Способ получения баумицина а и в

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Соввтскик

Социалистических

Республик

< >867318 (63) Дополнительный к патенту(22) Закалено 30. 05. 77 (21) 2491882/28-13 (23) Приоритет — (32) 31. 05 ° 76 (3!) 51-63810 (33) Япония

Опубликовано 230981,Бюллетень М 35

<51)м. к.з

С 12 P 1/06

//А 61 К 31/33 (С 12 P 1/06, С 12 R 1/465) Госуаарстаениый комитет

СССР

ho аслам изобретений н открытий (53) УДН 615.779.

° 931(088.8) Дата опубликования описании 230981

Иностранцы

Хамао умааана, томно такаючи, Маса Хамада, МасааКи Исизука, Хироси Наканава, " 4 .М- -i ° „.

Точиказу Оки и Тайдзи Инуи (Япония) 13 " - 1 гкдут уу .- I,ß

Иностранная фирма эаиданкоднин Бисаабуиу кагану каккнюкаи, д"тгВН . у,. "" " (Япония) (72) Авторы изобретении (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАУМИЦИНА А И В (баумицин В) или

С-Сйэ

0g, !

25 (баумицин А) где R:

Изобретение относится. к микробиологической проьынленности и касается получения антибиотиков.

Предлагаемый антибиотик новый и способ его получения в патентной и научно-технической литературе не описан °

Целью изобретения является полу.чение баумицина А и В. $0

Эта цель достигается тем, что баумицин А и В общей формулы о„ получают путем культивирования штамма Streptomyces coerul eorubidus

МЕ 130-А4 (ATCC 31276), Streptomyces

peuceticus subsp.carreus ATCC 21354, Streptomyces peuceticus subsp ° caestus

NRRL-В-5337 или Streptomyces peuceti"

cus NRRL-B"3826 в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли с последующим выделением целевого продукта, при необходимости антибиотик хроматографически разделяют

На компоненты A и В и переводят в соли.

Баумицин — продуцирукщие штампы " получены из образцов почвы., собранных институтом микробиологической химии.в

Осаки, Токио (Япония) и обозначены штаммом NE 130-А4. Культуры этого штамма хранятся в Американской коллекции типовых культур в Роквилле (штат

Мериленд) и в Японском исследовательском институте ферментации под номерамн ATCC 31276 и FERMP-3540 соответственно.

8В 7318

Штамм обладает следующими культу- рально-морфологическими признаками.

Под микроскопом наблюдаются открытые спирали и крючкообразные формы, которые значительно развиты из разветвленного субстрата мицелия. Кольца отсутствуют, цепь споры имеет умеренную длину с числом .спор больше 10.

Размер спор 0,6-0,8 мкм X 1,0

1,2 мкм, поверхность спор покрыта шипами.

Глицериново-аспарагиновый агар. l0

Нити от бледно-красновато-желтого до темно-красного. Воздушный мицелий во-. дянисто-серого цвета. Растворимый пигмент - светло-красновато-желтый.

Сахарозо-нитратный агар. Сусбратный мицелий — нити бледно-красновато-желтые, бледно-красные до темно-красных.

Воздушный мицелий слегка белый. Растворимый пигмент — слегка темнокрасный.

20 .Глюкозо-аспарагиновый агар. Нити бесцветные, бледно-желтые до бледнооранжевых. Воздушный мицелий от слегка белых до светло-серых, становящихся обильными через 14 дн инкубирова- .

25 ния, Растворимый пигмент отсутствует.

Тирозиновый агар. Нити сероватокрасно-коричневые. Воздушный мицелий от сине-белого до светло-синего. Темно-коричневый растворимый пигмент.

Питательный агар. Нити желтоватокоричневые. Воздушный мицелий белый.

Растворимый пигмент коричневый.

Агар с дрожжевым экстрактом н солодовый агар — нити тускло-оранжевые.

Воздушный мицелий светло-серый. Растворимый пигмент слабо-коричневый.

