Способ получения 11 @ -оксистероидов

 

Союз Советских

Соцяалмстмчесюа

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К flkf%HTY (61)дополннтельныя к патенту (И) Занвлено 11 ° 07.80 (21) 2948392/23-04 (23) Приоритет - (32) ()940650 (51) М. Кл.

С 07 J 5/00

//А 61 K 31/57

1ееуаереовныб квинтет

СССР ав лелем езобретеннй к открытей (31) (331

Опубликовано 30.06. 8233юллетень № 24

Дата опубликовании описания; 30.06..82-(53) УДК 547.689.

° 6.07 (088.8) Иностранцы

Карл Петцольдт, Клаус Аннен и „. Хенри Лаурент (ФРГ) j

Иностранная фирма

"Шеринг АГ" (ФРГ) (72) Авторь изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ l lg-ОКСИСТЕРОИДОВ

О где - простая или двойная связ ь1

Х - водород, метил; Г - метилен, этилен, являющихся ценными лекарственными веществами.

Известен способ получения 111э -гидроксилированных 17aL-гидроксистероидов прегнанового ряда путем ферментативного гидроксилирования предварительно этерифицированных в 17 oLположении 11-дезоксистероидов пре"" гнанового ряда, после чего полученные 11Р -гидрокси- 174-ацилоксистероиды омыляют fl). и

Нг- О 1г

О

----О Зг

1

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения

11ф -оксистероидов общей формулы

p,îí

1=0

---- ОК

Недостатками способа является многостадийность и необходимость проведения гидролиза 11(3 -гидрокси-17cL-ацилоксистероидов, при котором образуется большое количество побочных продуктов, с чем связана необходимость дорогостоящей очистки конечных, продуктов.

Цель изобретения - упрощение процесса.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения 11/Ъ -оксистероидов сбщей формулы (1 ) путем ферментативного гидроксилирования

11-дезоксистероидов с помощью куль" туры species Curvularia Lunata ферментативному гидроксилированию подвергают 11-дезоксистероид общей формулы

3 9406 где :,Х и Г имеют указанные зна- чения;

Я вЂ” С - С,1. алкил1

R - С1-С алкил, с последующим выделением целевых 5 продуктов.

Предлагаемый способ обеспечивает проведение процесса в одну стадию, вместо трех по известному способу, что упрощает гроцесс. Кроме того, способ обеспечивает возможность получения 11-гидрокси- Л1,4-стероидов общей формулы (1 ) с высоким выходом.

Следует также отметить, что для осуществления предлагаемого способа необязательно в качестве исходных соединений применять чистые продукты

11-дезоксистероиды общей формулы (II), если их, например, получают как сырой продукт по следующему методу.

Из раствора 1 г (4 ммоль ) тозилата пиридиния и 10 г (28 ммоль) 17, 21-дигидроксистероида в 80 мл диметилформамида и 700 мл бензола для удаления следов воды при температуре бани 110-130 С (глицериновая баня) отгоняют 300 мл бензола при применении водоотделителя. Затем в течение непродолжительного времени охлаждают, добавляют 24 мл (110- 140 ммоль) триалкилового эфира ортокарбоновой кислоты и 1,5 ч отгоняют остаточный бензол. После добавления 5,2 г пиридина реакционный продукт в высоком вакууме концентрируют далее до сухого остатка.

Реакция протекает количественно.

Остающийся после концентрирования

17 oL, 21-(1-алкокси-алкилидендиокси)-стероид имеет сначала масляную консистенцию, однако чаще быстро крисЩ таллизуется. Степень чистоты для последующего микробиологического гидроксилирования является совершенно достаточной, если прилипшие к кристаллизату остатки применяемых реактивов не мешают ферментативному катализу. Аналогично получают D -гомостероиды общей формулы (II).

Пример 1. а . 8 г тозилата пиридиния и 80 г 17, 21-дигидрокси-4-прегнен-3,20-диона в 560 мл диметилформамида растворяют и разбавляют с 3,5 л бензола. После этого отгоняют 1,5 л бензола при температуре бани 120 С через водоото делитель. 8 горячий реакционный раствор медленно приливают 192 мл триэтилового эфира орта-уксусной кисr0 4 лоты и затем 1 ч отгоняют бензол и другие легколетучие реакционные компоненты, добавляют 96 мл пиридина и при температуре бани 60 С в глубоком вакууме сгущают полностью до сухого остатка в течение 2 ч. Получающийся сначала масляный остаток быстро кристаллизуется.

