Способ культивирования каллусной ткани

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

Ф

// —. .

« сФ;

Ф

° Ф

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 11.08.78 (2>) 2655135/30-15 ($1) М.Nfl.3 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет

A 01 Гт 7/00

ГосударствеииыЯ комитет

СССР по делам изобретеиий и открытий

Опубликовано 231182. Бюллетень ¹43

Дата опубликования описания 23.11.82 (53) УДК 578.085..23 (088. 8) * (72) Авторы изобретения

«.ч . й

О.Л.Анисимов, И.В.Александрова и A.Н.Данилина

«д ("

Всесоюзный научно-исследовательский биотехниче кий ", институт (71) Заявитель (54) СПОСОБ .КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КАЛЛУСНОЙ TKAHH

Изобретение касается. общих вопросов ботаники, а именно технологии вы« ращивания пересадочных культур рас- тительных тканей, используемых в качестве продуцентов биологически активных веществ, в различных отраслях проььшленности: парфюмерной, пищевой, медицинской.

Известен способ культивирования каллусной ткани на твердой агаризованной питательной среде, при котором в стерильных условиях в боксе предварительно простерилиэованными инструментами каллусную ткань делят на небольшие участки, в качестве инокулята для посадки отбирают светлые молодые участки f 1).

Известен способ, при котором в качестве инокулята используют молодые активно профилирующие участки ткани Е23.

Известен способ культивирования гомогенных неорганизованно растущих калдусных тканей 37.

При этом способе культивирования в качестве инокулята используют верхнюю и среднюю зоны каллусной ткани.

Нижнюю, контактирующую со средой, часть ткани удаляют.

Йедостатком известных способов является низкий выход биомассы.

Цель изобретения - увеличение выхода биомассы при сохранении стабильности ткани.

Эта цель достигается тем, что согласно способу культивирования каллусной ткани, преимущественно женьшеня, на агариэованной питательной среде, заключающемуся в выращивании ее в закрытой емкости в темноте при температуре 26+1 С и относительной влажности 70 2В, пассировании в несколько емкостей, удалении опробковевших некротизтлрованных и контактирующих со средой выращивания частей ткани и последующем высушивании части ее для приготовления экстракта и пассировании остальной части для дальнейшего культивирования, после удаления опробковевших некротизированных частей ткани для пассирования используют ткань из нижней, примыкающей к среде выращивания, зоны каллуса с процентом делящихся клеток 1,4-1,7 а для высушивания и приготовления экстракта— ткань верхней и средней зоны с процентом делящихся клеток 0,2-0,5 и

0,8-1,2 соответственно.

974971

Макроэлементы

Нитрат аммония

Кальций азотнокислый

Кальций хлористый

Магний сернокислый

Кальций фосфорнокислый одноэамещенный

Микроэлементы

1650

1900

440

370

170

6,2

Борная кислота

Марганец серно- кислый

22,3

65.В основу предлагаемого ст особа положены данные исследования по определению митотической активности и продуктивности различно удаленных от среды зон каллусной ткани.

Было проведено опредеп.-..ие митотического индекса трех зон каллусной ткани (деление на эоны условно B зависимости от удаления от среды выращивания). Индекс определяли по отношению числа делящихся клеток к обще- 10 му числу клеток.

Установлено, что в первую неделю культивирования число делящихся клеток в верхней, средней и нижней зонах эксплантатов практически совпада-15 ет и составляет от 2 до ЗЪ.

Начиная с 6 сут количество делящихся клеток в верхней зоне каллуса падает и остается на низком уровне в течение всего цикла культивирования, достигая к 30 сут 0,20,-5Ъ. Количество делящихся клеток в нижней зоне сохраняется на высоком уровне в течение всего пассажа не менее 1,5Ъ.

Для средней зоны характерно снижение числа делящихся клеток на 510 сут культивирования до 0,5-0,8Ъ, затем количество делящихся клеток возрастает к 16 сут и вновь планомерно снижается к концу пассажа до 0,9-1,2Ъ.