Агар с овсяной мукой. Нити от бесцветных до бледно-оранжевых. Воздушный мицелий светло-серый. Раствори- 40 мый пигмент отсутствует.

Глицерино-нитратный агар. Нити от бесцветных до бледно-оранжевых. Воздушный мицелий от белого до светло-. серого. РаствоРимый пигмент отсутст- 4 . вует.

Ю

Снятое молоко — нити бледно-желтовато-коричневые, желтовато-коричневые до бледно-красных, воздушный мицелий слегка белый. Растворимый пигмент коричневый. физиологические свойства штамма.

Оптимальная температура роста от

30 до 37 С. Желатину разжижает. Крахмал гидролизует. Молоко пептонизирует и коагулирует при 37ОC. Меланин образует. ХорОшо растет с глюкозой, cL"àðàáèíoçîé, D-ксилозой, сахарозой, раттинозой, D-фруктозой,с -рамнозой, маннитом. Разжижает яблочнокислый кальций. 60

Получают баумицин путем культиви-,. рования штамма в стандартной водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота н неорганических. солей. В качестве источников углеро- 5 да используют глицерин, глюкозу, крахмал декстрин, сахарозу, мальто-, зу, масла, жиры. В качестве источников азота используют соевые бобы, дрожжевой экстракт, пептон, порошок семян хлопка, сухие дрожжи, жидкость для замачивания зерна или неорганические соли, такие как сульфат аммония, нитрат натрия или хлористый аммоний, из неорганических солей используют хлористый натрий, хлористый калий или фосфаты, при необходимости добавляют следы металлов и пеногасящие вещества, такие как адеканол или силикон °

Предпочтительной температурой культивирования является 25-30 С.

Максимальный выход баумицина в бульоне культуры достигается через

3-7 дн.

Для извлечения баумицинового комплекса бульон подвергают фильтрованию и фильтрат затем подвергают экстрагированию несмешивающимся с водой органическим растворителем, таким как этилацетат, бутилацетат, хлороформ или н-бутиловый спирт. Баумицин, находящийся в мицелии, извлекают хлороформом, ацетоном, н-бутанолом, метанолом, этанолом, этилацетатом или водным раствором органической или неорганической кислоты, такой как соляная кислота, серная кислота или уксусная кислота.

После концентрирования в вакууме баумициновые экстракты повторно экстрагнруют органическим растворителем, несмешивающимся с водой при рН 7-9, И затем баумицин растворяют в кислой водной среде при рН (4.

Затем баумицин в кислом водном растворе подвергают повторной экстракции органическим растворителем после регулировки рН до слабо щелочного значения.

Баумидин может быть извлечен из культуральной жидкости хроматографией на колонке с применением таких адсорбентов как активированный уголь, алюмогель, кремневая кислота или модифицированный декстран марки Сефадекс *Н-20, противоточным распределением или жидкостной хроматографией с применением органических растворителей.

Полученные таким способом активные экстракты концентрируют при пониженном давлении и в результате получают сырой красный порошок баумицинового комплекса.

Для получения баумициновых компонентов А„,А,В,и В осуществляют дополнительную очистку и разделение на колонке с использованием таких адсорбентов как кремниевая кислота, модифицированные декстраны, слабо кислые ионообменные смолы или активированный уголь, а также жидкостной хроматографии с противоточным .распределением и

867318

Баумицин

А2.

Слабощелочной аморфный красный порошок

Внешний вид

Н N

Элементарный анализ

О.

2,04 29,83 60,27 6,72 2 ° 31 29,52

2,08 30,88 60,61 6,43 2,08 30,88

Найдено

59,85 6,65

Теоретическое

60,61 6,43

Эмпирическая формула

С 14 Н43 М01

Молекулярный вес

673,7

Точка плавлеHHH OC

185"189

182-185

Удельное вращение PoL3

+135

+150 (снс1з. с - 0,1) Растворим в кислой воде, диметилсульфоксиде, метилцеллозолве, метиловом спирте, этиловом спирте, н-пропаноле, н-бутаноле, этилацетате, бутилацетате, ацетоне, метилэтилкетоне, хлористом метилене и хлороформе. Нерастворим в воде, н-гексане, циклогексане и петролейном эфире.

