Способ получения эргозина

 

О П И С А Н И Е 956560

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистииеских

Республик (89) 1.29801 ГДР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6 } ) Допол интел ьн ый н ав t. с вид-ay (22) Заявлено 1601.78 (2}) 7770077/28-13 (23) Приоритет — (32) 04)32.77 (3}) мРС1-20/197246 (ЗЗ) гдР (5} } Ч, Кл.

С 12 P 1/00

//А 6! К 31/18

Государственный номнтет

СССР ао делан нзобретеннй н отнрытнй

Опублииовано 070 98 2. Б1оллетен ь № 3 3 (53) УДК а678. 044..29(088.8) Дата опубликования описания 070982 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Грегер Детлеф, Шмаудер Хана-Петер, Ене Зигфрид, Майер Валтер и Грге Дитер (гдР) ) .

Иностранное предприятие

"Академи дер Виссеншафтен дер ГДР„" (гдр) (73) Заявитель (54) СПОСОВ ПОДУЧЕНИЯ ЭРГОЗИНА

Изобретение относится к микробиологической проьышлен ности и касается получения зргозина.

Известен способ получения естественных алкалоидов из спорыньи.

Однако этот способ позволяет полу-. чить небольшое количество эргозина.

Кроме того, присутствуют родств.енные пектидные алкалоиды, которые сложно отделять друг от друга.

1О

Цель изобретения — получение эргозина.

Эта цель достигается тем, что способ получения эргозина осуществляют путем культивирования штамма Сlaf5

v i ceps purpure a (Fr) TU l МУТ 168 в аэробных глубинных или поверхностных условиях в жидких питательных средах, содержащих источники углерода, азота и минеральные соли, при 20-30 С и рН 4.,0-6,2 в течение 10-35 дней и выделяют алкалоиды известным путем.

При этом культивирование ведут при 22-25ОС и рН 5,2-5,9.

Новый штамм выделен из диких штаммов (ПУР 13, ПУР 50) вида С l av }ceps purpurea (Pr ) Tu 1 на ржи растущих склеротий, образующих эрготамин.

После двойной мутации этих штаммэв была изолирована линия, которая способна образовывать эргозин. В ходе этих работ стало возможным превратить сапрофитично свободные от алколоидов дикие штаммы в производя-: щие линии и одновременно переключить спектр алколоидов относительно 51 }еГО С1 UfA °

Выделен иый штамм С l . pu r pu re a (Fr) TU1 МУТ 168 зарегистрирован под номером УМЕТ РА (ИМЕТ ПА/134 в центральном исследовательском институте микробиологии и экспериментальной терапии AH ГДР в r. йена) . Штамм образует эргозин и его изомер эргози« нин до 90%. и только 10% легко отделяемого смеси клавина.

Штамм обладает следующими культурально-морфологическими признаками .

На агаровых средах колонии состоят из более или менее сильно разветвленного мицелия, который имеет толщину 4-5 мк, в узлах разветления 7-8 мк. Конидии отсутствуют, но в общепринятых средах, вызывающих образование спор, Мицелий распадается частично на довольно мелкие части.

956560

Капли жира в относительно малом количестве обнаружены только на средах 846 и 829. Мицелий глубинных культур состоит из длинных разаетв— ленных гифов толщиной около 5 мк.

Гифы имеют частично шаровидно округленные утолщения и содержат много капель жира.

Среда M10 — рост очень хороший со складчатой и частично приподнятой поверхностью, коричневая пигментация, обратная сторона с частично темными пятнами, без конидий.

Среда 846 — рост хороший, колонии со скл адчастой и з вили ст ой поверхностью, коричневая обратная сторона светло- коричненая без конидий.

Среда 829 — рост хороший, колонии со светло-коричневой до коричневой пигментацией, со складчатой поверхностью, курчавым и неравномерным краем. Обратная сторона светло-коричневаян.

