Способ получения конъюгированных антигенов барбитуровая кислота-иммуногенный носитель
ОП ИСА НИЕ
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Сова Советских Социалистических Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 30.03.79 (21) 274809723-04 (51) М.Кл з С 07 D 239 б". с присоединением заявки— рсударстззнный комитет (23) Приоритет— (43) Опубликовано 30.03.82. Бюллетень№12 (45) Дата опубликования описания 30.03.82 СССР по ленам изобретений и открытий (53} УДК 547.864 07 (088.8) (72) Авторы изобретения И. E. Ковалев, О. Ю. Полевая и Н. П. Данилова Научно-исследовательский институт по биологическим испытаниям химических соединений (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГИРОВАННЫХ АНТИГЕНОВ БАРБИТУРОВАЯ КИСЛОТА-ИММУНОГЕННЫИ НОСИТЕЛЬ Изобретение относится к способу получения новых конъюгированных антигенов барбитуровая кислота-иммуногенный носитель, которые могут найти применение в медицине и биологии для получения антител к лекарственным препаратам барбитурового ряда, изучения толерантности и барбитуратам, нейтрализации их биологического действия и определения низких концентраций барбитуратов в биологических жидкостях. Известен способ получения конъюгированных антигенов барбитуровая кислота-иммуногенный носитель реакцией ацилирования моно- и дизамещенными в 5-положении барбитуровыми кислотами имму ногенных носителей, таких как сывороточный альбумин и полиаминокислоты в присутствии карбодиимидов. В реакцию вводят 100 — 1000, предпочтительно 500 — 1000 моль реакционно-способного производного барбитуровой кислоты на 1 моль иммуногенного носителя. Реакцию исходных указанных компонентов проводят при 0 — 50 С и рН 3,0 — 6,5. Полученный конъюгированный антиген отделяют от низкомолекулярной фракции диализом против дистиллированной воды и спектрофотометрически устанавливают количество остатков барбитуровой кислоты, ковалентно связанных с 1 моль носителя. При этом получают конъюгированные актигены, в которых с 1 моль иммуногенного носителя ковалентно связаны пептидной связью 2 — 3 остатка барбитуровой кислоты. Недостатком этого способа получения конъюгированного .антигена барбитуровых кислот является низкая конверсия реакционно-способного производного барбиту10 ровой кислоты (0,1 — 0,3%), что приводит к большому расходу производного барбитуровой кислоты и делает процесс экономически дорогостоящим. Целью изобретения является способ получения конъюгированных антигенов, позволяющий получать новые антигены барбитуровая кислота-иммуногенный носитель и повысить конверсию реакционноспособного производного барбитуровой кислоты. Цель достигается способом получения конъюгированных антигенов барбитуровая кислота-иммуногенный носитель путем взаимодействия 5-алкил-5-хлорформиатоалкилбарбитуровой кислоты с иммуногенным носителем. 5-Алкил-5-оксиалкилбарбитуровую кислоту фосгенируют реакцией с фосгеном в тетрагидрофуране в стандартных условиях. Образующийся свежеприготовлен792869 55 65 ный хлорформиат вводят в реакцию с иммуногенным носителем в малярном соотношении 30 —.100: 1. В качестве иммуногенного носителя используют сывороточные альбумины, предпочтительно бычий сывороточный альбумин. Реакцию проводят в водно-диоксановом растворе при 0 — 10 С и рН 8 — 9 в течение 24 ч, причем рН раствора поддерживают добавлением 10 /о-ного раствора гидроокиси натрия. Полученный конъюгированный антиген отделяют от низкомолекулярных примесей диализом против дистиллированной воды и лиофильно высушивают. Количество остатков барбитуровой кислоты, ковалентно связанных с молекулой белкового носителя, устанавливают спектрофотометрически по разнице содержания свободных аминогрупп в исходном белке и полученном конъюгированном антигене, применяя в качестве реагента на аминогруппы тринитробензолсульфокислоту. В зависимости от малярного соотношения вводимых в реакцию хлорформиата и белка получают конъюгированные антигены, содержащие различные количества остатков барбитуровой кислоты, ковалент,но связанных с молекулой белка. Так, если малярное отношение хлорформиата барбитуровой кислоты к белку составляет 30 — 100; 1, то получают конъюгированные антигены барбитуровая кислота-иммуногенный носитель, содержащие 3 — 17 остатков барбитуровой кислоты, ковалентно связанных с 1 моль белка, соответственно (см. табл. 1). В известном способе получают конъюгированный антиген, содержащий 2 — 3 остатка барбитуровой кислоты, связанные с молекулой носителя при использовании малярного отношения производной барбитуровой кислоты к носителю 500 в 1000: 1. Конверсия реакционно-способного производного барбитуровой кислоты в предлагаемом способе составляет 5 — 16О, в то время как в известном способе 0,1 — 0 Зо/о Пример 