Растворимость

И значения

С:М=10:1

0,25

0,08

С-M:Â=723:3

0,39

0 28

0,26

С:М:F=90:10:1

0;17

0,64

0,74

С:М А=80 20:4

Кислый водный и метанольный раствор является красным, и переходит в красновато-пурпурный в щелочном состоянии. Баумицйны А„ и А дают положительную нингидриновую реакцию, и не восстайавливают раствор Фехлинга.

Реакция с применением приемлемых органических растворителей.

Активные элюаты разделяют, концентрируют при пониженном давлении и баумициновые компоненты индивидуально, очищают хроматографированием на Сефадексе АН-20. После концентрирования активных элюатов путем перекристалли4 зации из приемлемого органического растворителя получают баумициновые компоненты A«A, В и В в очищенной кристаллической форме. .1 2

Физико-химические свойства баумицина AiiA2I В,, и В представлены в табл.1.

Таблица

867318

ПРодолжение табл 1) Баумицин

УФ- и видимый спектр поглощения и максимальный (E„ ) в МеОН в 0,1й НС1 — МеОН

250,5 (421); 350 (80);

558(170); 596(164) 250,5(416); 350(83);

558(164); 597(152) в 0,1Н NaOH-MeOH

Баумицин

В 1

Слабощелочной аморфный красный порошок

Внешний вид

Элементарный анализ

Н

57,32 6,45 2,02 32,58 56,59 5,96 1,92 31,91

6,01 2,04, 32,57 59>38 6,01 2,04 32,57

59.т 38

Эмпирическая формула

С 1 Н41НО

Молекулярнйй вес

687,7

Точка плавления, Ñ

181-189

197-201

Удельное вращение fd.)2о

+170 +170 (СНС13 г ИеОН 1з1;С 0,1) Растворим в кислой воде, метилцеллоэолве, метаноле, этаноле, н-пропаноле, н-бутаноле. Нерастворим в воде, этилацетате, ацетоне, хлористом метилене, хлороформе, четыреххлористом углероде, бензоле, толуоле, этиловом простом эфире и н-гек-. сане, кроме того баумицин В растворим в воде

Растворимость

Найдено

Вычислено

234,5(452) 1 252,5(327), 289(120)1 478(127)1

497(128) 1 532(76) 234,5(459); 252,5(326);

289(121)p 479(133);

497(133); 532(78) 234,5(427); 252,5(311);

289(108); 478(125)1

497(128)1 532(.84) 234,5 (447); 252, 5 (311)

289 (111); 478 (131);

497 (131); 532 (70) 867318

Продолжение табл.1

Баумицин к эиачения

С:М=10:1

0,07

0,01

С:М:В=7:3:3

0,39

0,14

С:М:0=90:1031

0 18. 0,10

СФМФA=80s20:4

0,64

0,30

Кислый водный и метанольный раствор является красным, а в щелочной среде становится красновато-пурпурным. Баумицин В1 и В1 Дает ПОЛОжительную нинГиДРиновУю реакцию, и не восстанавливает раствор Фехлинга.

Реакция

Баумицин

234(575); 252(414);3

290(130); 478(176);

495(183); 530(120) 234 5(552); 253(385);

290(132); 476(179);

495(181); 530(101) 234(580); 253(397)р

290(140); 479(182);

495(184); 530(100) 234(616) р 253(419);

290(145)4 476(195);

494(191); 529(105) в 0,1й НС!-МеОН

251(499); 350(74);

556(231); 594(218); в 0,1Н NaOH-MeOH

251 (453); 350 (65);

556(206); 594(195) Баумицины Л „и А >, В1 и В1 являются стереоизомерамй отйосительно друг друга и могут легко различаться no физическим свойствам — различны точки плавления, удельное вращение, коэффициент йу для тонкослойной хроматографии, ЯМР-.пики.

