Способ определения целостности клеточных мембран микроорганизмов

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕЛОСТНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН МИКРООРГАНИЗМОВ, включающий обработку суспензии клеток флуорохромом, отмывание окрашенной суспензии клеток от флуорохрома и измерение интенсивности флуоресценции, в максимуме спектра, отличающийс я тем, что, с целью повышения точности , одновременно с флуоресценцией определяют интенсивность светорассеяния , а в качестве флуорохрома используют примулин, причем оценивают целостность мембран по изменению отношения интенсивности флуоресценции к интенсивности светорассеяния.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1010126 эЮС12N t 00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3249309/30-15 (22) 12.02,81 (46) 07.04.83. Бюл. N 13 (72) С.Ф. Савельев и Л.М. Алексин (71) Всесоюзный научно -исследовательский институт особо чистых биопрепаратов (53) 576.8.098(088.8) .(56) l. Kemple 1,, Вау В. - "Cryobio1ogy" 1978, 15 и 5 р 378-381

2. Биомембраны. Структура, функции, методы исследования. Под.ред. М.Е, Бекера и Г.Я. Дубура, Рига, "Зинатнте", 1977, с. 10-15.

3. Руководство к лабораторным занятиям по цитологии. M., МВА, 1974, с. 92. (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕЛОСТНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН МИКРООРГАНИЗМОВ, включающий обработку суспензии клеток флуорохромом, отмывание окрашенной суспензии клеток от флуорохрома и измерение интенсивности флуоресценции. в максимуме спектра, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности, одновременно с флуоресценцией определяют интенсивность светорассеяния, а в качестве флуорохрома используют примулин, причем оценивают целостность мембран по изменению отношения интенсивности флуоресценции к интенсивности светорассеяния.

1010126

Таблиц а 1

Время куль тивирова1 ч 45 мин 2 ч 50 мин 3 ч 50 мин 4 ч 50 мин

50 мин

О ч ния

Р, отн,ед. 0,954-0,03 1,15+0,03 1,05+0,03 0,68+0,,03 0,62+0, 03 0,55+0,03

Таблица 2

Для выявления изменения целостности мембран при стрессе клетки на стационарной фазе роста бактериальной популяции подвергались термошоку.

Результаты измерений приведены в табл. 2.

В табл. 2 приведено изменение степени поврежденности клеточных мембран после термошока °

60 С, 80 С, 10 мин 10 мин

Условия 40 С, l0 мин

Р, .отн. A °

0,5+0„03 8,5+0,5 12,5+0,5

Изобретение относится к области микробиологии.

Известен микробиологический спо- соб оценки клеточных мембран,, заключающийся в том, что микроорганизмы параллельно высеваются íà полный агар и на селективную питательную среду, содержащую дезоксихолат натрия, на которой клетки, имеющие повреждение поверхностных структур, не >О способны к размножению, Через сутки роста определяется процент поврежденных клеток путем подсчета числа колоний на чашках P1 ).

Однако этот способ характеризует" ся длительностью, трудоемкостью и небольшой точностью. Кроме тогцэ„ он не позволяет оценить степень поврежденности поверхностных структур, а выявляет лишь те повреждения, которые губительны для бактерий, растущих на селективной питательной среде с дезоксихолатом натрия.

Известен также биохимический метод определения состояния клеточных мембран, включающий использование сложных препаративных методов (2 ).

Наиболее близким к йредлагаемому является способ люминесцентного спектрального анализа клеток, включающий обработку суспензии клеток флуорохромом, отмывание окрашенной суспензии клеток от флуорохрома и измерение интенсивности флуоресценции в максимуме спектра (3).

Однако данный способ недостаточно точен и не дает четкой количественной характеристики целостности мембран, 1

Целью изобретения является повышение точности °

4О

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения целостности клеточных мембран микроорганизмов, включающему обработку сус. пензий клеток флуорохромом, отмывание окрашенном суспензии клеток от флуорохрома и измерение интенсивности флуоресценции в максимуме спектра, одновременно с флуоресценцией определяют интенсивность светорассеяния, а в качестве флуорохрома используют примулин, причем оценивают целостность мембран по изменению отношения интенсивности флуоресценции к интенсивности светорассеяния, II р и м е р. Измерения целостности мембраны проводились s процессе культивирования Е.со11 И-17. Пробы разводили физиологическим раствором до концентрации 5 10 клеток/мл.

К 5 мл суспензии добавляли 0,1 мл раствора приледпина (С = 5 мг/мл).

Через 10 мин инкубации клетки дважды отмывались центрифугированием при

3500 g в течение 5 мин, затем ресуспензировались в том же количестве физиологического раствора. Интенсивность флуоресценции полученной суспензии окрашенных клеток измерялась при длине волны возбуждения Д =

= 370 нм и длине волны регистрации

460 нм. Измерение проводилось на флуоресцентном спектрофотометре

МРГ-4 (йирма Н1ТАСН1, Япония) . Одновременно на этом же приборе измерялась интенсивность светорассеяния при Р = 500 нм, В табл. 1 приведено изменение целостности клеточных мембран во вреMR культивирования E. coll М 17 (фактор Р ).

3 10101?6 4

Таким образом, преимуществом пред- оценки целостности клеточных мембран лагаемого метода является возможность в нормальном состоянии микроорганизбыстрого получения количественной мов и после стрессовых воздействий.

Составитель A. Макаров

Редактор М. Петрова Техреду О.Неце Корректор M. Шароши

Заказ 2400/13 Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,