 0005 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), приготовленной на ТДГ-буфере. Лолу$6 кнный препарат содержит 85% количества рецептбра, находящегося в исходном цитозоле.

Отсутствие в полученном препарате транскортина и транскортинподобных белков было доказано при помощи экспериментов, которые иллюстрирует чертеж.

Кривая l -дексаметазонсвязывающая (обусловленная б-белком) активность супернатаита); кривая 2 — термостабильная (обусловленная

3 7ь >7) l

Поставленная цель достигзст >ь предлагаемым способом отделсььия рецептора гььн>кокортикоид. ных гормонов печени крыс от трзискортииа и транскортиииодобиых белков. заключающимся в том, что цитозол печени крыс обрабаты5 вают водным раствором соли лантана с последующей обработкой полученного осадка этилендизминтетрауксусной кислотой в три с- НС 2. буфере, Предпочтительно исиользук>т 0,05 Ч рзст10 вор соли лантана, эквимолярное количество этНлендиамиитетрауксусной кислоты и трис-НС8 буфер с рН 75.

К отличительным иризнзкзч способа относятся: использование водных растворов солей лан15 тана и обработка полученного осадка этилендиамиитетрауксусиой кислотой в трнс-HCg 6yфере.

Полученный препарат содержит 851 от ис ходного количества рецептора.

Описываемый способ позволяет получить рецептор более простым способом как. в несвязанном состоянии так и в. комплексе с гормоном с выходами 85 и 98%, соответственно, Пример l, Отделение свободного ре25 цептора глюкокортикоидных гормонов печени крыс от транскортииа и транскортинподобных белков с использованием La(NOq) 3.

Определение стероидсвязывающей активности проводят методом твердафззной адсорбции с использованием в качестве адсорбента угля, покрытого декстраном. С этой целью аликвоты (по 0,25 мл) каждой из анализируемых белковых фракций инкубируют 2 ч с 2,5 10 моль

Н-дексаметазона или Н-кортизола как беэ, так и с 5000-кратным избытком аналогичного нерадиоактивного стероида. Стероиды прибавляют к белковым фракциям в виде осадков, полученных при выпариваний их растворов в органических растворителях. Несвязанный стероид удаляют. прибавлением !/2 объема суспензии покрытого декстраном (3 75 г активированного угля и 0,375 г декстрана-500 в 100 мл ТДГбуфера). Пробы интенсивно перемешивают в течение 5 мин, и сорбент осаждают центрифугированием !О мин при 10000 р . В полученных таким образом препаратах измеряют радиоактив7671

5 l ность, обусловленную связаншымм с белком радиоактивными стероидами. Величину специфического связывания радиоактивного стероида определяют по разности величины связанной радиоактивности препаратов в отсутствие и при наличии 5000-кратного избытка соответствующего нерадиоактивного гормона.

Радиоактивность проб измеряют в сцинтилляторе Брзя при помощи жидкостного сцинтилляционно о счетчика Ultrobeta — 1210 фирмы

"LKB — ЧЧаПас".

Анализ стероилсвязываюьцих белков осадка.

Содержание А-, В-, и G-белков в препаратах, полученных после растворения осадков в 1 мл

ЭДТА и ТДГ-буфере, определяют по методике, описанной в предыдущем разделе.

Как следует из. графика, при увеличении концентрации La(NO3) 3 в цитозоле до

0,0005 М дексаметазоисвязывающая активность его (G-белок) начинает падать и полностью исчезает при концентрации 1а(МОз) з 0005 M и выше (кривая 1) . Термостабильная кортизолсвязывающая активность А- и В-белки при этом не претерпевает изменений (кривая 2).

Как следует из анализа кривой 3, обработка 25 осадка, содержащего б-белок, раствором ЭДТА позволяет перевести его в растворимое состряние с восстановлением 85% исходной активности. А--и В- белков, судя по фоновым значениям термостабильной кортизолсвязываю-шей активности (кривая 4), препарат G-белка не содержит.

Пример 2. Отделение рецептора в комплексе с Н-дексаметазоном от транскорти- . з на и транскортинподобных белков с использованием La(NO@) q.

В 10 мл цитозола печени, полученного как описано в примере 1, вносят 10 моль Ндексаметазона. Полученную смесь инкубируют в течение 2 ч для образования комплексов дексаметазон-рецептор. Несвязанный с белком гормон удаляют прибавляя к. пробе 5 мл суспеизии покрытого декстраном, угля (3,75 г активированного угля и 0,375 r декстрана-500 в, 100 мл ТДГ-буфера). Пробу интейсивно перемешивают в течение 5 мин, и сорбент осаждают центрифугированием в течение 10 мин при

l9 4

10000) . Осадок отбрасывают. Супернатант, содер жащий 6-белок в комплексе с Н-дексаметазоиом, служит исходным материалом для обработки

La(NOs) з.

К 0,9 мл полученного препарата приливают

0,1 мл 005 М водного раствора La(NO3)3.

Образовавшийся осадок белка отделяют от pactвора центрифугированием и растворяют его в

1 мл ТДГ-буфера, содержащего 0005 М ЭТДА, Полученный, препарат содержит 97-98% исходного G-белка в комплексе с дексаметазоном и ие содержит А- и В-белков (по причине неосаждаемости их La(NO>) 3, как продемонстрировано в примере 1).

Формула изобретения

1. Способ отделения рецептора глюкокорти-, коидных гормонов печени крыс от транскортина и транскортинподобных белков путем обработки цитозола печени крыс водным раствором соли с последующим отделением осадка, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода целевого продукта, в качестве водного раствора соли используют водный раствор соли лантана с последующеи обработкой полученного осадка зтилендиаминтетрауксусной кислотой в трис-НС8-буфере.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что используют 005 М водный раствор соли лантана, эквимолярное количество зтилендиаминтетрауксусной кислоты и трис-НСь- буфер с рН 7,5.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. КоЫinsky М., Beato М., Kalini М., Fei—

gelson Ph. Glucocorticoid — binding Proteins of

Rat Liver Cytosol Il. Physical characterisation

and properties of the binding proteivs, L.Biol.

Chem. 1972, 247, 7897.

2. Beato M„Feigelson Ph. Glucocorticoid—

binding proteins of Rat Liver Cytosol. 1.%pa—

ration and identification of the binding proteins, J. В1о!оц.Chem. 1972, 247й 24, 7890.

767119

Составитель В. Волкова

Техред M. Кузьма Корректор О. Билак

Редактор .Т. Никольская

Тираж 495

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Заказ 7128/21

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4