Минимальные подавляющие концентрации, мкг/мл

Испытуемый организм баумицин баумицин баумицин баумицин

А1 Ag в . в

Staph.aureus

FD А209Р

3,12

100

1,56

Staph.aureus Smith 0,78

50

1,56

УФ- и видимый спектр поглощения и максимальный (е1 ) в МеОН

45 Баумицины A„,A, Г и В облада1 ют протнвомикробной активностью против широкого спектра микроорганизмов.

50 Противомикробный спектр баумнцинов А1,A1,В „ и В2 указаны в табл.2.

Таблица 2

867318

ПродОлжение табл.2

Испытуемый организм

Минимальные подавляющие концентрации мкг/мл баумицин баумицин баумицин бауми1 А2. В1 цин В2

3,12

100 >100

100 >100

3i12

В.megaterium

NRRL В-938

1,56

1-00 >100

6,25

Sarcina 1utea

ATCC 9341

HlcfococcUs

f lavs, 25

3,12

0,78

1,56

0,78

Coryne bov i s 1810

50

1,56

6,25

100 >100

>100 >100

100

>100

Candida a lbicans

АТСС607

6,25

12,5

100 > 100

Can d i da tropicali s

1AN4905 100 >100

100

100

Таблица 3

Доза, мг/кг/

/день

147 155

165 135

136 111

117 99

167 105 99

173

0,5

0,25

163

151

141

0,125

0,06

> 3.00

0,03

0 015

187

155

131

0,008

0 004

131

В.subtilis ATCC 6633 0,78

В.cereus ATCC 9634 1,56

Ps.fluorescens

N1Н 8-254 >100

Proteus morganii )100

Как следует из табл.2 баумицины

А„,А,В„и В1 обладают противомикробной актйвностью, особенно против грам-положительных бактерий, и следовательно являются,терапевтически пригодными для лечения животных и человека от дифтерии, туберкулеза, пневмонии, тетануоа и других инфекционных заболеваний, вызванных грам-положительными бактериями.

Ваумицнны А„,A,Â,è В обладают противоопухолевой активностью при низкой токсичности, что было установлено в экспериментах на подопытных 5п животных, и таким образом являются терапевтически полезными для подав» ления роста опухолей у млекопитакщих.

В частности, баумицины А„,А,В„ и В оказывают значительное подавляющее действие на cL-1210 лейкемию у мышей.

Например, мышей заражают интраперитониально 1и10 *-1210 клетками иэ расчета на одну мышь, -и спустя 24 ч после заражения интралеритониально вводят лекарство один раэ в день в d0 течение 10 дн. На 30 дн. определяют процент продления времени выживания по сравнению с контрольными животными. Результаты экспериментов пред- ставлены в табл.3. б5

Продление времени выживания, ll бауми- бауми- бауми- баумицин А„цин А1 цин В„цин В

l3

14

867318

15-20 бауэщцин А баумицин В1 40-60 баумицин В 75-100

Соединения по предлагаемому изо- (() бретению образуют нетоксичные соли— аддукты кислот с различными органическими и неорганическими солеобразующими реагентами, а также нетоксичные комплексы е деокснрибонуклеиновой кислотой. Так, соли-аддукты кислот, полученные с такими фармацевтически приемлемыми кислотами, как серная, фосфорная, соляная, уксусная, ..пропионовая, и кислоты оленновая, пальмитиновая, лимонная, янтарная, винная, глутаминовая, пантотеновая и т.д., нетоксичные комплексы с деоксирибонуклеиновой кислотой могут применяться так же, как и сами баумициновые соединения. Соли получают, 25 выделяют, очищают и формулируют способами, обычно применяемыми при приготовлении.солей для антибиотикбв.

Формы для внутрибрюшного введения включают стерильные вЬдные или щ неводные растворы, суспенэии или эмульсии. Они также могут производиться в виде стерильных твердых составов., которые могут растворяться в стерильной воде, физиологическом рас- 35 творе или некоторых других стерильных пригодных для вспрыскивания средах непосредственно перед применением., Применяемые предпочтительные количества баумицинового антибиотика .40 необходимо менять в зависимости от применяемого соединения; от типа композиции, схемы лечения и типа заболевания. Обычно баумициновые антибиотики впрыскивают животным внутрнбрюш- 45 но, .внутривенно,подкожно или местно, а человеку внутрибрюшно или местно.

