Способ оценки жизнеспособности грамотрицательных бактерий
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Союз Советсиик
Соцнапнстичесник
Рос убпни
С 12 Q 1/04
Рвудерстеюм11 кещвтет
СССР ав дееен взееретевие н атерытв11 (23) Приоритет(53) УДК.093.6 (088. 8) Опубликовано 07.02.82 ° Бюллетень № >
Дата опубликования описания 09.02.82 (72) Авторы изобретения
Е.О. Пучков и И.Г. Говорунов ут
Всесоюзный научно-исследовательский инсти прикладной микробиологии (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ )КИЗНЕСПОСОБНОСТИ
ГРАИОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ
Изобретение относится к микробиологии, а именно к исследованиям микробиологических объектов. Известны способы быстрой (экспресс-) оценки жизнеспособности культуры грамотрицательных бактерий, ос-. нованные на исследовании тех или иных повреждений клеток 1.11 .
Однако указанные способы не могут быть использованы.для оценки процент" . ной доли жизнеспособности бактерий после замораживания.
Наиболее близким техническим решением к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ оценки жизнеспособнос15 ти грамотрицательных бактерий, предусматривающий приготовление бактери" альной суспензии и ее замораживание (21.
Способ заключается в высеве бактериальной суспензии после замораживания на питательную среду с последующим подсчетом колоний.
Недостатками известного способа являются длительность анализа (не менее 8 ч}, большая трудоемкость и большой расход реактивов.
Цель изобретения — сокращение времени анализа, а также упрощение и удешевление способа.
Поставленная цель достигается тем, что по способу оценки жизнеспособности грамотрицательных бактерий, предусматривающему приготовление бактериальной суспензии и ее замораживание, перед замораживанием и после него измеряют светорассеяние бактериальной суспензии сначала в 300 мИ растворе КС1, а затем в дистиллированной воде, после чего определяют разность светорассеяния, а по соотношению разностей светорассеяние после и до замораживания судят о жиз-неспособности бактерий.
Способ основан на том, что в ходе замораживания и последующего оттаивания происходит нарушение барьерных
90338
Метод десятикратных разведений
Предлагаемый метод
Вид микроорганизмов
Контроль Опыт
Контроль
Опыт
Escherichia col1
61 5 100+4
59+-4
100++5
Pseudomonas acrugi"
nosa
80+ 3 100+6
100+ 5
82+ 6
3 свойств цитоплазматической мембраны бактерий. Это приводит к двум послед.ствиям: изменяется коэффициент преломления внутриклеточного содержимого и возрастает проницаемость 5 мембран для неорганических ионов в
+ том числе ионов К . Все это приводит к уменьшению плазмолитической реакции клеток при помещении их в гипертонический раствор КС! (300 мМ). . 10
Именно это уменьшение и регистрируется по ослаблению светорассеяния замороженных клеток в растворе КС1 по сравнению с интактными клетками.
Способ осуществляют следующим об разом.
Часть водной суспензии бактериаль8 Я ных клеток в концентрации 10 -10кл/мл подвергают замораживанию и оттаиванию. Измеряют интенсивность светорассеяния немороженых и мороженых клеток в строго одинаковой концентрации в 300 мК растворе хлористого калия и в воде. Светорассеяние,измеряют под углом 90 . Длина волны о падающего света 500-600 нм. Разность между интенсивностью светорассеяния немороженых клеток в растворе КС8 и в воде принимают за 100Х. Эту же величину измеряют у клеток, подверг. нутых замораживанию и оттаиванию, и выражают. ее в процентах по отношению к интактным клеткам. Полученная величина характеризует долю жизнеспособности клеток в суспензии после замораживания.
Пример . Клетки Escherichia
coli u Pseudomonas acruginosa вырашивают до стационарной фазы роста, отмывают от культуральной жи„(кости 8О и рассуспензируют в дистиллированной воде до гомогенности. Суспензию каждого вида микроорганизмов в концентрации 10 10 кл/мл делят
Я на две части вЂ, контрольную и опыт2 1 ную. Контрольная суспензия не подвергается каким-либо воздействиям.
B таблице показана жизнеспособность бактерий Escherichia coli u
Pseudomonas acruginosa, Ж, после замораживания и оттаивания, измерен" ная с помощью метода десятикратных разведений и предлагаемого метода.
Опытную пробу объемом 0,5 мл в стеклянной пробирке погружают в жидкий азот, где выдерживают 1520 мин и размораживают при комнатной температуре.
В оптическую кювету, содержащую раствор 300 мИ КС8, помещают суспензию бактерий, служащую контролем, до конечной концентрации 1О кл/мл и перемешивают в течение не более
5-6 с. На флуориметре измеряют интенсивность светорассеяния суспензии под углом 90 при 500-600 нм.
Ф
Светорассеяние суспензии бактерий в растворе ЗОО мМ КСЬ изменяется во времени. В течение первых 1020 с, оно возрастает, а затем начинает уменьшаться. Измерение светорассеяния проводят в максимуме. Это измерение удобно проводить с использованием самописца. После измерения светорассеяния в растворе КС1 проводят измерение светорассеяния в дистиллированной воде находят разность между первой и второй измеренными величинами.
Описанньы способом регистрируют разность светорассеяния суспензии опытных бактерий в растворе 300 мМ
КС1 и дистиллированной воде, для опытных бактерий по отношению к контрольным. Эта величина характеризует число жизнеспособных клеток. в популяции бактерий после замораживания — оттаивания. Вычисляют процентную долю разности светорассеяния в КС8 и воде.
5 9033
Предлагаемый способ измерения числа жизнеспособных грамотрицательных бактерий после замораживания и оттаивания имеет следующие преимущества: время анализа уменьшается с 8 ч до 10 мин; для осуществления предлагаемого метода необходим лишь один реактив - KC5, а не сложная дорогостоящая питательная среда; предлагаемый метод включает две 10 простых операции - суспедирование образца в оптической кювете и регистрацию светорассеяния на флуориметре.
Формула изобретения
Способ оценки жизнеспособности . грамотрицательных бактерий, предусматривающий приготовление бактери- Zp альной суспензии и ее замораживание, 82 6 отличающийся тем, что, с целью сокращения времени анализа, а также упрощения и удешевления способа, перед замораживанием и после него измеряют светорассеяние;бактериальной суспензии сначала в 300 мМ растворе КС6, а затем в дистиллированной воде, после чего определяют разность светорассеяния, а по соотношению разностей светорассеяния после и до замораживания судят о жизнеспособности бактерий.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
l. Фихман Микробиологическая рефрактометрия. М., "Медицина"., 1967., с. 19)-240.
2. Postgate 1.R., Huuter 1.R.
On the survival of годеп bacteria.
Geu. И1сгоЬ1о1. ч. 26. 1961, р. 367-378. составитель В. Голимбет
Редактор M. Циткина Техред И. Гайду Корректор А.. Ференц
Заказ 33/6 Тираж 504 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений н открытий
113035 Москва, Ж-35 Раушская наб.> д. 4/5
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4
