Способ получения сорбента для очистки дрожжевой гексокиназы

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ ЕТВЛЬСТВУ

Союз Сее4тскик

СОцмйюектнч4сйнв

Р4ФВу4ИЮМ

<и1 857145 (61) Дополнительное к авт. свмд-ву (22) Заявлено 01,1079 (21) 2850072/23-04

С51)м. кл.

С 08 В 37/00

С 12 и 9/00

С 12 И 9/12 с присоединением заявки Ио

Государственный комитет

СССР по лезам изобретений . и открытий (23) Приоритет—

Опубликовано 23.0881, Бюллетень Но 31 (53) УДК543 ° 865.

° 07 (088.8) Дата опубликования описания 23.0881 (72) Авторы изобретения В. С. Травкина, О. Ф. Суджювене, И. -Г. И.

В. С. Веса и A. Ñ. A. Глемжа (71) Заявитель

Всесоюзный научно-исследовательский инсти энзимологии (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ОЧИСТКИ.

ДРОЖЖЕВОЙ ГЕКСОКИНАЗЫ

Изобретение относится к энзимологии и. предназначается для создания легкодоступного способа получечия сорбента для очистки дрожжевой гексоккназы, используемой в качестве важного аналитического реактива для определения содержания аденоэинтрифссфата, глюкозы и других гексоз в биологичес-, ких жидкостях в медицинской и научной практике.

Для выделения и очистки дрожжевой гексокиназы известен ряд ионообмеиных сорбентов, среди которых наиболее часто используются ионообменные целлюлозы (КИ, ДЭАЭ, ТЭАЭ и др.), ко- 15 торые получают после ее соответствующей химической модификации. (1) .

Однако сорбенты данного типа обладают рядом существенных недостатковг низкой степенью селективности по от- 20 ношению к определенному классу ферментов, низкой степенью очистки фермента, вследствие чего они приемлемы, как правило, только в качестве сос-. тавных стадий общих схем очистки фер- 25 мента.

Более эффективным методом выделения и очистки ферментов. является аффинная хроматография с использованием биоспецнфических сорбентов. Извест-39 ны единичные случаи применения биоспецифических сорбентов для выделения и очистки дрожжевой гексокиназы (2) и (3) .

Однако сорбенты данного типа также обеспечивают лишь частичную очистку фермента и носят чисто научный характер. Возможности практического применения сорбентов данного типа ограничены или полностью исключаются иэ-за дороговизны продуктов, испольэуеьвах ддя синтеза сорбентов, сложности синтеза и низкой рабочей стабильности получаемых сорбентов.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ получения сорбента для очистки дрожжевой гексокинаэы, который заключается в присоединении лиганда-.(3-аминопиридин)-адениндинуклеотида к полисахаридной матрице, в качестве которой используют 6-аминокапроилсефа« розу, причем указанное взаимодействие проводят s присутствии водорастворимого гидрохлорида 1-эткп -3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида при рН

4,75 в течение 24 ч (4 .

Однако известный способ получения сорбента для хроматографической очист-

Преимуществом предлагаемого способа является то,. Что исключается ,несбхсдимость использования сложных химических превра1цений, дорогостоящих и труднодоступных Веществ, упро щается В целом методика получения

5 сорбента. При этом, добавлением ионов хрома (ttt) к легкодоступной фосФатцеллюлозе а матрицу Вводится необходимое количество иона металла, являющегося эффективным сорбцкон21ым (О центром связывания данного фер2лента, что приводит к повышению селективной сорбционной способности сорбента.

Дт(я получения сорбента и его при)лененкя для Очистки дрожжевой ГексО—

1» ккназы используют следующую осноанув аппаратуру: лабораторная аппаратура для получения сорбента, хроматограФические колонки, спектрофотометр

СФ-16. зо Иате риалы: фосфат целлюлоз а (прои зВодства Олайнского завода химреактиВоа) с аналитической емкостью 0,71, 1 Mx -BI B/x, t: r.-„(501; }3 6Н!> О, янтарная кислота, уксусная кислота, натрий уксуснокислый, дрожжевая гексокиназа.

Пример 1. Получение сорбента .

В круглодониую кОЛбу, снабженную механической мешалкой, ВВОДит 5,0 Г сульфата хрома (t ! ) С r< (50< ) 6Н О, Зб 800 мл 0,1 И ацетатного буферного раствора рН 5, 6 и 10, О г фосфатцеллвлозы (03XP), Содержимое колбы перемешивают в течение 20-24 ч. По окончании реакции сорбент отфильтровывают, про33 мывают водой 0,1 И раствором янтарной кислоты для удаления избыточного хрома (t!t) .

Концентрацию ионов хрома (!tt) в сорбенте определяют кз разницы его ,@р концентраций в качальном растворе и растворе после зарядки фосфатцеллюлозы спектрафотометрически с зтилендкаминотетрауксусной кислотой (ЭДТА) при 525 нм. ки дрожжевой гексокиназы Обладает рядОМ существенных недос >"аткоа .