Исследование митотической активности верхней, средней и нижней зон каллуса, рассаженных в отдельные сосуды, показало, что наибольшее число делящихся клеток отмечается в инокуляте, полученном из нижней зоны каллуса. Число делящихся клеток возврастает к 5 сут до 2Ъ и остается на высоком уровне в тече- 40 ние всего пассажа 1,4Ъ. Наименьшее число делящихся клеток характерно для инокулята, полученного из верхней зоны каллуса на 5 сут - 0,9Ъ, к 30 сут — 0,4Ъ. 45

Пример. Для получения в пересадочной культуре гомогенно расту.щей биомассы использовали модифицированную питательную среду состава, мг,/л:

Цинк - нокисл .", Калий иодистый

Натрий молибденовокислый

Хлорид кобальта

Купорос медный

8,6

0,82

0,25

0,025

0,025

Ростовые вещества

Тиамин

Мионозит .

Сахароза

Гидролизат казеина

1-Нафтилуксусная кислота

Кинетин

Агар-агар

0,4

30000

500

6000

Хелат железа

Расчет: вес инокулята в момент пересадки 1 г, вес инокулята через

30 сут культивирования 20 5 r, объем среды 50 мп, отсюда

20,5 50

Х 1000

20 1000 4ОО

Ткань верхней и средней эоны отбирали на сушку, из высушенной ткани приготовляли экстракт.

В таблице приведены данные продуктивности культуры ткани женьшеня

2ЭДТА 37,3

Железо сернокислое закисное 27,8

В тщательно вымытую и высушеннук посуду (250 мл колбы) разливали по

50 мл питательной среды. Колбы укупоривали ватномарлевыми пробками

Сосуды со средой автоклавировали в автоклаве для уничтожения микроорганизмов при 0,7-0,8 атм 15 мин, после чего сосуды вынимали и ставили на ровную поверхность для застывания среды. Бокс стерилизовали бактерицидными лампами. Инструменты стерилизовали в суховоздушном шкафу при

150-200 С, завернутые в бумагу Крафт.

Так же стерилизовали чашки Петри.

В боксе перед началом работы инструменты опускали в спирт и прожигали на спиртовке. Остужали, положив под крышку в стерильную чашку Петри.

В качестве трансплантанта испольэовали каллусную ткань нижней, прилегающей к питательной среде, эоны каллуса с процентом делящихся клеток в момент пересадки 1,3.

Колбы с пересаженной тканью помещали в культуральную комнату в стационарные условия. Цикл культивирования 30 сут. За это время урожай биомассы составил 410 г/л по сырому весу.

974971

Вес исходнсго инокулята, г

Место исследования

Вес каллусной ткани на 30-е сутки, г

Продуктнвност ь, г/л

Верх

Середине

280

320

Ниэ

20,5

410

Контроль

15,7

314

Формула и э обретения

Составитель Г. Брестюк

Техред Т.Маточка Корректор Н.Король

Редактор Н.Разумова

Заказ 8858/2 Тираж 699 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 в зависимости от координации относительно испытательной среды точек

Таким образом, предложенный способ культивирования каллусной ткани позволяет увеличить выход биомассы на агариэованной питательной среде при сохранении стабильности ткани беэ изменения размера первоначального инокулята и компонентов питательной среды.

Ожидаемый экономический эффект составляет 4,94 тыс. руб. на 1 кг сухой биомассы.

Способ культивирования каллусной ткани, преимущественно женьшеня, на агаризованной питательной среде, заключающийся в выращивании ее в закрытой емкости в темноте при температуре 26 1 С и относительной влажности 70+2Ъ, пассирования в несколько емкостей, удалении опробковевших ,некротизированных и контактируюцих со средой выращивания частей ткани и последующем высушивании числа ее для приготовления экстракта и пассисъема исходного инокулята при цикле культивирования 30 сут. ровании остальной части для дальнейшегО культивирования, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью увеличения выхода биомассы при сохранении стабильности ткани, после удаления опробковевших некротиэированных частей ткани для пассирования используют ткань иэ нижней, 5 примыкающей к среде выращивания, эоны каллуса с процентом делящихся клеток 1,4-1,7, а для высушивания и приготовления экстракта — ткань верхней и средней эоны с процентом

Зо делящихся клеток 0,2-0,5 и 0,8-1,2, соответственно.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

З5 1. Цитологическая и морфологическая характеристика разных штаммов в культуре ткани моркови. Канд. дисс.

И., ИФР АН СССР, 1973.

2. Ьа culture des Tissue vegetauk.

40 Paris, 1959, р, 148.

3. Бутенко P.Ã. Культура тканей и фиэиолоГия морфогенвэа растений.

tl., AH СССР, с. 116 (прототип) .