Иммуносорбент

 

O П И С А Н И Е ()883052

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

CoIo3 Советских

Социалистических

Республик (6I ) Дополнительное к авт. саид-ву (22) Заявлено 14. 11. 79 (21) 2855420/23-04 с присоединением заявки J% (23) П риоритет— (51)М. Кл.

С 07 G 7/00

С 12 N 11/08

G О) и 33/54

Государстаенный комнтет по делам нзооретеннй н открытнй

Опубликовано 23.11.81. Бюллетень М 43

Дата опубликования описания 25. 11 81 (53) ЛК 547.962, .9(088 ° 8) (72) Авторы изобретения

А. Б. Алексеев и В. M. Земсков (71) Заявитель

Всесоюзный кардиологический научный цен (54) HNMYHOCOPBEHT

Изобретение относится к области получения иммуносорбентов для иммунологических исследований.

Иммуносорбенты достаточно широко применяют в иммунологических и биохимических исследованиях для выделения высокоочищенных препаратов антител антигенный иммуносорбент или белков антительный сорбент . Для этого исследуемый белок тем или иным способом связывают с полимерным носите10 лем, полагая, что п сле образования нерастворимого иммунного комплекса на иммуносорбенте появляется возможность максимально полного освобожде15 ния препарата от различных примесей.

После диссоциации иммунного комплекса антитела (или антигены) освобождаются с иммуносорбента в чистом виде.

Отсюда видно, что иммуносорбенты должны отвечать ряду требОваний 1 .е. Оны должны обладать механической прочностью, не разрушаться при многократном использовании, не обладать неспецифической сорбционной способностью и обладать достаточной емкостью, под которой понимают количество белка, иммо- . билизованного на единице веса или обьема носителя.

Известен иммуносорбент на основе коллагена I типа, представляющий собой коллаген I, типа, связанный с диазотированной п-аминобензилцеллюлозой (PAB-целлюлоза) . Способ получения данного соединения включает стадии предварительной подготовки носителя, т.е. диазотирование PAB-целлюлозы смесью соляной кислоты и нитрита натрия и связывание диазотированного носителя с коллагеном I типа (I).

Недостатками известного иммуносорбента являются недостаточно высокая емкость (0,06 мг антител/мг коллагена. содержащегося в сорбенте,или 0,06 мг антител/мг сорбента, или 1 мг коллагена/мл сорбента), а также недостаточная механическая прочность..Кроме того, структура и свойства иммуно883052 сорГ>опта обуславливает необходимость использования для элюции антител определенного элюирующего агента - трипсиновых фрагментов коллагена, получение которых само по себе представляет дополнительную трудоемкую процедуру, в результате чего усложняется и использование сорбента.

Целью изобретения является новый иммуносорбент на основе коллагена I 10 типа, обладающий улучшенными свойства;ми по сравнению с известным (большей емкостью и механической прочностью) и обуславливающий более простые условия использования в иммунологической 15 практике, а также расширение ассортимента иммуносорбентов на основе коллагена ? типа.

Цель изобретения достигается свойствами нового иммуносорбента — колла20 гена I типа, связанного с модифицированным сополимером акриламида — N 11 -метилен-бис-акриламида-агарозы, имеющего следующие элементарный состав и характеристики (на сухое вещество), :

С 52,3-54,8

Н 6,5-10,7

N 4,3-4,5

О 32,7-34,2

0,002-0,005

Соединение представляет собой белый водонаполненный гель с содержанием воды от 92 до 96, слаборастворимо в диамине, не растворимо в воде, спирте, ацетоне, уксусной кислоте и эфире.

Способ получения этого продукта, используемого в качестве иммуносорбента, основан на известной реакции связывания белков.с карбонилсодержащими носителями образованием азометиновых связей между аминогруппами белка и карбонильнымн группами носителя (2j .

Введение карбонильных групп на поверхность носителя осуществляется обычно обработкой альдегидами, наиболее часто для такой модификации исполь.4 зуется глутаровый альдегид.

