Способ получения оксипроизводных индолил-3-уксусной кислоты

 

О П И:- =С А Н И Е

ИЗЬВРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

<»>99455S

Союз- Советскнк

Социалистически к

Республик

{бт ) Дополнительное к авт. саид-ву (51) М. 9(л. .С 12 P 1/02

С 12 Р 13/GO

{22) Заявлено 14.10.81 {2I ) 3347751/28-.13 с присоединением заявки №

Гевуаарстееи«вй квм«твт

СССР

{23)Приоритет (5>) УДКВ63.18 (088.8) Опубликовано 07.02.83. Бк>ллетемь № 5

Я,ата опубликования описания, 09.02.83 ие делам «эвбрете«ий и вткрытий

Т.Г. Баклашова, К.А. Кощеенко, Н. И. Санцевич, . В.АЯжев ...,.,-;, „.„ и E.À. Чепынева

bc

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов AH CCCP {72) Авторы изобретения

{ 7 l ) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОКСИПРОИЗВОДНЫХ

ИНДОЛИЛ«З-УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение - относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения оксипроизводных индолил-3-уксусной кислоты (ИУК).

5-Оксииндолил-3-уксу"ную кислоту (5-OH-ИУК) использутот в медицине в качестве тест-препарата для диагностики нарушений метаболизма. серотонина при . различных, заболеваниях центральной нерв- . ной системы. Кроме того, 5-ОН-ИУК и .:

4-оксииндолил-3-уксусная кислота (4-ОН

f0

-ИУК) могут быть использованы в ка- честве полупродуктов для синтеза биологически активных соединений,- таких как серотонин, буфотенин, мексамин, пснло-т5 цнн и др.

- Известен способ получения оксипроиз-, водных ИУК путем микробнологичеокой трансформации. В качестве трансформирующей культуры используют грибы

Asper+00us т>н ег . Используемые штаммы позволяют проводить трансформацию толю ко с низкой исходной концентрацией ИУК fig

Недостатками данного способа являют2 ся низкий выход оксипроиэводных (25%) и длительность процесса трансформации (48 ч}.

Известен также способ полученйя-окси

rrpo нзв одных нндолнл-3-уксусной кйслоты, предусматривающий аэробное ныращивание . трансформирук>щей культуры 48ptrqiHus

r> q;er ИБФМ Г-212 r«r питательной среде, содержащей глюкозу в качестве источника углерода. и минеральные соли, отделение мицелия с последующим его использованием для микробиологической трансформации индолил-3-уксусной кисло ты. Выращивание ведут 18-24ч, что соответствует середине логарифмической фазы роста гриба. Полученный мицелий. может быть использован для трансфор- мации один раз, после чего гидроксилирующая активность культуры резко снн жается. В результате трансформации, ко торая проходит за 18-24 ч, образуется

60% 5-окси-ИУК и 40% 4-окси-ИУК (2 .

Недостатком этого способа яв>тяется невысокий выход оксипроизводных ИУК

Э . ЙО4 на единицу биомассы трансфопмирующей культуры, что связано с однократностью использования для трансформации мицелия

: Яврегср Иоь niger ИБФМ F-212.

Цель изобретения - увеличение выхода

5 конечных продуктов. на единицу биомассы трансформирующей культуры.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения оксипроизвод

HbIx H o ë-3-уксусной KHcB0Tb1 пред» усматривающему аэробное выращивание культуры Rsperq;i0Eus Ф ег ИБФМ Г 212 на питательной среде, содержащей глюкозу в качестве источника углерода и минеральные соли, отделение мицелия с последующим его использованием для микробиологической трансформации индолил-3-уксусной кислоты, преддожено выращивание культуры вести до конца первой трети логарифмической фазы роста культуры, при этом в питательную среду вводить 2-4% белково-витаминного концент» рата, а мицелий использовать для микробиологической трансформации многократно. 25

Способ осуществляют следующим образом.

Культуру ЯэрегсрИиь Ф ег ИБФМ

Г-212 выращивают на синтетической среде, содержащей белково-витаминный концентрат, до конца первой трети логарифмической фазы роста культуры; после отделения мицелия от культуральной жидкости и отмывания его стерильной водой ресуспендируют в буферном растворе, добавляют раствор ИУК в этаноле.

Гидроксилирование проходит полностью за 8-12ч, количесгво 5-окси-ИУК в реaKGHo8BoA среде составляет 50-60%, 4-окси-ИУК 40-50% от исходного коли40 чества ИУК. Затем мицелий отмывают и стадию гидроксилирования повторяют многократно, добавляя для каждой трансфор- мапии раствор ИУК в этаноле.

