Способ получения иммобилизованныхпротеолитических ферментных пре-паратов

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических республик (6l ) Дог1олнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 26.07.78 (21) 2649427 23-04 (51) . 11. Кл.

С 07 G 7102

А 61 К 37/48 с присоединением заявки ¹ ——

Государственный комнте; (23) Приорцтет— (43) Опубликовано 07.03.81. Бюллетень М 9 (45) Дата опубликования описания 07.03.81 (53) У, Lk 577.15.07 (088.8) ло данаи изобретений и открытий (72) Авторы изобретения

И. Ф. Мишунин, И. H. Баширова, В. Б. Вишневский и H. И. Семенюк ь, 1

°, >

> 1

Ордена Трудового Красного Знамени институт биохи1мии им. А. В. Палладина с (71) За я в11тсл ь (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ

ИММОБИЛ ИЗОВА ННЫХ ПРОТЕОЛ ИТИЧ ЕСКИХ

ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Изобретение относится к технологии получения иммобилизованных ферм HTHh! « препаратов и может быть использовано в фермснтпой промышленности.

В настоящее время новым перспективным направлением является получение иммобилизоваí I! I«фср IcHTQB, которые становятся болсс стабильными, водонсрастворимыми прц сг1язываггии с носителями. Иммобилцзацпя способствует улучшен Ilo условий хранения ферментов и их нс1;ользовання в различны«отраслях нарочного хозяйства.

Извсстс способ получения иммобплпзовацных протеолитическнх фсрментных препаратов, включающий связывание фермента (протслина, протосубтплина) с носителем (coHo.!èìåð стирола с малеиновым ангидридом) при соотношении фермент:

: носитель 2 — 1: 1 в апротоцном диполярном растворителе — димстилсульфоксиде, димстилформамидс при перемешивании в тсчсцис 1 ч при комнатной температуре, выдерживание смеси при перемешивании, обработку смеси водным раствором соляной кислоты с введением солей поливалснтиых металлов, хлорного железа, tlðîмывку полученного осадка и высушиванис фсрментного препарата (1).

Этот способ обсспсчиваст получение

2 ферментов, жестко связанны«с носителем, прц этом препарат нригоден только для одноразового гчгдролиза субстра гов, что ограничивает область применения получасмы«фсрментных препаратов.

Основным недостатком способа является сложность те«11ологии иммобилизации, 1то приводит к IloHIIIIIOHHlo стоимости це, 1св1>1« препаратов.

Целью изобретения является упрощение

Ii роцссса.

1!остаг>ленная цель достига>тся тем, что в качестве носителя используют фторамфиболовьш асбест в вид» суспснзии в 10 —

15 10-4 М буферном раствоое, а связывание проводят при соотношении фермент: носитель 1: 2,5 — 5,0 при 4 — 10 С в течение

18 — 20 ч.

Предлагаемый способ получения иммо"0 бил изова ни ых протсолитических фермсн гцых препаратов включает связывание фермента с фтора мфпооловым асбестом, используемым в виде суспензии в 10- - — !

О 4 М буферном растворе, при 4 — 10 С и

25 соотношении фермент: носитель 1: 2,5 — 5,0 в тсченис 18 — 20 ч при перемешивании, промывку полученного препарата и высуцl и ва и lit .

Способ характеризуется более простой

ЗО тс«цологвей, чем извсстный и может быгь

8l0720

Составитель О. Скородумова

Техред А. Камышникова Корректор О. Силуянова

Редактор 3. Бородкина

Подписав!

Тираж 419 Изд, М 235

ВНИИПИ Государственного комитета СССР ио делам изобретений и открытий

f f3035, Москва, >1(-35, Раушская иаб . д. 4/5

Заказ 2151

Загорская типография >/ilplloлиграфиздата Мособ)лисп<)лкома легко осуществим в промышленных услоП11!1 Х.

Про)лывныс воды, полученные в резул!тате промывки препарата буфером, могут быть объединены, yrfàðåíbf в вакууме до исходного содержания фсрмспта и повторно использованы в процессе.

Пример 1. 100 мг порошка фторамфиболового асбеста суспендируют в 25 мл

0,01 М фосфатного буфера с рН 5,5 и при бавля)от 20 мг трипсина марки « ро1а».

Смесь выдер>кивают при 5 С 18 ч при псремешивании, после чего центрифугиру)от прп 2000 об/мин в течение 20 мин.

Осадок промывают трижды тем жс фосфатным буфером. Промывныс воды объединяют, упаривают в вакуумс до исходного содержания трипсина и вносят новую порцию носителя для связывания остатка фермента из промывных вод.

Контроль за содержанием фермента в промывных водах подтвер>кдает, что после третьей промывки в надосадочной жидкости протсолитпческая активность ffo ooHBруживастся, т. с. фермент закреплен на носителе.

Полученный осадок иммобилизоьанного фермента высушивают при комнатной температуре в потоке воздуха. Из оса 1143 отбирают 5 мг высушенного препарата, суспендируют в 1 мл того >ке фосфатного буфсра и определяют протеолитическуlo активность по Кунитпу.

Лля определения белка по Хартри 2 мг препарата суспсндируют в 1 мл фосфатного буфера и анализ проводят по ОО;.Цспринятой методикс.

Анализы подтверждают, что протсолитичсская активность иммобилизованного фермснтного препарата в пересчете на 1 мг белка составляст 63 — 65 о/в от актпвносп и исходного трипсина. Активность по KyHffr4

Iff H3 1 м! белка H)D!00H,1нзОваг111ol о триг1сина составляет 1.0 — -1,2 единим.

Г1римср 2. 100 мг порошка фгорамфиболового асбеста суспендируют в 25 мл

5 0,0001М фосфатного буфера с рН 5,5, Hl)1 бавляют 40 мг ферментного препарата протсназы-l, выпускаемого опытным производством ИОХ АН УССР, прсдстаиляющс1 о собой комплекс протеолитических ферментов. Дальней)иую обработку, проводят, как в примере 1.

Протеолитическая активность иммобилизованного препарата протеназы-1 составляет 20 — 30% от исходной. Активность Но

ГБ Кунитцу на 1 мг белка иммобилизоьанной протеназы составляст 0,4 — 0,5 е IHHHII.

Полученные предлагаемым способом иммобилизованные ферментныс препараты способны многократно гидролизовать казе2ð ин (13 — 16 раз). При этом сохраняется до

60--70% исходной активности.

Формула изобретения

Способ получения иммобилизованных протсолитических ферментных препаратов. включающий связывание фермента с носителем при персмешивании, промывку полученного препарата и его высушиванис., 3г) отличающийся тем, что, с цел)но упро)цения процесса, в качестве носителя используют фторамфиболовый асбест в виде суспснзии в 10 — — 10-4М буферном растворе, а связывание проводят прп соотно3 шенин фермент: носитель 1: 2,5---5,0 при

4 — 10 С в тече н и е 18 — 20 ч.

Источники информации, н1ншятыс во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

;.!о 425936, кл. С 07 G 7/02, 1972 (прототип) .