Способ дифференциации культур васillus тнuringiеnsis
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Союз Советскик
Соцналистнческнк
Ресниублнк (и) 927854 (6I ) Дополнительное к ввт. свид-ау (22)Заявлено 25.01 79 (21) 2718453/30-15 с присоединением заявки М (23) Приоритет(5t}Nl- Кл.
С 12 и 1/00
1Ьеуаарстаееы5 конатет
CCCP ао аоаеи аэебрвтеннй и отарытвЯ (53) УДК 578.6. . 078(088. 8) Опубликовано 15 ° 05 82. Бюллетень М 18
Дата опубликования описания 15. 05 ° 82 (72) Авторы изобретения
Л.А.Чил-Акопян и С.Ç.Чарчян (71) Заявитель (54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ КУЛЬТУР
ВАСI LLUS THURINGIENS I S
Изобретение относится к микробиологии, а именно к изучению энтомопатогенных бактерий, используемых в про изводстве бактериальных инсектицидных препаратов. Оно может быть использовано как в научно-исследовательских целях при селекции высокопродуктивных штаммов Baci11оэ thuringiens s, так и в практической работе, при производстве инсектицидных препаратов из культур этого вида.
Культуоальные признаки бактерий
Baci.1lus thuringiens s при выращивании их на различных питательных средах весьма ограничены и по характеру колоний нельзя отличить клоны, образующие и не образующие кристалловидные токсины.
Имеются данные о дифференциации по морфологическим особенностям колоний 13Однако связи характера колоний с наличием или отсутствием кристаллов в культуре не отмечается.
Известно также выявление кристаллообразования разными способами микроскопического исследования в свето" вом и электронном микроскопах (2 3.
Однако определение известными способами в культурах Вас. йЬог!пд1.
ens s кристаллообразования, и тем более, численного соотношения в ней
I кристаллообразующих и бескристаль о ных клонов затруднено трудоемкостью микроскопических исследований с большой затратой рабочего времени. Последнее ограничивает возможности проведения больших объемов исследований, тре15 бующих учета кристаллообраэования у отдельных колоний, в частности, при массовых анализах на производст: ве.
Цель изобретения - ускорение процесса дифференциации культур Bacillus thuringiensis.
Цель достигается тем, что согласно способу дифференциации культур, Bacillus thuringiens s культивируНтаммы
И ссле до в а но колоний каждо ro штамма
Исследовано штаммов
Окраска колоний
Пигмент
Пигмент +
Кристалл Кристалл
Кристалл Кристалл
837 839 841
844 876 880
889 893 896 12
917. 1096-3
853 1
Розовая
805 8» 2
831 873 875
884 895 905
914 915 918
919
871»13
879 891
887
888
921
924
Смесь колоний розовые и без пиг5
1
1
5
5
8
28
50 мента
102
32
641
828 925
Без пигмента
3 92785 ют на яичножелтковой агариэованной среде, а колонии отбирают по розовому окрашиванию.
Способ заключается в использовании установленной прямой корреляции пигментообразования некоторых разновидностей Вас. thur ing 1åïû s с образованием энтомоцидных кристаллов.
Колонии, образующие кристаллы, дифференцируют от колоний, не образую- 10 щих кристаллы, визуально, по культуральному признаку, а именно: пигменту розового цвета на 103-ной эмуль,сии яичного желтка в физиологическом растворе с 33 агар-агара. Яичный 15 желток из асептически вскрытого яйца добавляют в растопленный и остуженный до 40-50оС стерильный физиологический раствор с агаром. После тщательного перемешивания среду раз- 20 ливают в чашки Петри, на которые рассевают суспензию исследуемой культуры. Инкубация проводится при 28
30 С в течение 2 сут.
Кристаллообразующие колонии диф- l5 ференцируются визуально по их розоJ вому цвету, в отличие от беловатой пигментации колоний, не образующих кристаллов.
Дифференциацию кристаллообразования пигментированных культур осуществляют с обязательной индивидуальной микроскопией каждой колонии.
Установленная между кристаллообразованием и пигментообраэованием корреляция подтверждена при исследовании рассевов пигментообразующих культур Вас.thuringiensis на вышеуказанной питательной среде.
Пример 1. Культуры разновидности caucasicus состоят иэ штаммов, различных по составу пигментных и апигментных клонов. Одни культуры состоят. полностью иэ пигментных клонов, другие - из апигментных, третьи - из их смеси.
Корреляция образования кристалловидных токсинов с пигметообразованием у культур Вас.thuringiens s ч
cancasi cus приведена в табл. 1.
Таблица 1
Таблица 2
Исследовано колоний каждого штамма
Исследовано штаммов
Штаммы
Окраска колоний
ПигментПигмент +
Кристалл
Кристалл Кристалл Кристалл
+ +
Розовая 32,43,827,855,862 5
881,90 3, 8 48,854
Без пигмента 695 716
Приведенные в табл. 2 данные свизю детельствуют о том, что среди куль.тур серотипа "А" имеются штаммы, полностью пигментированные или совершенно без пигмента. Смешанных пигментных и апигментных культур среди имеющихся не оказалось. Имеет место полная корреляция пигментации и образования кристаллов.
Пример 3. Исходная культура
Вас.thuringiens s v. caucasicus 92" ао характери зует ся 10 -ным крист аллообразованием. При рассеве она состоит из 54 розовых и 951 апигментных клонов. После двух последовательных рассевов и выделений изолируют два кло45 на - апигментный и пигментный. Первый характеризуется отсутствием кристаллов, а второй - 504-ным образованием кристаллов.
Определение кристаллообразования
50 по пигментации колоний, вместо микроскопии, значительно упрощает работы с пигментообразующими культурами Вас. thuring 1ens s. Визуальная оценка кристаллообраэования выполняется ориентировочно в 10-50 раз быст-. рее, чем микроскопически. формула изобретения
Способ дифференциации культур
В aci 1 I us thur ing i ens s, включающий культивирование последней на твердой питательной среде и отбор выросших колоний, отличающийся тем, что, с целью ускорения процесса дифференциации, Baci 11us thur ing ien" в1s культивируют на яичножелтковой агаризованной среде, а колонии отбирают по розовому окрашиванию.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
Гу касян А. Б. и др. Биоло гия и культивирование микроорганизмов.
Красноярск, 1969, с.83.
2. Норрис Дж. Микроорганизмы в борьбе с вредными насекомыми и клещами. М., "Колос", 1976, с. 100-142 (прототип).
ВНИИПИ Заказ 3170/36 Тираж 505 Подписное
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4
5 927854 6
Как видно из табл. 1 данные мик- антигену. Это устраняет предпаложероаналиэа выявляют связь образова- ние о воэможности наличия в культуре ния кристаллов с пигментообразованием. посторонних Вас.cereus.
Ф
Серологические исследования по казывают, что выделение из культур s Пример 2. Коррекляция обракристаллофоров разновидности саи- зования кристалловидных токсинов с
caslcUs штаммы апигментных некрис- пигментообраэованием у культур серо. таллофоров (24 штамма) оказывают- пита "А" Вас.thuringiensls., привеся гомологичными caucasicus по Н- дена в табл. 2.
