Способ получения комплексного ферментного препарата ацетокиназы и аденилаткиназы из биомассы е.coli

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСНОГО ФЕРГ-ШНТНОГО ПРЕПАРАТА АЦЕТОКИНА- ЗЫ ИАДЕНИЛАТКИНАЗЫИЗ БИОМАССЫ Е. COLI, о т л и ч а ю щ и и с я тем^ что биомассу Е. coli разрушают путем обработки ее раствором ЛИЗоцю<а в трис-^НС! буфере рН 7,48-7,5, содержащем О,1 - О,15 М KCI, и действием ультразвука с частотой 16-18 кГц, отделяют клеточные остатки центрифугированием, полученный супернатант обрабатывают стрептомицинсульфатом, после чего осаждают из него белки сульфатом аммония в количестве 68-70% от насыщения с последующим растворением осадка ацетокиназы и аденилаткинапы путём разбавления суспензии белков двукратным объемом трис-НС1 буфера рН 7,48-7,5 до концентрации сульфата аммония 30-37% и удалением нерастворившегося осадка.2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стрептомицинсульфат используют в количестве 1-3%.(Я

А1

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (19) (И) 2066 списочник изоьгеткния

К АВТОРСКОМ .Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

М ест

Ю

4Ь

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ.

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 2812892/23-04 (22) 15.08.79 (46) 15.10.89. Бюл. Р 38 (71) Специальное конструкторско-тех..нологическое бюро биологически активных веществ (72) С. А. Феофанов, С. Н. Загребель.ньй, А. И. Закабунин и В. П. Романов (53) 577.15.07(088.8) (56) R. K. Holmes, M. F. Singer, "Purification and Characterization

of Adenylate Kinase as an Apparent

Adenosine Triphosphate — dependent

Inhibitor of Ribonuclease II in E. coli", J ° Biol. Chem., 1973, V. 248, 2014-2021 °

L. Noda, S. А. КцЬу "Izolation of

the Crystalline enzyme from rabbit

skeletal muscle", J.-Biol. Chem., 1957, V. 226, р. 541-549.

А. Rose, .M. Grunberg — Nanago

et al., "Enzymatic phosphorilation

of acetates", J. Biol. Chem., 1954, Ч. 211, 1Ф 2, 737-756 °

С. M. Whitesides, А. Chmurny et

al., "Enzyme Immobilization and Reactor Development", Епзутпе Епе1пеег1пЕ, 1974, V. 2, р. 217-219.

R. L. Baughn, О. Adalsteinsson, G. М. Whitesides, "Large — Scale Enzy.— ше — Catalyzed Synthesis of ATP from

Adenosine and Acetyl Phosphate °

Regeneration of ATAP from АИР", JACS, 1978, 100, Р 1, 304-305.

Изобретение относится к молекулярной биологии и биохимии и может быть (50 4 С 12 N 9/12 //С 07 Н 19/20

1С 12 М 9/12, С 12 R 1:19) 2 (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСНОГО ФЕРМЕНТНОГО IIPEDAPATA АЦЕТОКИНА3bl И АДЕНИЛАТКИНАЗЫ ИЗ БИОМАССЫ Е. C0LI, отличающийся тем,что биомассу Е. coli разрушают путем обработки ее раствором лизоцима в трис НС1 буфере рН 7,48-7,5, содержащем 0 1

0,15 И КС1, и действием ультразвука с частотой 16-18 кГц, отделяют клеточные остатки центрифугироваиием, полученный супернатант обрабатывают стрелтомипинсульфатом, после чего осаждают из него белки сульфатом аммония в количестве 68-70Х .от насыщения с последующим растворением осадка ацетокиназы и аденилаткиназы путем разбавления суспензии белков двукратным обьемом

9 трис-НСl буфера рН 7,48-7,5 до концентрации сульфата аммония 30-37Х и удалением нерастворившегося осадка. С

2. Способ по п. 1, о т л и ч а— ю шийся тем, что стрептомицинсульфат используют в количестве !-3X. использовано в биохимической промывленности для получения ферментов аце-.

837066 токиназы и аденилаткиназы, из биомассы Е. coli широко используемых для синтеза аденозинтрифосфата (АТФ).