Следует учитывать многие факторы, которые модифицируют. действие лекарства, например возраст, вес тела, 50 пол, диету, Время введения, схему лечения, скорость введения, состояние пациента, комбинацию лекарств, чувствительность и тяжесть заболевания. Введение может осуществляться непрерывно или периодически с применением толерантных доэ. Оптимальные применяемые количества для данного перечня условий могут быть установлены специалистами в данной области с применением стандартных методов ис- do пытаний.

При применении баумициновых композиций в качестве противомикробного вещества композиции обычно вводят / так, чтобы концентрация активного 65

1 5

0,1

0,1

0,3

0,125 (рй 7,.4) 2,5

0,25

0,32

0,125 (рН 7,4) Минерал .

CuSO4 ° 5H O 1,25 г

М и 5 04 4 Н 10 1,25 r

ZnSO4 7Н 0 12,5. г в 500 мл воды.

Приготовленный бульон культуры фильтруют для отделения фильтрата культуры и мицелия. Фильтрат трижды экстрагируют 1/5 объема хлороформа.

Мицелий трижды зкстрагируют 2 л ацетона на 1 кг фильтровой лепешки, и полученный ацетоновый экстракт концентрируют до половины объема при пониженном давлении.

Концентрат трижды экстрагируют

2 л хлороформа, объединяют c::::лороформовым раствором, который получают из фильтрата культуры, и концентрируют досуха прН пониженном давлении.

10 r маслянистого вещества растворяют в 50 мл хлороформа, и образующийся при добавлении 300 мл н-гексана осадок центрифугнруют в течение

5 мин при 3000 об./мин для удаления неочищенных веществ, растворимых в .

Острая токсичность. Величины 4,0 т

l при внутрибрюшном введении антибиотиков следующие:

50 (Mr/êã) баумицнн A 1,5- 2,5 компонента была вы е минимальной подавляющей концентрации для конкретного типа организма, который лечат.

Пример 1. Готовят нитательную среду следующего состава, вес;Ъ:

Картофельный крахмал 1

Глюкоза 1

Порошок соевых бобов к нро4

М95 04 7Н 10 йаС1

Минерал

CuSO4 5Н 0 2,8 r

FeS04. 7Н,„О 0,4 г

ИпС11 4Н, 0 3,2 г

ZnSO< 7Н 0 0,8 r в 500 мл в оды.

50 мл этой среды стерилиэуют при

120 С в течение 15 мии в 500 мл колбе, которую засевают косой культурой агара Streptomyces coerutåîãuÛ dus

NE 130-А4 с помощью платиновой петли.

Инкубирование производят в течение

72 ч при 28 С на вращакщейся мешалке (230 об/мин) . Среду используют в качестве посевного материала. Готовят

7 л следующей среды, и 50 мл порции среды, введенные и стерилизованные в 500 мл колбе, асептически засевают

1 мл указанной культуры. Брожение про. водят при 28оС в течение 7 дн на вращающейся мешалке (230 об./мин). Получают, вес.Ъ:

Сахароза 4

Порошок соевых бобов

МаИ

Карбонат кальция

Минерал

867318

0 5 кальция 0,32

Соевая мука 2

Минерал+ 0,2 (рН 7,4)

+ — тот же, что и в примере 1.