Во-первых, исходная матрица, используемая для получения со))бента является дорогостоящей, низкостабильной к де йст ви10 мех анич ес ких и х имических факторов, Вследствие чего ох.раничиьается или полис>стью исклвчаеT— ся возможность использования сорбенТОВ, ПОГ1УЧЕННЫХ НР» ЕЕ ОСНОВЕ ДЛЯ ПРЕ— паративного Выделения и очистки Ферментов.

ВО-Вторых использ)емый B качестве лиганда сорбента (3-а2линопкрнд>1н) адениндинуклеотид является труднодоступным и дорогoc TOT114èM Веще стBoM > обладающим недостаточной химичеcaoé стабильнОстью, синтез еГО сложен и многостадиен > ""1то В KGHQ÷íoì счете

Ведет к дороговизне copE>OHTa Ha еГО

ocHoBG В целом и исключает возможность использования сорбента для практических целей.

В-треTьих сет(ектт1ВНОС» «ь (Орбента пО ОтнОшенив K дрожжевой гексОкиназе является невысокой, кбс приводимый общий фактор Очистки Фер)1ента даже В пиковой фракции составляет 20 раз и приВОдит K пОлученив препаратc» Фермен та с чистотой, составт1яа11!ей 20Ъ, при этом нет сведений а степени сохранения активности десорбироьанного Фермента.

Цель изобретения — упрощение Ilpoцесса получения сорбента для очистки дрожжевой гексокиназы и повышение селективной сорбционнай способности сорбента.

Поставленная цель достигается согласно способу получения сорбента для

Очистки дрОжжевОЙ гексОкиназы, заключа)(щемуся а присоединении лиганда к полисахаридной матрице — ФосфатцеллвлОэе путем Обработки пОслеДней расТ вором, содержащим ионы хрома (!!!) при мОльнОМ соотношении НОнОВ хрома (it!) и фосфатных Остатков (0,25-2):1 в 0,08-0,1 И ацетатном буферном растворе рН 5,4-5,8.

ОбрабОтку фосфатцеллвлозы СГ -co держащим раствором обычно осуществляют при постоянном перемешиааиии В течение 20-24 ч.

Концентрация ионов хрома (!!!) и сорбенте, полученном предлагаемыч способом, составляет 200-800 мкИ/г сорбента.

GpH зтОМ следует Отметить> чтО прн снижении концентрации ионов хрома (iii) (ниже 200 мкИ/г сорбента) вплоть до ex o отсутствия В фосфатцеллк)лозе сорбция дролакевой гексокиназы снижается до полного отсутствия сорбции на незаряженной ионами Cr+Ú Фосфатцеллюлозе ° С друГОЙ cTopoHbl> при далънейа)ем увеличении концентрации ионов хрома выше 800 мкИ/г сорбента происхоцит необратимая сорбция Фермента .

Пример 2. Очистка дрожжевой гексокиназы. а) 2,0 г комплекса фосфатцелллюлозы с иона2ли хрома (!t!) загружают В хроматографическую колонку (1 х 20 см) уравновешивают 5 МИ сукцинатным буферным раствором рН 6,0, содержащим

0„5 МИ ЭДТЛ и наносят 4,0 MM фермент— ного раствора дрожжевой гексокиназы фирмы "Флука" (Швейцария). Концентрация белка 1,45 мг/мл, удельная активность 28,0 ед/мг белка. При злюции

330 мл исходного буферного раствора рН 6,Î вымываются балластные белки.

Элюироаание активной гексокиназы профф водят градиентом хлористого натрия

От 0,005 N до 0,25 И В сукцинатном буферном растворе рН 6,0. удельная активность гексокиназы после десорбции 300 ед/мг белка. Выход ПО активВ5 ности 90Ъ.

857145

Составитель О. Скородумова

Редактор Н. Лазаренко Техред Н. Келушак Корректор Г. Решетник Ь

Тираж 530 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

11303S, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 7137/37 филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 лиганда к матрице проводят путем обработки последней раствором, содержащим ионы хрома (111) при мольном соотношении ионов хрома (ill) и фосфатных остатков (,0,25-2) : 1 в 0,080,1 М ацетатном буферном растворе рН 5,4-5,8. 2. Способ по и. 1, о т л н ч а юшийся тем, что обработку фосфатцеллюлозы Сг", -содержащим раствором осуществляют при постоянном перемешивании в течение 20-24 ч.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Womach F, С., Welch М. К., Мielsen 6, Colowich S. P., Очистка и феррологическое сравнение изоферментов дрожжевой гексокиназы Р-1 и P-П, Arch.. Biochem. Biophys. 158, 1973, с. 451-457.

2. Lee С. Y., Lagarus L. Н., Kabakoff D. S., mussel P,.G., Laver С г.M.

Кар1an .И. О. Purification of Кinases

by General Ligand Affinity Chromatography, Archives of Вiochem. Biophys, 178,(1977) 8 (прототип) .

3. Wright С. L. > Warsy А. S., Holrayde И. ь,, Тгауег G . P., Biochem

G., 175 (1978), 125.

4. Каренман И. M. Фотометрический анализ. М., "Химия", 1975, с. 260.