Среда 784 — рост хороший, -коло нии имеют коричневую верхнюю сторону и бесцветную нижнюю сторону, колонии складчатые, волнистые с неровным краем, без конидий, Культивирование штамма лучше всего идет в жидких питательных средах в поверхностных или глубинных условиях.

Питательные среды содержат источник.углерода, который может быть ассимилирован, как, например, сахароза, глюкоза, маннит, сорбин, глицерин лимонная или янтарная кислота, ассимилируе(ый источник азота, например аммоний, аспарагин, пептон, гидролиз казеина или соль аммония и мине— раль ные соли .

Ферментация может проходить в колбах Фернбаха, Эрлен-Майера, в качалочных колбах или в ферментерах.

Алкалоиды в большинстве (выше 80%) содержатся в питательных средах и их можно получить обычным путем.

Культивирование проводят односту-. пенчато, двухступенчато или трехступенчато. Желательно, если предвари- . тельные культуры 5-12-дневного нозраста и соотношение внесения преднарительных культур к основным культурам равняется 1:5 (до 1:20) . Значение рН может колебаться от 4,0

6,2, а температура от 20-30 С.

Пример 1. Штамм МУТ 168 со скошенного агафа гомогенизируют н 100 мл среды 821 и вносят в качалочные колбы объемом 500 мл. Среда имеет следующий состав:

Сахароза, г 200

Цитрат аммония, г 15

Са (Ио)); г

КНГ04, г 0,25 ° иgь04 . 7Н>О,г 0Ä3

ГеБ О, ° 7Hn0, мг 10

ZnS04 7Н О, мг 30,8

КС1, мг 0,1

Дрожжевой экстракт, r 3, 0

Вода, л До 1 . рН (перед стерилизацией) 5, 8-6,0

Стерилизация 30 мин при 110 С.

Колбы культивируют 7 дней при

24 1 С при 200 об/мин.

10% полученных культур используют для того, чтобы в 500 мл колбы

10 внести 100 мл среды 720 следукщего состава:

Сахарозà, r

Цират.аммония, г

Са(ЙО ),г

15 КН РО4 > г

Н950 ° 7Н„О, г

FeS04 - 7НОО, мг

ZnS 04 7Н,70, мг

КС1, г . Вода, л рН (перед стерилизацией) 5,8-6,0

Стерилизация 30 мин при 110 С.

Колбы инкубируют 7 дней при 24 + 1 С

25 и 200 об/мин.

После .12-21-дневного инкубирования при вышеуказанных условиях культуральная жидкость содержит 180

280 мкг/мл алкалоида с содержанием до 90% смеси эргозина и эргозинина и 10% смеси клави нал калоида. Алкалоиды выделяют известным способом и очищают.

0,25

0,3

30,8

0,1

До 1

Пример 2. 10% описанной

35" в примере 1 исходной культуры переводят в колбы Фернбаха объемом 400 мл со 100. мл среды 720. При 24 «+ 1 С колбы культивируют и после 20 дней культивирования надводный мицелий отделяют от среды. Колбы содержат

250-350 мг общего алкалоида на 1 мл питательной среды, .имеющей такой же состав, как н примере 1.

Определение алкалоидов проводят следующим образом.

После 20-дневной. ферментации поверхностная культура содержит

300 мг/мл смеси алкалоидов. 10 мл подщелачивают и проводят экстракцию хлороформом. Объем экстракта умень50 шают до 5 мл и 2 мл из них отделяют послойным хроматографированием препарата на силикагеле с флюоресцентным индикатором (система. растворителя хлороформ-этанол (8:2) ) .

Алкалоидные пятна снимают, добавляют к смеси вода-метанол-ледяная уксусная кислота (45:45:10) и смешивают потом с реактивом Ван-Урка в соотношении 1:2. Окрашенные в го60 лубой цвет растворы центрифугируют, надосадочную жидкость облучают кнарцевой лампой 5 мин и определяют экстинкцию фотометром. Количество алкалоида определяют из составленных

65 пои одинаковых условиях эталонных

956560

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Редактор Н. Киштулинец Техред Е.Харитончик

Корректор Е.Рошко

Заказ 6519/5 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий.113035, Москва, Ж-35, .Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. УжГород, ул. Проектная, 4 кривых. Смесь алкалоидов этого штамма имеет следунщий состав, %:

Эргозин 65

Эргозинин 25

Клавин ал к алоиды 10

Препаративное получение пептидных алкалоидов осуществляют следующим образом.