Готовят 8 литров укаэанной среды, которую распределяют по 50 мл порциями по 500 мл колбам, стерилизуют при

120 С в течение 15 мин и засевают

1 мл посевного McLTepmapa Streptomyces.55

peucet|cus subsp.carneus ATCC21354, приготовленного в соответствии с методикой примера 1. Брожение осуществляют на вращающейся мешалке при 28 С о в течение 6 дн. Бульон культуры филь- р труют для отделения мйцелия от фильтрата культуры. Осуществляют экстрагирование хлороформом и ацетоном,как и в примере 1, и получают 10 r маслянистого продукта. Последний раство- 65 н-гексане. Полученный осадок (1,4 г) растворяют в 100 мл хлороформа и трижды экстрагируют 150 мл 0,01 M уксусной кислоты для получения веществ, растворимых в кислоте. К экстракту добавляют 2 М трис-оксиамино-метано- вый раствор, доводя рН до 8,5, и за- .

5 тем раствор трижды зкстрагируют

100 мл хлороформа. В результате получают 230 мг красного сырого порошка (баумициновый комплекс) из хлорофор" мового слоя путем концентрации досуха при пониженном давлении.

Пример 2. Сырой порошок, полученный в примере 1 (230 мг), растворяют в 2 мл смеси хлороформа и метилового спирта (10:1), вводят в колонку длиной 65 см и диаметром 8 см, заполненную 80 г кремневой кислоты, и промывают смесью хлороформа и метилового спирта (10:1). Сначала элюируют баумициновую А,-фракцию, а затем по- Щ следовательно баумицины А,,В„ и В, применяя соответственно в качестве элюирующего раствора смеси 8:1, 5:1 и 2:1 хлороформа с метиловым спиртом.

После того, как каждую активную фракцию собирают отдельно и концентрируют досуха при пониженном давлении, кажцую такую фракцию вводят в колонку длиной 25 см и диаметром

1,8 см, заполненную Сефадекс dH-20, и промывают смесью 3:1 толуола и ме-тилового спирта

После концентрирования каждой полученной фракции путем добавления к концентрату н-гексана получают в виде красных порошков 10 мг баумицина

А, 18 мг баумицина А, 3 мг баумицнна В„и 1 мг баумицина В .

Пример 3. Готовят питательную среду следующего состава, вес.Ъ:

Картофельный крахмал 2 40

Глюкоз а 2

Дрожжевой экстракт

Хлористый натрий- 0,25

Карбонат

1

1,5

0,1 о,х

0,125 (рН 7,4)

2,8 r

0,4 г, 3,2 г

0,8 г — CuSO 5Н10

FeS04 7Н, О

МпС(g. 4Н О

2П504 7Н20 в 500 мл воды.

50 мл этой среды стерилизуют при

120оС в течение 15 мин в 500 мл колбе, которую инокулируют платиновой петлей культуры Streptofsyces peucetlcus subsp.caestus NRRL-В-5337, выра" щенной на скошенном агаре.

Инкубирование продолжают в течение

72 ч при 28оС на роторном шейкере (230 об./мин). ряют в 100 мл метилового спирта и растворимых s н-гексане веществ путем добавления 100 мл н-гексана и получают 1,2 г осадка после удаления.

Красный осадок растворяют в 100 мл хлороформа и экстрагируют 600 мл буфера-ацетат натрия (рН 3,0) для получения растворимой в воде субстанции.

После, добавления к экстракту 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты в количестве, необходимом для получения раствора 0,01 М, регулируют рН до величины, равной 8, для чего добавляют 4 М хлоргидрата натрия.

Активные компоненты этого водного раствора экстрагируют четыре раза

200 мл хлороформа, и затем дважды экстрагируют 500 мл н-бутилового спирта. Получаемые хлороформовый и н-бутанольный слои концентрируют порознь при пониженном давлении и получают 200 мг красного порошка, который в основном представляет собой баумицин В . Этот сырой порошок растворяют в 5 мл хлороформа — метилового спирта, вводят в колонку длиной

23 см и диаметром 3,0 см, заполненную 80 r кремневой кислоты, и промывают смесью 20: 1 хлороформа и метилового спирта. Баумицин В„и В2 элюируют последовательно смесями 5: 1 и 2: 1 хлороформа и метилового спирта. Фракции баумицинов В и В концентрируют порознь при пониженном давлении, в результате чего получают 50 мг баумицина В„и 8 мг баумицина В .Полученные баумициныВ„ и В перекристаллизовывают из метилового спирта и получают 31 мг и 6,5 мг кристаллического материала соответственно. При указанном способе получают очень незначительные количества баумицина А „ и А .

