Способ определения времени клеточногоцикла b ткани животных

 

<п>838508

Свюз Советских

Свциалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 14.04.78 (22) 2605335/28--13 (53)N, Кл.

G 0l N 1/30 с присоединением заявки М

Фвударетаенный квинтет

СССР ю ааяам кзебретений и еткрытий (23) Приоритет—

Опубликовано 15.06.81. Бюллетень рй 22

Дата опубликования описания 15.06.81 (53) УЙК 611-018.1 (088.8) (72) Авторы изобретения

Н. Н. Пятницкий, В. М. Жминченко, Н. П. Сугон и Ю. Г. Тиняков

Институт питания Академии Медицинских наук ССС и Институт общей генетики АН СССР (7I) Заявители (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВРЕМЕНИ КЛЕТОЧНОГО

ЦИКЛА В ТКАНИ ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к цитологии и может быть использовано в биологии и медицине при выявлении патологических состояний тканевых структур.

Известен способ определения времени клеточного цикла в ткани животных, включающий введение радиоактивной метки с последующим изготовлением гисторадиоавтографов и подсчеТоМ меченых митозов (1).

Однако способ не позволяет выявлять самостоятельные группы клеток ткани с различной продолжительностью клеточного цикла в пределах от 1 сут, до нескольких месяцев.

Цель изобретения — повышение точности способа для ткани печени за счет выявления групп клеток с разной продолжительностью IS клеточных циклов.

Эта цель достигается тем, что гисторадиоавтографы изготавливают иэ срезов ориентированных вдоль балок клеток печени и подсчитывают меченые клетки в одной и той же позиции клеточного комплекса, прошедшем пер- . вое и второе деление на стадии интерфазы до насыщения от 30 до 80%, а время клеточного цикла определяют по разности времени достижения 30 — 80% насыщения вторым делением и времени достижения 30 — 80% насыщения первым делением от момента введения радие активной метки.

Пример 1. 21 крысе-самцу весом

130-140 г вводят внутрибрюшинно радиоактивную метку; Н-тимидин в дозе 0,5 мкКи на 1 r веса животного. После введения

3Н-тимидина через интервалы времени 12 ч, а затем через 1, 2, 4, 8, 12 и ?6 сут. под эфирным наркозом у трех животных (на каждый срок исследования) берут печень.

Ткань печени фиксируют в 10%-ном растворе нейтрального формалина, проводят через батарею спиртов, заливают в парафин и приготовляют на микротоме срезы толщжой 5 мкм.

При изготовлении срезов блок ткани ориентируют таким образом, что плоскость резания проходит вдоль балок печени, т.е. вдоль линейных структур клеточных комплексов ткани.

Затем приготовляют гисторадиоавтографы, для этого срезы заливают фотоэмульсией (типа МР) и оставляют в темноте в холодильнике на

8508

35

55

3 83

7 дней. После экспонирования фотоэмульсию проявляют в метол-гидрохиноновом проявителе, и закрепляют в фиксаже, затем срезы подкрашивают гемотоксилином Майера. Позиции или места клеток и печеночных балках нумеруют в направлении от триады к центральной вене.

Цитологические показатели регистрируют на

3, 6 и 7-ой позициях линещ ых структур клеточных комплексов изучаемого органа. При нимая во внимание сдвиг клеток после их деления вдоль балок печени от триады к центральной вене и принимая во внимание, что после прохождения митотического деления дочерние клетки остаются друг около друга, представляется возможность регистрировать факт деления клеток по наличию дочерних меченых клеток, расположенных рядом в балках печени.

Отдельно подсчитывают количество меченых клеток, прошедших первое деление. Первое деление выявляют и регистрируют по наличию на 5-ой позиции балок печени фигур меченых митозов или по наличию двух смежно-расположенных дочерних меченых клеток иа 5 и 6-ой позициях балок печени.

Отдельно подсчитывают количество меченых клеток, прошедших второе деление. Второе деление выявляют и регистрируют по наличию на 5-ой позиции балок печени меченой клетки и меченого митоза на 6-ой позиции клетки или по наличию трех меченых клеток, расположенных друг около друга на 5, 6 и 7 позициях балок печени.

Отдельно подсчитывают общее количество меченых клеток на 5 Ы 6-ой позициях балок печени.