2, 5 л питатель ного раствора подщепачивают (РН 9) и экстрагируют хлороформом. Очищенный з кстр акт выпаривают в вакууме. Получают 690 мг сырой смеси алкалоидов.

Этот материала растворяют в небольшом количестве хлороформа и хроматографируют в колонке на силикагеле. Элюирующим раствором служит хлороформ, к которому добавляют повышающеееся количество этанола (до 15%). Образуются две разделенные флюоресцирующим голубым цветом в ультрафиолетовом свете эоны. Быстро перемещающаяся эона дает эргозинин.

После перекристаллизации из метанола получают 150 мл эргозинина (С ОН О N5), т пл. 225 С() =. + 394 (с = 1а

Э хлороформа) .

Масс-спектр высокого разрешения м/е: 547 (М + ), найдено 5472807, Рассчитано 54 7, 2 79 4 для C 3o H 3 06 N5.

Другие выступающие фрагиейты и/е:

280, 267, 224, 221, 210, 167, 154.

Элюат медленно перемещающейся зо.ны содержит 350 мг эргозина (CgO Н3 05N5) . Масс-спектр м/e:

547 (Н+) .

В обоих случаях реакция Келлера и Ван-Урка положительны:и спектр поглощения в ультрафиолетовом свете имеет максимуь1 при А = 312.

При кислом гидролизе образуется лейцин и пролин. При щелочном гидролизе получаются лизергиновая кислота (эргозин) или изолизергиновая кислота (эргозинин) .

Хрэматографические свойства обоих выделенных пептидных . алкалоидов совпадают с аутентичным эргозином или эргозинином.

Превращение алкалоидов друг в друга возможно обычными методами.

Пример 3. Штамм со скошенного агара примера 1 гомогенизируют в 100 мл среды 815 и вносят в кача лочные колбы объемом 500 мл.

Среда имеет следующим состав, r.

Сахароза 300

КН Р 04 0,5 йай03 2,0

Дрожжевой экстракт О, 1

Hg S O4 ° 7Н 0 0,6

К С) 0,.5

FeSO4 7Н 0, мг 10

Вода, л До 1

РН до стерилизации 5,5-5,8

10 Стерилизация 30 мин при 110" С.

После инкубирования при тех же условиях, как в примере 1, 10% исходной культуры переводят в колбу объемом

500 мл с 100 мл среды 833 следукхиего состава, г: .

Сахароза 300

Цитрат аммония 20

Са (NO ) 1

КН РО4 0,25

Hg S04" 7Н О 0,3

FeSO4 . 7Н О, мг 10

ZnS04 7Н qO, мг 30,8

Вода, л До 1

РН до стерилиза25 ции 5,4-5, 7

Стериализация 30 иин при 110 С

После 14-дневного инкубирования колбы содержат 180-200 мг/мл общего алкалоида того же состава, .как. в при30 мере 1.

Предложенный способ позволяет получить эргозин микробиологическим путем, что упрощает технологию производства.

1. Способ получения эргозина, о тли чающийся тем,чтоштамм

40 С1ач ceps purpurea (Fr) Tu1 МУТ 168 культивируют в аэробных глуби нных или поверхностных условиях в жидких питательных средах, содержащих источники углерода, азота и минеральные

4> соли, при 20-30 С и РН 4, 0-6,2 всте чение 10-35 дней и выделяют алкалоиды известным способом.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю шийся тем, что культивирование ведут при 22-25 С и рН 5,2-5,9.

Признано изобретением по результатам экспертизы, осуществленной

Ведомством по изобретательству Германской Демократической респуфлики.