Получают 113 г 17d. -21-(1-этокси-этилидендиокси)-4-прегнен-3,20-диона в форме желтых кристаллов с т.пл. 89-90 С, б). 2-литровая колба Эрленмейера, которая содержит 500 мл стерилизованного 30 мин при 120 С в автоклаве питательный раствор из .34 глюкозы, . : corn steep 1, NaNO 0,2, К Н Р040,1; К НРО О,?; MgS047Н О

0,05, FeSO< 7Н О 0,002 и КСI 0,05, засевают лиофильной культурой CulvuIàãià Lunata NRRL (2380) и 60 ч при 30 С передвигают в ротационном о встряхивателе. Эта культура выращивания (250 мл) служит для прививки

20-литрового ферментатора, который загружен с 15 л стерилизованной при

121оC и 1,1 ати питательной среды, состоящей из 2i глюкозы и 21 corn

steep.

Далее при добавлении силикона SH

s качестве антивспенивателя при 29 С и 0,7 ати при аэрировании (10 л/мин) и перемешивании смесь герметизируют 24 ч. Затем 1,5 л этой культуры при стерильных условиях отбирают и ею заполняют 20-литровый основной ферментатор, который содержит 14 мл ранее стерилизованной питательной среды из 3i Corn steep и 0,7i глюкозы, при рН 6,5.

После Фазы выроста (12 ч) при условиях предварительной ферментации при стерильных условиях добавляют

7,5 г сырого 17с, 2 1-(l-этокси-этилдендиокси)-4-прегнен-3,20-диона, содержащего 6,43 г чистого. вещества, растворенного в 100 мл диметилформамида, перемешивают и аэрируют. Ход ферментации контролируют путем отбора проб, которые анализируют с помощью тонкослойной хроматографии после экстрагирования метилизобутилкетоном. Через 38 ч контакта превращение субстрата заканчивают.

Содержимое ферментатора фильтруют, фильтрат культуры, как и отфильтрованный остаток, экстрагируют,метилизобутилкетоном, экстракты объединяют и концентрируют во вращающемся ис5 9406 парителе, затем при 50 С бани в вакууме сгущают в ротационном испарителе до сухого остатка. Остаток растворяют в теплом метаноле, отфильтровывают от остающегося нерастворимого силиконового масла и опять упаривают до сухого остатка. Остающийся остаток (9,4 г) растворяют в 40 мл этилового эфира уксусной кислоты при нагревании сначала при комнатной 1О температуре, затем кристаллизуют при глубоком охлаждении, Выкристаллизовавшийся продукт отсасывают, промывают небольшим количеством уксусного эфира и сушат 5 ч при 60 С в вакуум- 15 ном сушильном шкафу. Получают 4,18 r гидрокортизона (11 5, 17с, 2 1-тригидрокси-4-прегнен-3,2«-дион) с т.пл. 212-214 С. Маточник кристало лизата нагревают с активированным рО углем, фильтруют и концентрируют до обьема 15 мл, При охлаждении и стоянии в течение ночи при комнатной температуре выкристаллизовывают дальнейшие 0,7 r гидрокортизона с т.пл. 208-25

«оС

Общий выход 87,13 от теоретического.

Пример 2. а). 7 г тозилата пиридиния и 70 г 17с, 21-дигидрок- 30 си-.4-прегнен-3,2«-диона растворяют в 560 мл диметилформамида и разбавляют с 4,9 л бензола. При температуре бани 130 С отгоняют 2,1 л бензола через водоотделитель и после корот35 кого охлаждения добавляют 168 мл триэтилового эфира ортомасляной кислоты. При 13«оС в течение 1,5 ч отгоняют остаточный бензол. Раствор смешивают с 84 мл пиридина и затем упаривают в ротационном испарителе в глубоком вакууме до сухого остатка °

Получают 103,8 r 17 cL, 21-(1-этокси"бутилендиокси)-4-прегнен-3 201 45

-диона в виде масла. б). При условиях примера 1 7,5 r сырого 17 с1,, -21-(1-этоксибутилидендиокси)-4-прегнен-3,2«-диона, который содержит 6,3 г чистого вещества, ферментируют 48 ч с культурой

Curvul ar ià Luna ta. После переработки смеси и кристаллизации освобожденного от силикона остатка экстрагирования из этилового эфира уксусной кислоты в общем получают 4,3 r гидрокортизона с т.пл. 210-213 С.