Подсчет количества клеток (гепатоцитов), прошедших первое или второе последовательное деление, проводят до заданного насьпцения (отдельно для первого и второго деления), т.е. учитывают количество клеток до определенного уровня, выраженного в виде процента разделившихся меченых клеток ко всем меченым клеткам в данной позиции клеточного комплекса (балки печени). Регистрацию цитологических данных для радиоавтографического анализа клеточных циклов в ткани печени проводят до 50 o-ного насыщения. При этом подсчет можно проводить от 30 до 100 ного насыщения, но подсчеты до 30% менее точны, а подсчеты до 100 o- более трудоемки.

50%-ное насыщение клетками, прошедшими первое деление (средняя величина равна

50,6 K 1,4%) на 5 и 6 ой позициях балок печени, обнаружено на вторые сутки после введения Н-тимидина. Это означает; что за двое суток после введения Н-тимидина половина всех пометившихся клеток на 5-ой позиции балок печени прошла через деление. Период

45 от момента введения Н-тимидина до момен та 50%-ного насьпцения клетками, прошедшими первое деление в 5-ой позиции балок печени, равен двум суткам и охватывает отрезок времени, равный половине среднего времени синтеза ДНК, времени постсинтетического периода (включая время периода покоя), времени митоза и интервалу времени от митоза до момента наблюдения при 50 o-ном насыщении.

50 o-ное насыщение клетками, прошедшими второе последовательное деление (средняя величина 51,5 g 1,1%) на 6 и 7-ой позициях балок печени, обнаружено на 12 сут. Это означает, что половина меченых клеток прошла второе последовательное деление. Период времени от момента введения Н-тимидина до момента 50 o-ного насыщения клетками, прошедшими второе деление, составляет 12 сут и охватывает промежуток времени, равный половине среднего времени синтеза ДНК, времени постсинтетического периода (включая время периода покоя), времени первого митоза, времени всего второго клеточного цикла и в том числе времени второго митоза, а также времени от второго митоза до момента наблюдения 50 o-ного насыщения второго деления.

Продолжительность первого и второго митотического деления равна между собой, поэтому можно считать, что продолжительность периода от первого деления до момента наблюдения и от второго деления до момента наблюдения также равны между собой. В таком случае можно вычислить продолжительность клеточного цикла. Для этого вычитают из периода времени, прошедшего с момента введения Н-тимидина до 50%-ного насыще 3 ния клетками, прошедшими второе деление (12 сут.), период времени, прошедший с момента введения 9 Н-тимидина до 50%-ного насыщения клетками, прошедшими первое деление (2 сут), В итоге из двенадцати суток вычитают двое суток и получают остаток

10 сут.,что и соответствует продолжительности клеточного цикла клеток балок печени на 5 и б-ой позициях при 50%-ном насыщении.

Пример 2. Способ получения цитологических данных для определения продолжительности постсинтетического периода клеточного цикла гепатоцитов крыс при выявлении токсического действия метанола на организм животного.

Способ осуществляют следующим образом.

Опытную и контрольную группы животных (по 12 крыс-самцов с исходным весом в

250 — 260 r в возрасте 2,5 мес) содержат на виварном рационе, каждому опытному

38508 6

45

5 8 животному один раз в сутки в течение одного месяца вводят через зонд в желудок 25 мг метанола, растворенного в 1 мл воды. Испытуемая доза метанола 100 мг на кг веса животного в сутки. На 30.й день опытным и контрольным животным вводят внутрибрюшинно Н-тимидин в дозе 05 мкКи на

1 r веса животного. После введения Н-тимидина через интервалы времени 12 ч, а затем через 1, 2, 3 сут. забивают эфирным наркозом по три животных в опытной и в контрольной группах на каждый срок исследования. Ткань печени извлекают из брюшной полости, вырезают кусочек печени и фиксируют его в 10 o-ном растворе нейтрального формалина, проводят кусочки через батарею спиртов в восходящей концентрации, затем заливают их в парафин и приготовляют

1 гистологические парафиновые срезы печени толщиной в 5 мкм. При изготовлении срезов блок ткани ориентируют таким образом; что плоскость реэанья проходит вдоль балок печени, т.е. вдоль линейных структур клеточных комплексов ткани. Из срезов печени . приготовляют гисторадиоавтографы, для этого срезы на предметных стеклах заливают фотоэмульсией (типа MP) и оставляют в темноте, в холодильнике на 7 дней. После экспонирования фотоэмульсию проявляют в метол-пщрохиноновом проявителе и закрепляют в фиксаже, а срезы подкрашивают гематоксилином

Майера.