Известны способы выделения и очист-5 ки ацетокиназы и аденилаткиназы в от-. дельности.

В частности, известен способ получения аденилаткиназы из биомассы

Е. со1х, состоящий из следующих ста- 10 дий:

1) разрушение клеток биомассы в ro— могенизаторе под вакуумом;

2) удаление клеточных остатков центрифугированием, получение супернатан-15 та — так называемого "грубого экстракта" °

3) фракционирование сульфатам аммония (60-68 );

4) гель-хроматография на сефадексе 20

С-100fee

5) первая хроматография на ДЭАЭцеллюлозе.; .

6) вторая хроматография на ДЭАЭцеллюлоз е; 25

7) хроматография на гидроксилапатите;

8) изоэлектрофокусирование.

Полученный по такой схеме фермент— адеиилаткиназа - имеет удельную актив-30 ность 620 Е/мг (здесь и далее для всех ферментов приводятся единицы акмкмоль субстрата тивности Е— мг- белка х мин

Недостатками способа получения аде-35 нилаткиназы является его многостадийность и сложность очистки, а также крайняя нестабильность получаемого фермента, что делает невозможным ега использование для синтеза АТФ.

Дпя прикладных целей (например, . для ферментативного синтеза АТФ изАМФ) обычно используют аденилаткиназу из мышц кролика (миокиназу) ввиду ее 45 большой стабильности.

Известен. способ получения аденилаткиназы из мышц кролика, включающий следующие стадии: 50

1) получение грубого экстракта из гомогената мышц экстракцией раствором

NaC1;

2) рН-фракциоиирование;

3) Фракционирование ацетатом цинка;55

4) экстракция цитратом аммония;

5) первое фракциониронаиие сульфатом аммония в количестве 0,58 от степени насыщения;

6) второе фракционирование сульфатом аммония в количестве 0,88 от степени насыщения;

7) диалиэ сорбция и десорбция на смоле IRC-50 (ХЕ64);

8) третье фракционирование сульфатом аммония.

Полученный таким образом фермент имеет удельную активность 1500 Е/мг.

Недостатками данного способа получения аденилаткиназы являются многостадийность, сложность выделения фермента и использование в качестве источника фермента пищевого продукта (мышц кролика).

Известен также способ получения ацетокиназы из биомассы Е. coli, состоящий из следующих стадий:

1) получение грубого экстракта из биомассы;

2) первое фракцйонирование ацетоном в количестве 40-557.;

3) первое фракциоиирование сульфатом аммония (0,5-0,6 насыщ.);

4) второе фракцианирование ацетоном в количестве 50-55Х;

5) второе фракционирование сульфатом аммония (0,5-0,6 насыщ.);

6) третье фракционирование сульфатом аммония (0,49-0,53 насыщ.).

Полученный таким образом фермент— ацетокиназа — имеет удельную активность 220 Е/мг.

Недостатками способа являются многостадийность и использование метода фракционирования белков ацетоном, который является весьма сложным в исполнении, так как строго зависит от температуры. Кроме того, использование легковоспламеняющихся жидкостей, особенно при увеличении масштабов технологии,значительно ее усложняет.

Полученные вышеуказанными способами высокаочищенные ферменты-аденилаткииазу f2) и ацетокиназу j 3 j иммобилизуют Hà BrCN-сефарозе и используют для получения АТФ ферментативным фосфорилированием аденозинмонофасфата или аденозиндифосфата путем пропускания через реактор с иммобилизованными ферментами реакдионной смеси, содержащей АИФ или АДФ, ацетилфосфат, ионы

Ng+ и буфер трис-НС1 (4, 5). Произво.дительность реактора составляет 24 г

АТФ в сутки, чистота АТФ 96-977..

Однако данный способ нельзя признать достаточно экономичным и технологически удобным, поскольку он основан

5. 83706 на использовании ферментов высокой степени очистки (что, как показано авторами изобретения, совсем не обязательно) и выделяемых из разных источ-.

5 ников трудоемкими и многостадийными способами, причем один из источников ферментов является пищевым продуктом.