Пример 3. а) 5,3 г тозилата пиридиния и 53,0 г 17,21-дигидрокси50 6

-бс(-метил-4-прегнен-3,2«-диона растворяют в 370 мл диметилформамида и разбавляют с 2,5 л бензола ° После этого отгоняют при температуре бани 130 С через водоотделитель 1 л бензола. В горячий реакционный раствор медленно добавляют 127 мл этилового эфира ортоуксусной кислоты и затем отгоняют 1 ч бензол и другие легколетучие компоненты реакции.

Теперь добавляют 63 мл пиридина и сгущают при температуре бани 6«СС в глубоком вакууме 2 ч полностью до сухого остатка. Остаются 66,8 r масляного 17d. 21-(1-этокси-этилидендиокси)-Ы-метил-4-прегнен-3,2«-диона.

Пробу масляного остатка интенсивно перемешивают с дистиллированной водой, причем масло медленно переходит в кристаллическое состояние.

Т.пл. 75/92-95ОС. б). При условиях примера 1 в течение 51 ч с культурой Curvularia

Lunata ферментируют 6 г сырого 174., 21-(1-этокси-этилидендиокси)-бс .-метил-4-прегнен-3,20-диона, который содержит 4,8 г чистого вещества.

После переработки смеси и кристаллизации остатка экстракции из диизопропилового эфира получают 3,4 r

6d-.ìåòèë-гидрокортизона с т.пл. 217219 С.

Пример 4. а). 4 г тозилата пиридиния и 40 г 17aL 21-дигидрокси-1,4-прегнадиен-3,20-диона растворяют в 280 мл диметилформамида и смешивают с 2 л бензола. После этого при температуре Гани 12« С через водоотделитель отгоняют 600 мл бензола

В горячий реакционный раствор медленно приливают 96 мл триэтилового эфира ортоуксусной кислоты и после этого отгоняют остаточный бензол и другие легколетучие компоненты реакции. Теперь добавляют 48 мл пиридина и при температуре бани 6«о в течение 2 ч полностью до сухого остатка отгоняют в высоком вакууме.

Получают 58 г !jd 21-(2-этокси-этилидендиокси)-1,4-прегнадиен-3,2«-диона в виде желтого кристаллизата.

Пробу кристаллизуют после обработки активированным углем из эфира с li ацетона и получают чистый продукт с т .пл. 153- 154 С. б) 2-литровая колба Эрленмейера, которая содержит 500 мл стерилизованного в течение 30 мин при 120оС

9406 в автоклаве питательного раствора на 3 глюкозы, o Corn steep 1;

NaNOg 0,2; KHgPO 0,1; Н2НРО 0,2;

Мц50д7Н О 0,05; FeSO+. 7Н О 0,002. и КС1 0,05 прививают с лиофильной культурой Curvularia Lunata (МВЮ

2380) и 60 ч при 30ОС встряхивают на ротационном встряхивателе. Эта выращенная культура служит для прививки 20-литрового форферментатора, ie который загружен с 15 л стерилизованной при 121ОС и 1,1 ати питательной среды, состоящей из 2i глюкозы и 24 Corn steep при рН 6,5. При добавлении силикона SH в качестве ан- д тивспенивателя герметизируют при

29оС и 0,7 ати при аэрировании воздухом (10 л/мин) и перемешивании (220 об/мин) 24 ч. Затем при сте" рильных условиях отнимают 1,5 л этой культуры при стерильных условиях и с ними прививают в 20-литровый основной ферментатор, который заполнен 14 л стерилизованной, как указано выше, питательной среды из

3i Corn steep и 0,74 глюкозы, при рН 5,5.