В опытной и контрольной группах животных цитологические показатели регистрируют на 5 и 6-ой клеточных позициях печеночных балок в направлении от триады к центральной вене. На каждом гисторадиоавтографе, принадлежащему к определенному сроку исследования после введения радиоактивной. метки, регистрируют и подсчитывают факты прохождения первого деления меченой клетки (гепатоцита) по наличию одного из двух признаков: 1) по наличию двух смежно расположенных меченных клеток на 5 и 6-ой клеточных позициях печеночных балок;

2) по наличию фигур меченых митозов на 5-бй клеточной позиции. Отдельно на 5-ой клеточной позиции печеночных балок регистрируют общее количество меченых гепатоцитов, встречающихся в гисторадиоавтографе.

После окончания подсчета общего количества.меченых клеток и количества меченых гепатоцитов, прошедших первое деление 5-ой клеточной позиции, определяют процент поделившихся меченых клеток от всех пометившихся клеток в данной клеточной позиции. Суммируют полученные значения последнего признака по группе животных, относящихся к определенному сроку после введения радиоактивной метки, и находят среднюю величину процента поделившихся меченых клеток для данного срока исследования.

Продолжительность постсинтетического периода клеточного цикла гепатоцитов определяют по времени от момента введения радиоактивной метки до момента времени достижения

50% насыщения поделившимся мечеными клетками. Время 50 ного насыщения поделившимися мечеными клетками для опытной и контрольной групп животных устанавливают графическим способом, для.этого строят график зависимости увеличения числа поделившихся меченых клеток (в процентах) от времени, прошедшего после введения Н-тимидина. э

По оси абсцисс откладывают значения времени, прошедшего после введения радиоактивной метки, по оси ординат — соответствующие значения процента поделившихся меченых клеток для каждого срока исследования. По полученным координатам строят точки и соединяют их плавной кривой, после чего на горизонтальной оси находят время, соответствующее

50 o-ному насыщению поделившимися мечеными клетками. В примере время 50 »ного насыщения устанавливают графическим способом, которое равно 42 ч в опытной группе животных и 64 ч в контрольной. Это означает, что продолжительность постсинтетического периода для 50% гепатоцитов иа 5-ой клеточной-позиции печеночной балки соответственно равна в опыте 42 ч и в контроле 64 ч.

График зависимости увеличения числа поделившихся меченых гепатоцитов на 5-ой клеточной позиции печеночной балки от времени, прошедшего после введения радиоактивной метки животным, соответственно у крыс, получавших метанол (кривая — 1), и в контроле (кривая — 2), приведен на чертеже.

Результаты исследования указывают на то, что под действием метанола укорачивается продолжительность ностсинтетического периода клеточного цикла гепатоцитов в исследуемой клеточной нозиции печеночной балки в 1,5 раза по сравнению 1с величиной данного показателя в контроле. Предлагаемый способ обеспечивает высокую точность, так как позволяет выявить группы клеток с разной продолжительностью клеточных циклов.

Формула изобретения

Способ определения времени клеточного цикла в ткани животных, включающий введение радиоактивной метки с последующим изготовлением гисторадиоавтографов и подсчетом меченых митозов, отличающийсятем, что, с целью повышения точности способа для ткани печени за счет выявления групп

7 838508 8 ллеток с разной продолжительностью клеточных ни достижения 30 — 80 насыщения вторым делециклов, гисторадиоавтографы изготавливают иэ нием и времени достижения 30 — 80% насыщения срезов ориентированных вдоль балок клеток первым делением от момента введения радиоакпечени и подсчитывают меченые клетки в одной 9 тивной метки. и той же позиции клеточного комплекса, про- Источники информации

5 шедшие первое и второе деление на стадии принятые во внимание при экспертизе интерфазы до насыщения от 30 до 80%, а время 1. Exper. Cell Яеаи 1959, 17, У 3, с. 420клеточного цикла определяют цо разности време- 438.

ugж, ерошеашее какое Зйедеиик ро0ирактириой юелке

Составитель С. Малютина

Техред, А. Бабинец

Корректор М. Коста гедактор. JL Конецкая

Заказ 4415/64 1 ираж 907

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

7 9

Я ф 4Р

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4