Основной недостаток всех известных способов получения ацетокинаэы и аде- 10 нилаткиназы заключается в использований биомассы только для выделения одного фермента, результатом чего является неоправданно большое количество отходов. 15

Кроме того, все известные способы являются многостадийными и в. силу этого трудоемкими и дорогостоящими. Для прикладных цепей — для синтеза АТФ иэ

АИФ, целесообразно использовать не 20 высокоочищенные ферменты, а лишь ча. стично очищенные препараты ферментов, в силу простоты и низкой стоимости их получения. Поскольку и ацетокиназа и аденилаткйназа присутствуют в значй- 25 тепьных количествах в Е. coli, причем оба эти фермента .широко используются для прикладных целей (например, сйнтез АТФ из АИФ), нет необходимости н очистке каждого из ферментов в от- 30 дельности, выгоднее сразу получать препарат, содержащий оба фермента.

Изобретение экспериментально показывает воэможность использования частично очищенных ацетокиназы и аденилаткиназы, выделенных из одного источника-биомассы Е. coli для синтеза

АТФ. Целью изобретения является разработка нового способа получения ком- 40 плексного ферментного препарата-ацетокиназы и аденилаткиназы из биомассы

E. coli.

Цель достигается новым, не описанным ранее в литературе способом полу- 4» чения комплексного ферментного препарата ацетокинаэы и аденилаткиназы иэ биомассы Е. coli, заключающимся. в .том, что биомассу Е. coli,ðàçðóøàþò путем обработки ее раствором лнзоцима 50 в трис-НС1 буфере рН 7,48-7,5 содержащем 0,1-0,15 И КС1 и действием ультразвука с частотой 16-18 кгц, отделяют клеточные остатки центрифугиройанием, полученный супернатант обрабатывают стрептомицинсульфатом, после чего осаждают из него белки сульфатом аммония в количестве 68-70Х от насыщения с последующим растворением

6 -6 осадка ацетокинаэы и аденилаткинаэы путем разбавления суспензии белков двукратным объемом трис-HCl буфера рН 7,48-7,5 до концентрации сульфата аммония 30-37 и удалением нерастворивиегося осадка.

Обычно стрептомицинсульфат используют в количестве 1-3Х.

Существенными отличиями способа являются разрушение биомассы Е. col i раствором лизоцима в трис-НС1 буфере рН 7,48-7,5, содержащем 0,1-0,15 М

КС1, и действием ультразвука с ча— сточ,ой 16-18 кгц,. отделение клеточных остатков центрифугированием, обработ-: ка полученного супернатанта стрептомицинсульфатом, осаждение белков сульфатом аммония в количестве 68-703 от насыщения, растворение осадка ацетокиназы и аденилаткинаэы путем разбавления суспензии белков двухкратным объемом трис-НС1 буфера рН 7,48-7,5 до концентрации сульфата аммония 3037 . и удаление нерастворившегося осадка.

Таким образом, ацетокиназу и аденилаткинаэу получают комплексно на основе совместной грубой очистки иэ одного источника, а именно, из биомассы Е. coli. Это позволяет избежать трудоемких стадий очистки аденилатки казы и ацетокинаэы в отдельности и удешевить процесс за счет исключения дорогого и дефицитного сырья - иыпц кролика и сокращения расходов иа реагенты и .оборудование.

Описываемый способ получения ферментного препарата, содержащего аденилаткиназу и ацетокиназу, заключается в следующем: биомассу Е. coli MRE600 разрушают сначала лизоцимом, а затем ультразвуком в трис-HCl буфере, содержащем 0,1-0,15.М КС1 (для полноты экстракции белков) и получают грубый экстракт. Такой способ разрушения биомассы позволяет выделить на стадии грубого экстракта в 10 раз большее количество единиц активности ацетокиназы и аденилаткиназы по сравнению с разрушением биомассы только лизоцимом или только ультразвуком. Грубый экстракт обрабатывают 3%-ным раствором стрептомицинсулЬфата дпя удаления нуклеиновых кислот. Затем проводят фракцнонирование сульфатом аммония в следующем порядке: сначала осаждают белки при концентрации сульфата аммония 68-70Х насыщения, а затем растворяют. осажденные