После фазы роста (12 ч) при условиях ферментации в стерильных условиях добавляют 7,5 г ljd, 21-(1-этокси-этилидендиокси)-1,4-прегнадиен-3,20-диона, растворенного в

100 мл диметилформамида, перемешивают и аэрируют дальше. Ход Ферментации контролируют с помощью взятия зз проб, которые экстрагируют с метилизобутилкетоном и анализируют с помощью тонкослойной хроматографии.

Через 36 ч контакта заканчивается превращение субстрата. Содержание

40 ферментатора фильтруют, фильтрат культуры, так же, как и отфильтрованный остаток, экстрагируют метилизобутилкетоном, экстракторы объединяют и концентрируют сначала в ротационном испарителе, затем при 50оС бани в вакууме в ротационном испарителе и затем при 50îC бани в вакууме в ротационном испарителе до 100 мл и оставляют кристаллизоваться при комнатной температуре.

Продукт отсасывают, сушат в вакууме и получают 5,7 г преднизолона с т.пл. 229-231оС.

Пример 5, а). 0,62 r тозилата пиридиния и 6,2 г 2-гомо-вещества

Рейхштейна растворяют в 43,4 мл диметилформамида и разбавляют в 270 мл бензола. Затем при температуре ба50 8 ни 120 С через водоотделитель отгоняют 116 мл бензола. В горячий реакционный раствор медленно добавляют 14,9 мл триметилового эфира ортоуксусной кислоты и затем 1 ч отгоняют бензол и другие легколетучие компоненты реакции. Теперь добавляют

7,5 мл пиридина и сгущают полностью до сухого остатка при температуре бани 60 С в высоком вакууме в 2 ч.

Масляный остаток кристаллизуют из эфира.

Получают 7, 3 r 17 d, 21- (1-метоксиэтилидендиокси-)-D-гомо-4-прегнен-3,20-диона в Форме кристаллов с т.пл. 167-169oÑ. б)" в 2-литровую колбу Эрленмейера, которая содержит 500 мл стерилизованной при 120оС в автоклаве питательной среды из 3>р глюкозы, Corn steep 1; NaNOy 0,02; КНоР0,1 0,24

К НРО 0,>l Hgso< 7Н О 0,05; FesoÄ х7Н О 0,002 и КС1 0,05, прививают лиофильную культуру Curvularia Lunaca (NRRL 2380) и 60 ч при 30 С качают в ротационном встряхивателе.

Выращенная культура (250 мл J служит для прививки 20-литрового фер" ментатора, который загружен 15 л стерилизованной при 12loC и 1,1 ати питательной среды, состоящей из 24 глюкозы и 23 Corn steep при рН 6,5.

При добавлении силикона SH в качестве антивспенивателя смесь герметизируют при 29 С и 0,7 ати при аэрировании (10 л/мин) и перемешивании (220 об/мин) в течение 24 ч. Затем при стерильных условиях отбирают

l,5 л этой культуры и приливают в

20-литровый основный ферментатор, который заполнен 14 л стерилизованной, как указано выше, питательной среды из 34 Corn steep и 0,7i глюкозы при рН 6,5. После фазы роста (12 ч) при условиях ферментации в стерильных условиях добавляют 7,3 г

17, 21-(i-ìåòoêñè-этилидендиокси)-D-гомо-4-прегнен-3,20-диона, растворенного в 100 мл диметилформамида, перемешивают и аэрируют дальше. Ход ферментации контролируют с помощью отбора проб, которые экстрагируют метилизобътилкетоном и анализируют с помощью тонкослойной хроматографии. Через 48 ч контакта превращение субстрата оканчивается.

Содержимое Ферментатора фильтруют, фильтрат культуры, а также отФильтрованный остаток экстрагируют

940650 10

23 Corn steep при рН 6,5. При добавлении силикона SH a качестве антивспенивателя смесь герметизируют при 29 С и 0,7 ати при аэрировании (10 л/мин) и перемешивании(220 об/мин) в течение 24 ч. Затем 1,5 л этой культуры отбирают при стерильных условиях и ею прививают 20-литровый основной ферментатор, который содержит 14 л стерилизованной, как указано выше, питательной среды из

3 Corn steep и 0,74 глюкозы, при рН 5,5.

После фазы выращивания (12 ч) при условиях ферментации в стерильных условиях добавляют 7,5 г 17d, 21-(1-метоксиэтилиденокси)-D-гомо-1,4-прегнадиен-3,20-диона, перемешивают и аэрируют дальше. Ход фер20 ментации контролируют путем отбора проб, которые экстрагируют метилизобутилкетоном и анализируют с помощью тонкослойной хроматографии. После

