Способ получения сорбента длявыделения и очистки сериновыхпротеаз

 

ОП ИСАНИ Е

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союэ Советских

Соцкалистнческмх

Республик

<1 798109 (6l ) Дополнительное к авт. санд-ву (22) Заявлено 20. 11.78 (21) 2686096/23-05 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет

Опубликовано 23 01 81 Бктллетень № 3

Дата опубликования описания 26.01.8 1 (51)М. Кл.

С 08 В 37/08

Государственный комитет по делам изобретений и открытий

{53) УДК 577.15. .072(088.8) B. Г. Бенцикене, И.-Г. И, Песлякас, B. С. Веса и A.— C. А Глемжа (72) Авторы изобретения всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ

И ОЧИСТКИ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕАЗ

Изобретение относится к энзимологии и прецназначено для создания высокоэффективных и крупномасштабных способов получения высокоочищенных трипсино- и химотрипсиноподобных сериновых протеаз различного происхождения.

Для выцеления и очистки сериновых протеаз известен ряц ионообменных и биоспецифических сорбентов. B качестве ионообменных сорбентов чаще всего используют ионообменные целлюлозы (1J.

Однако сорбенты данного типа обладают низкой степенью селективности в отношении очищаемого фермента, вследствие чего они приемлемы, как правило, только в качестве составных стадий общих схем очистки ферментов.

Более эффективным методом выделения и очистки ферментов является биоафинная хроматография с использованием биоспецифических сорбентов. Однако сорбенты, получаемые в основном с использованием агарозных матриц и синтетических или природных ингибиторов сериновых протеаз

2, и используемые цля очисткй ф о)тменов являются малопригодными цля их применения в препаративных масштабных из за дороговизны их получения и низкой стабильности к механическим, химическим и микробиологическим воздействиям.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения сорбента— бензильного агарозного геля, сшитого

2,3-цибромпропанолом, используемого тО для гидрофобной высаливающей хроматографии ряда ферментов, в том числе и трипсино- и химотрипсинопоцобных сери- новых протеаз. Снособ получения сорбента

l5 включает стадии отмывки сефарозного геля 2В водой, его сшивки 2,3-дибромпропанолом в 5 И раст"воре едкого натрия, в присутствии 1% боргидрида натрия прй комнатной температуре в течение 2,5 ч с последующей промывкой геля водой, этанолом, водой, с последующим 0-бензилированием хлористым бензилом в

1-5 и растворе Й аОН в присутствии боргицрида натрия при 80 С в течение

7М1

5 ч. B зависимости or концентрации

Й аОН получают гели с с одержан ие м от

900-2500 мкм бензильных остатков ня

1 r сорбента (2).

Однако существующий способ получения бензильного сефарозного геля для хроматографии сериновых протеаз обладает рядом существенных нецостатков".

1. Исходная матрица, используемая для получения сорбента, является дорогостоящей,, низкостабильной к действию ме-ханических и химических факторов и легко подвергается воздействию микроорганизмов, вследствие чего ограничивается или полностью исключается возможность использования сорбентов, полученных на ее основе для крупномасштабного выделения, и очистки ферментов.

2. Используемый,: в качестве лиганда сорбента бензильный остаток, исходя из данных о субстратной специфичности сериковых протеаз, лишь в некоторой степени обладает сродством к сериновым протеазам химотрипсинового типа, и совсем непригоден в качестве лиганда для сорбентов, прецназначенных для очистки трипсиноподобных сериновых протеаз.

3. Сушествуюший способ получения бензильного производного агарозы не позволяет ввести в матрицу бензильных остатков менее 900 мкм/г сорбента. TBкая высокая плотность бензильных радикалов в сорбенте отрицательно отражается на эффективной;работоспособности данного copdezra в процессе сорбции-десорбции

35 трипсина и химотрипсина — эффект очистки ферментов практически отсутствует,, так как сорбент прочно удерживает достаточно высокое количество посторонних белков. В пользу этого свидетельствуют низкие выходы по активному белку (4055%), которые резко снижаются вплоть до 2-6% при увеличении концентрации вводимых бензильных остатков.

Таким образом, существующий способ 45 бензилирования полисахаридных матриц приводит к получению сорбентов с явно выраженной неспецифической сорбцией ферментов, в roM числе и сериковых протеаз.

Бель изобретения — получение сорбента с повышенной селективностью сорбции, трипсино- и химотрипсиноподобных серийных протеаз.