Пример . 4. Готовят питательную среду следующего состава, вес.%: ,Картофельный крахмал

Глюкоза

Соевый порошок

К НРО

NgSOs ° тН О йаС!

Минерал

867318 18 и 1,8 сМ в диаметрь, заполненную

Сефадексом Н-20 и промывают смесью толуол — метанол (3:1). После концентрирования каждой иЗ фракций, полученного при добавлении н-гексана - к концентратам, получают красные порошки: 11 мг баумицина А,„ 10 мг баумицина А, 7 мг баумицина В и .

3 мг баумицина В4 .

Пример 5. Получают питательную среду следующей композиции, вес.%

Картофельный крахмал

Глюкоза

Соевый порошок

К НР04

15 Нд50+ ° 7Н О .

МаС!

Минерал

Готовят 7 л описанной средй и .50 мл среды, находящейся в стерилизованной 500 мл колбе, асептически инокулируют 1 мп указанной посевной культуры. В течение 7 .дн на роторном шейкере (230 об./мин) проводят ферментацию при 28 С, вес.В: . Сахароза 4

Соевый белок 2,5

Карбонат кальция

МаС1

Минерал»

0i 32

0,25

0,125 (рН 7,4)

1,25 г

1,25 r

12,5 r

1

1,5

О, 1

0,1

0,3

0,125 (рН 7,4)

2,8 г

0,4 r

3,2 r

0,8 г — CuSO4 5Н О

MnClg 4нао

ZnSO+. 7H10 а 500 мл воды.

Полученный культуральный бульон от ильт овывают ля того чтобы азгируют 2 л.ацетона на 1 кг лепешки,и полученный ацетоновый экстракт концентрируют до половинного объема при пониженном давлении. с хлороформовым раствором,.который получают для фильтрата культуры, и концентрируют досуха при пониженном давлении, 10 г полученного маслянистого вещества растворяют в 50 мл хлороформа, а осадок, выпавший при добавлении 300 мл н-гексана, центрифугируют в течение 5.мин при 3000 об./мин для удаления примесных веществ, расдок (1,8 r) растворяют в 100 мл хлороформа и экстрагируют трижды 200 мп

0,01 М уксусной кислоты до получения 40 растворимого в кислоте вещества. К этому экстракту добавляют 2 М раствора трис-окси-аминометана для установле0,32

0,125 (рН 7,4)

1,25 г

1,25 г

12,5 r ния рН 8,5; а затем этот раствор триж*-CuSO4 5Н10

MnC1 ° 4Н О

ZnSO4 ° 7Н О в 500 мл воды.

Полученный таким образом культуральный бульон отфильтровывают для разделения фильтрата культуры и мицелия. Фильтрат трижды экстрагируют

1/5 объема хлороформа. Мицелий экстрагируют трижды 2 л ацетона на 1 кг лепешки, и полученный ацетоновый экс-. тракт концентрируют до половинного объема при пониженном давлении, ды экстрагируют 100 мл хлороформа. В 45 результате получают 185 r красного неочищенного порошка (комплекс баумицина) из слоя хлороформа после концентрирования его досуха при пониженном давлении. 50

185 r полученного неочищенного порошка растворяют в 2 мл смеси хлороформ — метанол (10:1), вводят в колонку 65 см длины и 8 см в диаметре, заполненную 80 г кремневой кислоты, и промывают смесью хлороформ — метанол (10:1). Вначале элюируют фракцию баумицина А4, затем послеДОвателъно баумицин А, В„ и Ь2,причем, соответственно, в качестве элюента используют смесь хлороформ — метанол (8:1, 60 5:1 и 2:1).

