Способ определения активированных т-лимфоцитов в крови

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВИРОВАННЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ В КРОВИ, включаюои й их культивирование в питательной среде, введение колхицинаи пригото зление мазков, о f Д и J4 а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности способа, культивирование проводят в течение 52156 ч, а колхицин вводят в крнцентр ии О 5 мкг/мл, после чего пррдолгжайт культивирование в течение 1,5-2 ч, затем -культуру центрифугируют , обрабатывают гипертоническим раствором, затем повторно центрифугируют ц. при до двух ассоциирующих акроцентрических хро ,мосом в лимфои ите определяют. активированные Т-лимфоциты. .

..SU„„A

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦ,ИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБДИН

959 6 01 М 33 48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ. СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Ю ч а.ю к .и и с я тем, что, с целью .. повышения точности способа, культи-: вирование проводят в течение 52, 156. ч, а колхицин вводят в концент-; рации. 0,5 мкг/мл, после чего.продолжают культивирование в течение

1,5-2 ч, затем -культуру центрифу гируют, обрабатывают гипертоническим раствором, затем повторно центрифугируют и при наличии до двух ассоциирующих акроцентрических хро.мосом в лимфоците определяют акти,вированные T-лимфоциты.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21-) 2719980/28-13 (22) 02.02,79 (46):23.06.83. Бюл. Р 23 (72) A.Ê. Фролов и Б.К. Фролов, (53) д 612 ° 07 (088; 8) (56) 1. Колесникова А.Ф. Показатели клеточного иммунитета при острой. дизентерии. 1976, Х - 7,,с. 87«96. .(54) (57} СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ- АКТНВН.- .

КОВАННЫХ т-ЛИИФОЦИтОВ И КРОВИ, . . включающий их культивирование в пи-тательной среде, введение колхицина и приготовление мазков, о т л иt S.:ъ н, 1

3» Р

Ем М .";;:, 1 Г, г

".-, ) 1024839

Изобретение относится к медицине, а именно к иммуннологическим способам исследования и касается выявления в организме активированных лимфоцитов, Известен способ определения активированных Т-лимфоцитов в крови, включающий их куль тивирование. в питательной среде и приготовление мазков t. 1 j.

Однако известный способ не обеспечивает высокой чувствительности и точности.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Цель достигается тем, что при, осуществлении способа активированных Т-лимфоцитов в крови, включающего их культивирование в питательной среде, введение колхицина и приготовление мазков, культивирование проводят в течение 52-56 ч, а колхицин вводят в концентрации

0 5 мкг/мл, после чего продолжают культивирование .в течение 1,5-2 ч., затем культуру центрифугируют, обрабатывают гипертоническим раствором, затем повторно центрифугируют

-и при наличии до двух ассоциирующих акроцентрических хромосом в лимфоците определяют активированные Т-лимфоциты.

Способ осуществляют следующим образом.

Ставят культуру лимфоцитов с добавлением фитогемагглютинина (ФГА).

Для постановки культуры у обсле-. дуеьых людей берут кровь из вены или из пальца в пробирку с гепарином (конечная концентрация гепари. на 20 ед/мл). Кровь смешивают с питательной смесью 1:15. Питательная смесь состоит из среды 199, содержащей 10% человеческой резус-положительной сыворотки группы AB(IV), 100-200 ед/мл антибиотиков и 20 мкг/мл

ФГА. Всю работу по приготовлению культуры проводят стерильно, культуру инкубируют -в термостате в течение 52-56 ч при 37 С, затем в нее добавляют колхицин (конечная концентрация колхицина в среде

0,5 мкг/мл). Инкубацию культуры с колхицином продолжают в течение

1,5-2 ч при том же режиме. В присутствии колхицина в.культуре накапливаются клетки в стадии метафазы.

Так как колхицин разрушает клеточное веретено, последующие стадии митоза не наступают, а в стадии метафаэы хромосомы наиболее доступны для подробного морфологического изучения.

Прекращают инкубацию культуры до 53-60 ч, когда лимфоциты делятся только первый раз, и частота ассоци,аций акроцентрических хромосом в них соответствует таковой до введения их в культуру. После укаэанного срока часть лимфоцитов делится уже второй раэ, и частота ассоциаций акроцентрических хромосом в них будет меньше исходной °

После инкубации культуры с кОлхйцином взвесь клеток культуры цент- . рифугируют в течение 5-10 мин при

800-1000 об/мин, Надосадочную жид": кость удаляют, а клеточный осадок подвергают гипотонической обработке, для чего на него наслаивают .