Поставленная цель достигается тем, 55 что в качестве исходного полисахарида используют хитин, который предварительно обрабатывают 3,0-6,0 К соляной кислотой до прекращения выделения СО, 09

4 промывают водой до нейтрального значения рН, ацетоном, высушивают предпочтительно при 100 105 С и подверо гают К- бензилированию хлористым бензилом при молярном соотношении 2,0-3,0 моля хлористого бензила на 1 моль первичных аминогрупп хитина в среде абсо- лютного диоксана с метанолом при обьемном соотношении последних 6:1, соответственно, в присутствии безводного иодистого натрия 0,5 молей и двууглекислого натрия 1,5-2,0 моля на 1 моль хлористого бензила в течение 15-20 ч при температуре 50-60 С и последуюо щей промывкой сорбента последовательно диоксаном, ацетоном и водой.

Предлагаемые условия бензилирования хитина обеспечивают, протекание реакции йо аминогруппам хитина (60-90 мкм/r) и в значительной степени снижают возможность присоединения бензильных остатков по гидроксильным группам носителя, причем бензилирование хитина происходит в условиях, обеспечивающих сохранение в хитине связи между его полисахаридной и белковой частью, ответственной, в качестве одного из сорбционных центров, за избирательность сорбции сериновых протеаз.

Для синтеза сорбента и его применения для выделения, разделения и очистки сериновых протеаз из различных источников используют лабораторную аппарату1 ру для синтеза сорбентов, хроматографические колонки, ФЭК-60, Сф-16.

Пример 1. Синтез сорбента осушествляют следующим образом.

Хитин (ч. МРГУ 6-09-5113-63) измельчают, просеивают через набор сит,отбирают фракции хитина с размером частиц О,З мм, обрабатывают, при комнатной температуре 6К HCP до прекращения выделения СО, перемешивая мехами ической мешалкой. Смесь фильтруют через стеклянный фильтр, промывают фильтратом, фильтруют (операцию повторяют

5-8 раз), промывают 6К НС, затем большим количеством цистиллированной водой цо -нейтрального значения рН, ацетоном, сушат при 100-105 С.

В сухом хитине определяют содержа ние свободных аминогрупп методом образования шиловых оснований с салициловым альдегидом.

1 г хитина содержит 60 мкм свободных аминогрупп. Все количества остальных реагентов высчитывают на

1 моль &минОгрупп

5 798109 6

На синтез сорбента берут 15 г хити- После отделения трипсина через кона, количество свободных аминогрупп, в лонку пропускают 1 5 М раствор Ng C8 котором составляет 0,0009 моль. в 0,002 М Са (СН СОО)2 до отрицаB трехгорловой круглодонной колбе, тельной реакции на белок (около 100 мл). соединенной с обратным холодильником, > фракции с протеолитической активностью механической мешалкой, термометром со объединяют: 60 мл с концентрацией бел сходящим вниз шлифом и с хлоркальциевой ка 0,76 мг/мл, получают 45,6 мг О, трубкой, в 33 мл метанола (CH OH) ра- -химотрипсина с активностью 0,08 каз.едГ створяют 0,135 г (0,0009 М) безводно- /мг белка. го ЙоЗ, прибавляют 167 мл абсолют- (0 После диализа фракции с трипсином и ного диоксана (общий объем растворите- с ф -хипотрипсином лиофильно высушилей 200 мл), 0,228 г (0,0018 М) вают. бензила хлористого, 0,227 г (0,0027 М) На 1 г медицинского панкреатина понатрия двууглекислого и 15 r сухого хи- . лучают 28,0 мг трипсина, содержащего тина. Смесь перемешивают в течение 15- (S 85-90% белка. Активность препарата

20 ч, нагревая на водяной бане при.,тем- 0,09 каз. ед/мг белка, что соответствует пературе реакционной смеси 50-600С. 67 ед, БАЭЭ/мг белка (К -бензоил-DLПо окончании реакции сорбент на стеклян- -аргинин этиловый эфир . ном фильтре промывают абсолютным диок- И 1 г медицинского панкреатина саном, ацетоном 2-3 раза (для удаления щ кроме трипсина получают 23 мг оЕЯд J ), фильтрат отбрасывают и сорбент -xHMorp@ticaHa, Активность препарата тщательно промывают водой (для удале- 0,08 каз. ед/мг белка. Он гомогеиен по ния Ng Со ). Фильтрат и промывные воды методу электрофореза в полиакриламидном переносят в мерную колбу на 100 мл, геле. объем доводят до метки и в нем опреде- ?s Пример 3. Выделение и очистка ляют содержание ионов С0 титрованием с трипсина и химотрипсина из препарата индикатором Н g (ht0g)2 С I? Параллельно трипсина марки Б (ОЗХР). определяют число введенных бензильных 100 мг трипсина марки Б с активнргрупп по оставшимся свободным амино- . стью 16 ед БАЭЭ растворяют в 25 .лл группам в полученном высушенном сор- 30 0,002 М Са (СНЗСОО)2 рН 7,0, фильбенте (с салициловым альдегидом). труют и вносят в колонку, наполненную