Каждую активную фракцию собирают отдельно и концентрируют досуха при пониженном давлении, каждую иэ этих фракций вносят в колонку 25 см длиной 65

Концентрат трижды экстрагируют

2 л хлороформа, объединяют с раствором хлороформа, который получают иэ фильтрата культуры, и концентрируют досуха при пониженном давлении. 10 г полученного маслянистого вещества растворяют в 50 мл хлороформа и îñàдок, образовавшийся при добавлении ф д

1 P делить фильтрат культуры и мицелий. -Са504 ° 5Н О

Фильтрат трижды э кстрагируют 1/5 объ- Щ F e 5 04 . 7 Н 10 ема хлороформа. Мицелий трижды экстра- НпС11 4Н О ZnSO4 ° 7Н О и в 500 мл воды

50 мп этой среды стерилиэуют при

120 С в течение 15 мин в 500 мл колбе, которую,инокулнруют платиновой

Полученный концентрат трижды экс петлей культуры Streptomyces peucetl" трагируют 2 л хлороформа, объединяют cus NRRL-В-3826 на скошенном агаре.

Инкубирование проводят в течение

72 ч при 28 С на роторном шейкере (230 об./мин). Готовят 7 л описанной далее среды и 50 мп среды, распределенной и стерилизованной в 500 мл колбе, асептически инокулируют 1 мп укаэанной культуры. Ферментацию проводят при 28 С в течение 7 дн на роторном шейкере (230 об./мин) . Полутворимых в н-гексане. Полученный оса- . чают1 вес.в:

Сахароза 4

Соевый белок 2,5

МаС1 0,25 . Карбонат кальция

Минерал"

867318

Формула изобретения

Й

20 где R (баумицин А) 25 или (баумицин В) Составитель С.Малютина

Редактор В.Данко Техред М.Голинка Корректор М.Коста

Заказ 8121/85 Тираж 531 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва,Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", r Óærîðîä, ул.Проектная,4

300 мл н-гексана, центрифугируют в течение 5 мин со скоростью 300 об. /мин для удаления примесных веществ, растворимых в н-гексане. Полученный осадок (1,2г) растворяют в 100 мл .хлороформа и трижды экстрагируют 150 мл

0,01 M уксусной кислоты до получения растворимых в кислоте веществ. К этому экстракту добавляют 2 М раствор трио-оксиаминометана для установления рН 8,5, а затем полученный раствор трижды экстрагируют 100 мл хлороформа. Таким образом, получают 97 мг неочищенного порошка красного цвета (комплекс баумицина) из слоя хлороформа путем концентрирования досуха при пониженном давлении.

Полученный таким образом неочищенный продукт (97 мг) растворяют в

2 мл смеси хлороформ . — метанол (10:1) вводят в колонку длиной 65 см и диаметром 8 см, заполненную 60 r кремневой кислоты, и промывают смесью хлороформ — метанол (10:1).В начале элюируют фракцию А, затем последовательно фракции баумицина А, В и

В при этом используют в качестве элюента смеси хлороформ — метанол (8:1, 5:1 и 2:1).

После того, как каждую иэ активных фракций собирают отдельно и концентрируют досуха при пониженном давлении, их вводят в колонки 25 см длиной, 1,8 см диаметром, заполненные Сефадексом (.Н-20, и промывают смесью толуол — метанол 3:1. После концентрирования каждой из фракций, полученных ранее, после добавления к концентратам н-гексана получают красные порошки: 10 мг баумицина А„, 5 мг баумицина A 1 мг баумицина B„ и

3 Mr баумицйна В .

Предлагаемый способ позволяет получить антрациклиновые гликозидные антибиотики баумицина А и В.

Способ получения баумицина A и В общей формулы отличающийся . тем, что штамм Streptomyces coeruleorubidus

МЕ 130-A4 (ATCC 31276), St reptomyces

peucetlcus subsp.carneus ATCC 21354, Streptomyces peuceticus subsp.caestus

NRRL-В-5337 или Streptomyces peuce"

tlcus NRRL-В-3826 культивируют в аэробных условиях на питательной сре, де, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли .с последующим выделением целевого продукта,пpd

40 необходимости антибиотик хроматографически разделяют на компоненты A u

В и переводят в соли.