52 ч контакта превращение субстрата оканчивается. Содержимое ферментатора фильтруют, фильтрат культуры, а также остаток фильтрования экстрагируют метилизобутилкетоном, экстракты объединяют и сначала концентриру30 ют в циркуляционном испарителе, затем сгущают при 50оС температуры бани в вакууме в ротационном испарителе до 100 мл и кристаллизуют при комнатной температуре..Продукт отсасывают и сушат в вакууме. Получают

6,1 г гомо-преднизолона (11Р, 17d., 21- три гидрокси-П- гомо-1, 4-прегнадиен-3,20-дион) с т.пл. 226228 С, 40 формула изобретения

9 метилизобутилкетоном, экстракты объединяют и сначала концентрируют

s циркуляционном испарителе, затем при 50 С бани в вакууме сгущают до сухого остатка в ротационном испарителе. Остаток растворяют в теплом метаноле, отфильтровывают от остающегося нерастворенным силиконового масла и опять упаривают до сухого остатка. Оставшийся остаток хромато графируют через колонну с силикагелем (градиент 4,5 л метиленхлорида на 0,5 л ацетона - 4 л метиленхлорида на 1 л ацетона) и кристаллизуют из ацетона.

Получают 5,7 r 0-гомо-гидрокортизона (11f?>, 17d., 21-тригидрокси-О-гомо-4-прегнен-3,20-диона) с т.пл. 212-215 С (с разложением).

Пример 6. a). 1,5 г тозилата пиридиния и 15 г 17, 21-дигидрокси-В-гомо- 1,4-прегнадиен-3,20-диона растворяют в 120 мл диметилформамида и разбавляют с 800 мл бензола. Затем при температуре бани

120 С через водоотделитель отгоняют 250 мл бензола. В горячий реакционный раствор медленно приливают

40 мл трйметилового эфира ортоуксусной кислоты и затем отгоняют дальнейший бензол и другие легколетучие компоненты реакции. Теперь добавляют 20 мл пиридина и сгущают полностью до сухого остатка при температуре бани 60 С в высоком вакууме

2 ч. Остаются 18,8 г масло-кристаллического сырого продукта. Пробу перекристаллизовывают после обработки с активированным углем из изопропилового эфира и получают чистый

17oL 21-(1-метокси-этилиденокси)-D-гомо-1,4-прегнадиен-3,20-дион с т.пл. 142-144оС. б). в 2-литровую колбу Эрленмейера, которая содержит 500 мл стерилизованного в автоклаве при 1200С питательного раствора из 33 глюкозы, Ф: Corn steep 1; NaNOg 0,2;

KHgPO4 О, 1; KgHPO4 0,2; MgSOq 7Н О

0,05, FeS04.7Н 20 0,002 и КС1 0,05 прививают лиофильную культуру Curvularia Lunata (NRRL 2380) и в течение 60 ч при 300 С взбалтывают на ротационной качалке. Выращенная культура (250 мл) служит для прививки

20-литрового форферментатора, который загружен 15 мл стерилизованной при 121 С и 1,1 ати питательной среды, состоящей из 23 глюкозы и

1. Способ получения 11ф-оксистероидов общей формулы б 20

0- — 0

-- — ОН где — - простая или двойная связь; водород, метил1

VÃ - метилен, этилен, включающий ферментативное гидроксилирование 1 1-дезоксистероидов с помощью культуры species Curvu1aria

11 940650 12

Lunata с последующим выделением це- ния процесса, ферментативному гидлевого продукта, о т л и ч а ю- роксилированию подвергают 11-дезоксишийся тем, что, с целью упроще- стероид общей формулы

ОЗ2

Составитель И.федосеева

Редактор А.Власенко Техред И. Гайду Корректор Г.Решетник

Заказ 7

0 Тираж 3 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 илиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, где — — Х и VÃимеют указанные зна- да чения;

Р„- С1-С4-алкил1

Rq С1-С1-алкил, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент ФРГ 16 18599, кл.12 о 25/05,опублик.1974(прототип).