1. а) Способ получения 5-(1-метилбутил)-5-(2 - оксипропил) - барбитуровой кислоты. В 20 мл концентрированной серной кислоты растворяют и 2 г (0,09 моль) 5-(1метилбутил)-5 - аллилбарбитуровой кислоты. Раствор выдерживают при комнатной температуре 20 мин, выливают в ледяную воду. Образующийся осадок отделяют, высушивают и перекристаллизовывают из водного этилового спирта. Получают 1,3 r 5-(1-метилбутил) - 5-(2-оксипропил) - барбитуровой кислоты. Выход 60 /,. Т. пл. 205 С. Литературные данные: т. пл. 205— 206,С.! 0 ! Зо 40 б) Способ получения конъюгированного антигена 5- (1-метилбутил) -5-пропилбарбитуровой кислоты с бычьим сывороточным альбумином. К раствору 4 г (0,015 моль) 5- (1-метилбутил) - 5-(2-оксипропил) - барбитуровой кислоты в 60 мл тетрагидрофурана добавляют раствор 3 г (0,030 моль) фосгена в 10 мл тетрагидрофурана и 12 мл пиридина. Реакционную смесь перемешивают в течение суток при комнатной температуре. В ыпавший осадок хлоргидр ата пиридина отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток экстрагируют многократно эфиром. Эфирный раствор промывают водой, сушат над хлористым кальцием, упаривают и получают 4,6 r хлорформиата 5-(1-метилбутил) - 5-(2-оксипропил) - барбитуровой кислоты. Выход 85o . Полученный хлорформиат без дальнейшей очистки вводят в реакцию с бычьим сывороточным альбумином. Для этого 10 г белка (0,000145 моль) растворяют в 150 мл воды, доводят рН раствора до 8 — 9 10 /,-ным раствором гидроокиси натрия. К полученному раствору при 0 — 10 С при перемешивании по каплям добавляют раствор (0,0145 моль) хлорформиата в 100 мл диоксана, поддерживая рН 8 — 9 добавлением 10 " -ного раствора гидроокиси натрия. Реакционную массу перемешивают 4 ч и оставляют на ночь при 0 — 4 С. Полученный конъюгпрованный антиген очищают от низкомолекулярных примесей диализом против дистиллированной воды в течение 7 дней. Раствор лиофильно высушивают. Получают 10 .г конъюгированного антигена. Спектрофометрически устанавливают, чта в нем с 1 моль белка ковалентно связаны 17 моль соответствующей барбитуровой кислоты. Пример 2. По вышеописанной методике из 1,6 г (0,005 моль) 5-(1-метилбутил)-5-(2-оксипропил1 — барбитуровой кислоты и .10 г (0,000145 моль) белка получают конъюгированный антиген 5- (1-метилбутил) -5-пропил — барбитуровой кислоты с бычьим сывороточным альбумином, содержащим 2 — 3 моль барбитуровой кислоты, связанной с 1 моль белка. Пример 3. По вышеописанной методике из 4 г (0,012 моль) 5-(1-метилбутил)5- (2-хлорформиатопропил) - барбитуровой кислоты и 10 .г (0,000145 моль1 белка получают конъюгированный антиген 5- (1-метилбутил) -5-пропилбарбитуровой кислоты с бычьим сывороточным альбумином, содержащий 10 остатков барбитуровой кислоты, ковалентно связанных с 1 моль белка. 792869 б Количество остатков барбитуровой кислоты, связанных с 1 мол. белка Соотношение хлорформиата и белка, моль "Соединение 34: 1 90: 1 1 00: 1 2 — 3 l!0 ! Таблица 2 Содержание барбитуровой кислоты в конъюгате, v.oëü Титры антител у крыс у кроликов 1: 256 — 1: 512 1: 512 †: 1024 1: 512 — 1: 2048 3:1 10: 1 17: 1 1:8 1:8 — 1:16 1: 16 Формула изобретения Редактор П. Горькова Техред И. Пенчко Корректор С. Файн.Заказ 250/168 Изд. № 117 Тираж 448 Подписное НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобрстеиий и открытий 1Г303, Москва, Ж-35, Раушскаи наб., д. 4/5 Тип. Харьк. фил. пред. «Патент» Данные примеров приведены в табл. 1. Таблица 1 При мер 4. Антигекные свойства полученных конъюгатов. Крыс и кроликов иммунизируют внутримышечным введением конъютированно.го антигена барбитуровая кислота-белок, Способ получения конъюгированных антигенов барбитуровая кислота-иммуногенный носитель, отличающийся тем, что 5-алкил-5 - хлорформиатоалкилбарбитуровую кислоту подвергают взаимодействию с иммуногенным носителем при ма. лярном соотношении 5-алкил-5-хлорфорв котором с 1 моль белка ковалентно связаны 3 моль барбитуровой кислоты, в дозе 25 мг/кг 2 раза в неделю в течение 2-х месяцев. Через две недели после послед5 ней иммунизации препаратом у животных берут кровь и выделяют сыворотку крови. Иммунизацию кроликов и крыс конъюгированными антигенами, в которых с молекулой белка-носителя ковалентно связаны 10 10 и 17 моль барбитуровой кислоты, осуществляют аналогично. Антигенность всех полученных соединений, определяют по количеству антител, индуцируемых конъюгатами, реакцией пассивной гемаглютинации на танизированных эритроцитах по известному методу. Полученные значения титров антител приведены в табл. 2. миатбарбитуровая кислота: носитель равном 30 — 100: 1 при рН 8 — 9 и температуре 0 — 10 С. ! Источник информации, принятый во внимание при экспертизе: 1. Патент США № 3766162, кл. 260-112, опубл. 1973.