0,56%-ный раствор хлористого калия, осадок ресуспендируют в растворе и помещают в термостат при 37 С на

5-10 мин. Затем клетки снова центрифугируют при том же режиме, надосадочную жидкость удаляют, а клетки фиксируют смесью метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (соотношение спирта и кислоты 3:1). Фиксацию проводят следующим образом: на клеточный осадок наслаивают охлажденную до 4-8 С фиксирующую смесь, клетки ресуспендируют в ней, и взвесь помещают на 15-20 мин в холодильник (температура 4-8 С), После экспозиции в холодильнике взвесь центрифугируют при описанном выше режиме, надосадочную жидкость удаляют, а фиксацию клеток повторяют при том же режиме еще 2-3 раза.

После последней фиксации осадок клеток ресуспендируют в небольшом количестве фиксирующей смеси (0,40,6 мл), и полученную взвесь наносят на обезжиренные и охлажденные предметные стекла. Полученные препараты высушивают и окрашивают по

40 Романовскому-Гимэа или ацето-орсе ином. Окрашенные препараты иссле,дуют под микроскопом с иммерсией (объектив х 90, окуляр х 10).Изу- . ,чают лимфоциты, находящиеся в ста

45 дии метафазы, в которых подсчитывают количество ассоциаций акроцентрических хромосом (ААХ) За

AAX принимают такое расположение хромосом, когда они ориентированы друг к другу своими короткими плечами, и расстояние между ними не. более половины длинного плеча хро,мосомы D (большого акроцентрика) или не более всего длинного плеча хромосомы d (малого акроцентрика).

У привитых вирусными вакцинами (оспенной, паротитиой) и у больных гриппом в изученной клеточной популяции достоверно возрастало количество лимфоцитов а 0,2-мя акро60 центрическими хромосомами и ассьци-. ации"и соответственно уменьшалось . количество лимфоцитов.с 4-мя и бо-. лее хромосомами в ассоциации. Клет, ки с 3-мя акроцентрическими хромо65 сомами в ассоциации существенных

1024839

Составитель С. Малютина

Редактор В. Иванова Техред j„ Ач Корректор Г. Огар

-Заказ 4386/41 Тираж 873 Подписное

ВНИИПК Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раущская наб., ц. 4/5

Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 личественных изменений не претерпевали. У привитых и у больных в

Ответ на антигенный.раздражитель увеличивалось количество активно пролиферирующих (размножающихая)

Т-лимфоцитов с короткой интерфазой, т.е. количество активированных лим° ° ° фоцитон. К последним можно отнести лимфоциты с 0-2-мя акроцентричее- . кими хромосомами в ассоциации.

Группы обследованных привитых бы.ли представлены детьми 1-2, 5-6 и

8 лет и подростками 15 лет, больные гриппом представлены взрослыми от

22 до 46 лет.

1. Увеличение количества активированных Т-лимфоцитов (содержат 0 2 акроцентрических хромосомы в ассоциации), выявляемых по предлагае.мому способу, имело положительную корреляцию с приростом специфичес«нх антител и количеством антигенчувствительных лимфоцитов у обСле/ цованных, что подтверждает досто» ерность способа. Несмотря на то ! то антитела вырабатываются не Т-, а В-лимфоцитами, между этими вида" ми клеток в роцессе иммуногенеза существует тесная кооперация. Следовательно, лимфоциты, которые проходят первый цикл деления в культуре, стимулированной фитогемагглютинином, и содержит 0-2 акроцентри10 ческие -хромосомы в одной ассоциации, можно считать активированными

T-лимфоцитами, образовавшимися .в организме после серии митозов-под воздействием антигенов.

15 Предлагаемый способ не требует для своей реализации дорогостоящей аппаратуры и дефицитных реактивов, позволяет среди активированных лимфоцитов выявлять только Т-клетки.

2О Прецлагаемый способ более чувствителен, так как позволяет более точно выявлять в организме активи рованные лимфоциты.