837066 белки доведением концентрации сульфата аммония до 30-37% насыщения. Такая, последовательность фракционирования сульфатом аммония позволяет получить в 2-3 раза большее количество единиц активности ацетокиназы и аденилаткиназы, чем при фракционировании сульфатом аммония в обычно принятой последовательности: сначала осаждение более 10 низкой концентрацией, а затем — более высокой. Полученную фракцию белков используют как ферментный препарат. Ферментный препарат, полученный описываемым способом, содержит ацетокиназу с удельной активностью 20-25 Е/мг и аденилаткиназу с удельной активностью

30-40 Е/мг. Полученный ферментный препарат может быть успешно использован для синтеза АТФ из АМФ и ацетилфосфа- 20 та. Для этого ферментный препарат, предварительно обессолив на колонке с

Сефадексом G-25 и одновременно произведя смену буфера, иммобилизуют известным способом.(5 J íà BrCN-Сефарозе 25

4В. Через реактор проточного типа с иммобилизованным ферментным препаратом пропускают реакционную смесь, содержащую АМФ, ацетилфосфат, Ng и в

+2

Ф качестве затравки незначительное ко- 30 личество АТФ. Выход АТФ после реакции составляет 97-98% от запускаемого количества АМФ.

Пример 1. Приготовление ферментного препарата.

100 г замороженной при — 40 С биомассы Е. coli MRE-600 измельчают в ступке, заливают 300 мп 0,1 М КС1 в 0,01 М трис-НС1 рН 7,5 с 2 мМ Рмеркаптоэтанола, перемешивают при

+4 С до однородной суспензии, приливают раствор лизоцима в буфере (из расчета 1 мг лизоцима на 1 г биомассы) и перемешивают 10 мин. Затем сус" пензию озвучивают в ледяной бане на 45 ультразвуковом дезинтеграторе (18 кгц) сеансами по 1 мин с перерывами в

1 мин. Общее. время озвучивания 20 мин.

Суспензию центрифугируют в течение

40 мин при 10000 o6/ìèí. Супернатант используют как грубый экстракт, осадок отбрасывают.

Обработка экстракта стрептомицинсульфатом.

К 375 мг грубого экстракта приливают по каплям при тщательном перемешивании 43 мл 30%-ного раствора стрептомицинсульфата в 0,01 M трис-НС1, рН 7,5, содержащем 2 мМЯ -меркаптоэтанола, до конечной концентрации стрептомицинсульфата 3%. После этого смесь перемешивают 20 мин. Затеи центрифугируют (14000 об/мин, 40 мнн).

Осадок отбрасывают. Супернатант подвергают дальнейшей обработке (фракция

СС) .

Фракционирование сульфатом аммония.

К 380 мл фракции СС при тщательном перемешивании на холоду присыпают небольшими порциями тонко растертые кристаллы сухого сульфата аммония (179,36 г) до конечной концентрации

70% насыщения по (NH ) ЯО . Затем раствор тщательно перемешивают 30 мин и центрифугируют (10000 об/мин, 30 мич). Супернатант отбрасывают. Оса" док суспендируют в минимальном объеме

0,7 насыщенного раствора сульфата аммония в 0,01 м трис-НС1 рН 7,5 + 2 м М

P-ìåðêàTròîýòaíîë. Суспензию разбавляют в 2 раза с буфером и тщательно перемешивают 20 мин, затем центрифугируют (14000.об/мин, 30 мин). Осадок отбрасывают, а супернатант подтитровывают с 0,5 н КОН до рН 7,5. Полученный препарат (100 мл) разливают по 10 мл в герметичные полиэтиленовые флаконы и замораживают при -40 С (фракция."0,70,37СА"). В таком виде препарат хранится 6 месяцев без потери активности.

Пример 2. Использование комплексного. ферментного препарата, содержащего аценилаткиназу и ацетокиназу для синтеза АТФ.

10 мп фракции "0,7-0,37А" размораживают на льду и нанЬсят на колонку с сефадексом G-25 (2,6 см х 40), предварительно уравновешенную О,1 М К-фосфатным буфером рН 7,8, содержащим

0,5 н. КС1 и 2 мМ / ;-меркаптоэтанол.