Способ получения предлагаемого соединения осуществляется следующим образом.

Сополимер акриламида N, N -метилен-бис-акриламида-агарозы модифицируют действием глутарового альдегида в фосфатном буфере, рН вЂ” 7.,6 в течение

14-16 ч. К активированному таким образом носителю- в растворе добавляют 55 коллаген I типа и ведут реакцию связывания белка с носителем при комнатной температуре в течение 14-16 ч или в течение 48 ч при >> С с поелс,»уи>>0>:1 восстановлением азол>етпвоных связей и альдегидных групп продукта. Полученный иммобилизованный коллаген I типа проявляет свойства иммуносорбента, обладает высокой емкостью, хорошей регенерационной способностью и удобен при работе.на хроматографических колонках из-за хороших механических свойств.

В частности, при синтезе иммуносорбента к носителю присоединяется до 90 белка, участвовавшего в реакции иммобилизации, что в 2 раза превышает аналогичный показатель у известного сорбента. Емкость полученного сорбента составляет: 0,17 мг AT (антител) на мг коллагена сорбента, или 0,22 мг AT/ìë сорбента, или .1,3 мг оллагена/мл сорбента, что в 3-4 раза превышает емкость известного сорбента.

Поскольку оба сравниваемых сорбента в единице объема содержат примерно равное количество иммобилизованного коллагена {1,3 мг и 1 мг в 1 мл сорбента), увеличение емкости сорбента можно объяснить созданием оптимальных условий стерического взаимодействия при образовании иммунного комплекса на иммуносорбенте.

Кроме того, элюцию антител на предлагаемом сорбенте ведут обычно употребляемыми агентами — 0,2 М глицин-НС1 рН вЂ” 2,2 без применения трипсиновых фрагментов коллагена. Процесс упрощается и при этом примесь неспецифических белков не увеличивается. Предлагаемый иммуносорбент наряду с повышенной емкостью обладает механической прочностью, химической ста бильностью и низкой неспецифической сорбцией. Отмеченные характеристики обусловлены выбором в качестве носителя гранулированного сополимера акриламида Й,Й -метилен-бис-акриламида-ага> розы, что, наряду с чисто механической устойчивостью, создает лучшие условия при образовании на сорбенте иммунного комплекса.

Пример 1. 110 мл сополимера акриламида-), N -метилен-бис-акриламида-агарозы марки АсА-44 (размер частиц

60-140 мол.вес. 20000-120000,содержание акриламида 4%, агарозы 4%) многократно отмывают дистиллированной водой до полной прозрачности надосадочной жидкости. Далее суспензию доводят до 6% содержания раствором 25 . глутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,6 и оставляют при слабом

88 >Î >2 4 пер I>eII>èI>nø>>I ва 16 OJ>e с>копчания активации избыток глутарового альдегида удаляют и гель тщательно отмывают ди THJI лированной водой до полного отсутст- 5 вия следов глутарового альдегида. К суспензии затем добавляют раствор коллагена I типа íà 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4 в концентрации 2 мг/мл (всего 195 мг коллагена ) и смесь инкубируют при слабом перемешивании.в течение 46 ч при 4 С, затем несвязавшийся белок отделяют многократным промыванием фосфатным буфером рН 7,4 и проводят восстановление сорбента раствором боргидрида натрия на этом же буфере с конечной концентрацией 17. в течение 45 мин при 4 С. Полученный сорбент отмывают 1 л 0,1 И фосфатного буфера рН 7,4, 0,5 л 0,2 М глицин-НС 3 20 рН 2,2 и вновь 1 л 0,1 M фосфатного буфера рН 7,4.