10,63 г М -бензилхитина, (1,7 х 31см)

Пример 2. Выделение и очистку и предварительно уравновешенную

Рипсина и химотРипсина из медицинско- О 002 М Са (СН СОО) . рН 70. Скго панкреатина осуществляют следующим

Са З др 7, рость течения элюента 40 мл/ч. После образом. нанесения раствора трипсина на колонку, Колонку (1,7 х 31 см), наполненную ее промывают тем же раствором

10,63 г К -бензилхитина, УРавновешивают 0,002М Са (СН C00) рН 7,0 до or0,002 М раствором Са (СН Соб)2рН а р, доот3 2 рицательной реакции на белок. После чего

7,0 и вносят 50 мл раствора медицин- 40 через колонку пропускают 0 5 М раствор ского панкреатина в 0,002 М Са НОС(в 0,002 М Са (СН СОО) (СН СОО) рН 7,0 с концентрацией

О в

2 рН 7, О до отрицательной реакции на белка 2,6 мг/мл, с общей протеолитибелок (около 100 мл). Фракции с проческой активностью 0,15 казеиновых едитеолитической активностью собирают и ниц на 1 мг белка (каз. ед/мг). Скорость

4 после диализа лиофильно высушивают. течения элюента 40 мл/ч. После нанесе— Получают 20 мг трипсина с активностью ния раствора медицинского панкреатина, колонку промывают начальным буфером 75 ед. БАЭЭ/мг бе Степень mecrxs (0,OO2 М Ca (CH СОО), рН 7,0) до 4 6 р" отрицательной реакции на белок. После

После отделения трипсина через кочего чеРез колонкУ пРопУскают 0,5 М лонку пропускают 1,5 М раствор Ко И раствор КаСИ в 0,002 М Са (СН СОО) в 0,002 М Са (СН СОО)д:рН 7,0 до рН 7,0 до отрицательной реакции на бе- отрицательной реакции на белок. Так как лок (около 100 мл). Фракция с протео- препарат трипсина марки Б (ОЗХР) содер- литической. активностью собирают, общий жит незначительное количество сК, -химо-, SS обьем 60 мл, концентрация белка трипсина (примерно 6-11%), то для лиос =0,87 мгlмл, получают 52,2 мг трип- фильного высушивания такое количество сина с активностью 0,10 каз.ea/ìã бел- недостаточно (из 100 мг препарата). ка. Поэтому собирают фракции с -химотрипсином после нескольких хроматограмм и тогда большее количество после диалиэа л и офильн о высуш ива ют.

Предлагаемый способ получения сорбента на основе полисахарида (хитииа) путем его Й -бензилирования позволяет вводить в хитин от 60-90 мкм/г бензильных остатков, являющихся вторым селективным сорбционным центром сор-. бента, вследствие чего сорбент обладает 10 высокой специфической одновременной сопбцией строгой селективностью десорбции, с высокими степенью очистки и выходом по активности трипсино- и химотрипсиновых сериновьас протеаэ непосредственно 1 из сырых" экстрактов различных источников ферментов.

Формула. изобретения

1. Способ получения сорбента для выделения и очистки сериновых протеаз, включающий обработку полисахарида хлористым бензилом, î T л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения селективности сорбции, в качестве полисяхарида используют хитин, который:предварительно обрабатывают 3-6 К соляной кислотой до прекращения выделения С0>, промывают водой до нейтрального рН и затем высушивают ацетоном, а обработку хлористым бензилом осуществляют при молярном соотношении хлористого бензила и первичных аминогрупп хитина, равном 2-3: 1, в среде абсолютного диоксана и метанола при объемном соотношении последних 6: 1, соответственно, в присутствии 0,5 молей безводного иодистого натрия и 1,5-2 молей двууглекислого натрия на 1 моль хлористого бенэила в течение 15-20 ч при

50-60 С с последующей промывкой полу0 ченного сорбента последовательно диоксаном, ацетоном, водой.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю— ,и и и с я тем, что хитин высушивают чри 100-105 С.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.5oshiko Narahasbi, kaoru (, ос)а, Alkaline serene prote nases 0 and

Е of Мте Аоеусеь фг seuek-h,J. Biocbern. 1977, v. 81, р. 587-797.

2.Тогфпу Laas, Айаг детivatives аког спгота fograph, е1есЬropbore5is and е(Ьацпд enz.garnes, ХChro("пси10гЯ .1576,y,!Il No2 р ЗТЗ- З87 (прототи н), Составитель Г. Русских

Редактор А. Шишкина Техред С.Мигунова Корректор И. Муска

Заказ 9943/27 Тираж 541 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент",, г,Ужгород, ул. Проектная, 4