Пример. Культуру АэрегсрИея р с ег ИБФМ F-212 поддерживают на

45 скошенном сусло-агаре. Колбы засевают суспензией спор, полученной смывом спор со скошенного суслс агара стерильной водопроводной водой. Культуру выращивают в колбах емкостью 750 мл с 150 мл среды следующего состава, r/ë: глюкоза

15,0; БВК 3,0; Ре SOD" 7Н О 0,005;.

KCP 0,5; М< БО 0,5; К2НРО, 1,0; (NH ) HPO< 1,0; CACO g 3,0 на качалке

220 об/мин, при 28 С в течение 24ч.

Полученной культурой в объеме 10% засевают инокулятор емкостью 30 л с 20л питательной среды того же состава и вы856 4 ращивают инокулят в течение 24 ч при перемешивании 300 об/мин, расходе воздуха 0,6 об/1 об, температуре 28 C.

Выросшей культурой в объеме 20% засевают ферментер объемом 100л, 70л питательной среды того же состава. Выращивание трансформирующей культуры проводят при 28 С, при перемешивании 500 об/мин (рО - 75%). Через 12ч роста мицелий отделяют от среды, промывают стерильной водопроводной водой и ресуспендируют в 70 л стерильного

1/15 М фосфатногр буфера рН 5,5 (из расчета 30 г влажного мицелия на 1 л буфера). Для трансформации вносят рао твор ИУК в этаноле (35г в 250 мл эта» иола) из расчета 0,5 г/л. Процесс проводят при 28 С и перемешивании 500 об/мин.

Гидроксилирование полностью проходит за

10ч, по окончании трансформации количество 5-ОН-ИУК составляет 57%; 4-ОН-ИУК 43% от исходного количества ИУК.

Мипелнй после трансформации отмывают стерильной водой и вновь используют для трансформации индолил-3-уксусной кислоты (из расчета 0,5 г/л). Гицроксили рование полностью проходит за 12 ч, количество 5ОН-ИУК составляет 50% и

4-ОН-ИУК 50 /о.

Мицелий после проведения второй трансформации отмывают стерильной водой и используют для проведения третьей транс— формации. Количество 5-OH»ИУК 56% и

4-ОН-ИУК 44% через 15ч трансформации.

После четвертого использования гид»

° роксилирующая активность значительно падае и составляет 20% от первоначалъ ной.

Контроль за ходом трансформации осуществляют методом тонкослойной хроматографии На пластинах ЯQufol UU2<< . На хроматографическую пластинку наносят . полосой культуральную жидкость(из расче. та 20 мкг вещества). Разделение продуктов трансформации проводят в системе; изопропанол-бензол конц. t9Hg (4: 1:.

: 1 об/об). Хроматограммы просматривают в УФ свете. Для количественного определения используют спектрофотометрический метод. Оптическая плотность элюированных этанолом продуктов при

Am q 278 ммк (5-ОН-ИУК) и 269 (4-OH — ÈÓK). Количество ИУК и оксипроизводных определяют по заранее построенным калибровочным кривым.

Таким образом, описанный способ по сравнению с известным позволяет увеличить выход оксипроизводных ИУК на единицу биомассы трансформирующей xym

5 Ы4558 6 туры, так как делает возможным много- первой трети логарифмической фазы роста кратное использование мицелия. При этом культуры, при етом в питательную среду также в два раза сокращается время вводят 2 % белково-витаминного контрансформации. центрата, а мицелий используют для мик робиологической трансформации многоФ о р м у л а и з о б р е т е н и я кратно.

Источники информации, Способ получения оксипроиэводных ин- принятые во внимание цри экспертизе далил-3-уксусной кислоты, предусматри-- l. Дворникова Т. П., Суворов Н. Н., вающий аэробное выращивание культуры 4 Скрябин Г.К. Рндрооксилирование в пятое

Plsperq;i Rue niger ИБФМ 8-212 на пи- . положение иидолил3-уксусной кислоты, тательной среде, содержащей глкжозу, погруженной культурой М реги Имь niger в качостве источника углерода и мине - Микробиология, т. 37, N 1, с. 44; ральные соли, отделение мнцелня с по- - 196Я. следующим его использованием для мик- I 2. Кощееико К.А., Баклашова Г.Г., робиологической трансформации индолил- Козловский А.Г., Аринбасаров М.У., -3-уксусной кислоты, о т л и ч а ю» »Скрябин Г.К. О гндроксилировании йндр шийся тем, что, с целью увеличения лил-3-уксусной кислоты грибом Aperq ttvS выхода конечных продуктов на единицу . niyer ИБ РМ F 12. Прикладная биомассы трансформнрукяпей культуры, 20 биохимия и микробиология, т.13, выи. 2, выращивание культуры ведут до конца с. 248 254, 1977.

Составитель Т. Мелентьева

Редактор М. Дылын Техред С Мигунова Корректор Н. Король

Заказ 565/7 Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская жб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4