После нанесения образца в колонку подают этот же раствор со скоростью

250 мл/ч. Оптическую платность выходящего из колонки раствора регистрируют с помощью проточного денситометра при длине волны 280 нм. Фракцию, содержащую белок, собирают отдельно и немедленно подвергают иммобилизации на ВгСФсефарозе.

Иммобилизация ферментного препарата на BrCN-сефарозе 4В.

2 r сухой BrCN-сефарозы 4В (фирмы

"Pharmacia", Швеция) промывают на стеклянном пористом фильтре 200 мл

0,001 н, НС1, затем 200 мл 0,1 М К-фосфата рН 7,8, содержащего О, 5 Н КС1

837066

Редактор О. Юркова Техред Л.Олийнык Корректор И. Иуска

Заказ 6В64

Тираж 501

Подписно е

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 и 2 м М Р-меркаптоэтанол. Отмытую

BrCN-сефарозу переносят в чистый флаI кон вместимостью 15-20 мл. Туда. же приливают 7 мл обессоленного ферментного препарата, содержащего 30 мг

5 белка. Смесь легко встряхивают 16 час о на холоду (+5 С) . После иммобилизации содержимое флакона количественно переносят на стеклянный фильтр и промы- вают на колбе Бунзена. 100 мл IМ КС1 в .

0,001 M трис-НС1 рН 7.5 для снятия ковалентно несвязанных белков.

Затем иммобилизованный ферментный препарат (ИФП) встряхивают в течение

30 мин с 30 мл IM трис-.НС1 рН 7,5 для экранирования непрореагйрованных .групп сорбента.

После этого ИФП отмывают на стеклянном пористом фильтре 100 мл 0,01 М >О трис-НС1 рН 7,5, содержащего 2 мИ меркаптоэтанол, слегка отжимают, переносят в герметичный флакон с широким горлом и заливают 200 мл 0,01 И трис-, НС1 рН 7,5, содержащего 2 мМ АТФ, 2мМ 25

MgC1< и 2 мМ / -меркаптоэтанол. В таком виде ИФП хранят при +4 С. о

Синтез АТФ..

Синтез АТФ проводят в термостатиру-емом реакторе проточного типа с иммо.— 3p бнлизованным ферментным препаратом (30 мг белка на 2 г BrCN-сефарозы 4В), содержащим 120- ед. ацетокиназы и100 ед. акт аденилаткиназы. Реакционную смесь следующего состава: 20 мИ АМФ, .2 мМ АТФ, 80 мМ ацетилфосфат, 20 мИ

МяС1, 2 мМР-меркаптоэтанол, 50 мИ трис-НС1 рН 7,5, пропускают через колонку с ИФП, термостатируемую при 37 С, со скоростью 20 мл/ч. При этом глуби а синтеза АТФ составляет ые ниже 97,5Х

Производительность такого реактора составляет 5 г АТФ в сутки (0 21 г

АТФ/ч) при его объеме 2 мл.

Производительность реактора с частично очищенным ферментным препаратом, содержащим ацетокиназу и аденилаткиназу. и производительность ре- . актора с высокоочищенными ферментами (4) (5 ) одинакова в пересчете на количество единиц активности фермента, связанного с матрицей. преимуществами описываемого способа являются использование одного источника вместо двух источников фер.— ментов — биомассы Е. coli - т.е. упрощение способа; проведение вместо многостадийной (14 стадий) и тонкой очистки каждого из ферментов четырех. стадийного выделения и грубой очистки ферментов; исключение использоваt ния пищевого сырья — мьппц кролика; уменьшение расхода реагентов на очист- ку ферментов, не требуется сложное аппаратурное оформление.

При иснользовании в широких масштабах синтеза АТФ на иммобилизованных ферментах, что является наиболее перспективным для получения АТФ, самой трудоемкой и дорогостоящей стадией является выделение ферментов. Поэтому использование вместо высокоочищенных ферментов из разных источников, грубоочищенного ферментного препарата из одного источника является экономически более перспективным.