Получают 130 мл геля, 1 мл которого содержит 1,3 мг иммобилизованного коллагена 1 типа (т.е. 90% взятого в р5 реакцию белка иммобилизируется на носителе) . Состав сухого вещества следующий: С 54,8Х; Н 6,47; N 4,6Х; 0 34,2%, S 0,002Х. Продукт после добавления мертиолата (1:10000) или азида нат- 5р рия (до 0,2%) хранят при 4оС

Удлинение времени иммобилизации коллагена I тTиHIпIа a нHеetцlеeJлIеeсcоoоoeб>1р>аaз3нHоo, поскольку при этом усиливаются процессы деструкции молекулы белка. Точно так35 же нецелесообразно увеличение величины рН.

П,р и м е р 2. Условия получения соединения идентичны огисанным в примере 1 за исключением того, что вместо

I сополимера акриламида-N,N -метилен-бис-акриламида-агарозы марки АсА-44, берут марку АсА-22 (содержание акрил15

7 ll

Форму„ > и > б е-1-ения

0 32,7-34,2

S 0,002-0,005

Белый водонаполненный гель с содержанием воды от 92 до 96Х, слаборастворим в тиамине, не растворим в воде, .спирте, ацетоне, уксусной кислоте и эфире.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. R. Т1п>р1, Н. Further>ayr, С.Stefferi, W> DoIeschel "Isolation of pure Иммуносорбент, представляющий собой коллаген 1 типа, связанный с моди" фицированным сополимером акриламида> — 1>, М -метилен-бпс — «крилам>п1а-агарозы, имеющий следующий элементарный состав (на сухое венк.ство), г,:

С 52, 3-5-4,8

II 6,4-!0,>

I>i >;3 амида 2%, агарозы 2%). Ill>JIó÷JIíï 100 мл геля, 1 мл которого содержит 1,3 мг

> иммобилизованного коллагена I типа.

Состав сухого вещества иммуносорбента следующий: С 52,37.; Н 10,77.; > 1 4,37., 0 32,7%; S 0,0057..

Данные соединения были использованы как иммуносорбенты.

Сорбционная активность их иллюстрируется примером 3.

Пример 3. 130 мл иммуносорбента, полученного в примере 1, заполняют хроматографическую колонку диаметром 16 мм и длиной 25 см. Колонку с сорбентом (все операции ведутся при

4 C), промывают 0,5 л 0,1 11 фосфатного буфера рН 7,4 со скоростью 20 мл/ч,, затем 200 мл 0,2 M глицин-НС1 рН 2,2 и снова фосфатным буфером до нейтрального рН. После этого наносят 100 мл иммунной сыворотки со скоростью

20 мл/ч и колонку отмывают фосфатным буфером до нуля оптической плотности выходящего из колонки раствора. Антитела с колонки элюируют 0,2 М глицин-HC t рН 2, 2, нейтрализуют 4 M трис-HC t рН 7,4, диализуют против фосфатного буфера в течение ночи и концентрируют. Сконцентрированные антитела осветляют центрифугированием, разливают на аликвоты и хранят замороженными при -25 C. Проведенный иммуноэлектрофоретический-и иммунодиффузионный анализ показал, что полученные препараты содержат антитела, относящиеся к 1 Г классу и не содержат примеси неглобулиновых белков.

Полученный иммуносорбент может быть использован более 15 раз в течение 6 мес. без потери сорбционных свойств. Количество антител, полученных в течение 15 выделений из 100 мл сыворотки, представлено в таблице.

2. Иммобилизованные ферменты. Пол ред. И.В. Березина, В.К. Антонова, К, Мартинека.. Т. 1., N. 1976, изд-во

ИГУ, с. 184.

7,883052

anti-co)lagen antibodies ustng à specific lmmvnoad sorbent tecanique", Z. Immunitatsforsa, 1967, 134, 4, 391-396.

Корректор А. Ференц

Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Составитель О. Скородумова

Редактор Т. Кугрьпвева Техред J Ãaâðèëåmêî

Заказ 10113/31 Тираж 400

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москва, Ж-35, .Раушская наб.s д. 4/5