Способ определения количества одноцепочечных разрывов в геноме клеток
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСИИХ
РЕСПУБЛИК
З5„ с 12N1Ë6
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
И АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
- -" :ЕС?%9ИАУ
f. c
;i
Л (%1) 2900112/30-1» (22) 26;03.80 (Йб) 15.07.83. Ьол. И 26 (72) С.Д.:Иванов и С.Ф. Савельев (71) Всесоюзный научно-исследователь ский институт особо чистых биопрепара тов (53) 575.113(088.8) (56)1.Asada S. and oth. Appi envi †:
ronment. ИiсгоЬiol 1979, 37, 266, 2.Eastman А.and oth.,Chem.-biol. .interaact1on, 1978, 23, 369.
3.Erixon К.and oth.,Nutation res..
1979, 59, 257..,Я0„„1 28716 A (54) (57) СПОСОЬ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ РАЗРЫВОВ 8 ГЕНОИЕ
КЛЕТОК, включающий лизис клеток, рас-кручивание ДНК раствором едкого натра обработку ДНК ультразвуком, хроматографию полученного продукта на гидроксилапатите, индикацию количества ДНК во фракциях и расчет количества. разрывов в геноме, о т л и ч а ю ц и и " с я тем, что, с целью повышения точности и чувствительности способа, раскручивание ДНК проводят в течение
10-?О мин, после обработки ультразвуком дополнительно проводят окрашива ние ДНК этидийбромидом, а индикацию количества ДНК во фракциях проводят Q с помощью флуориметрии.
1 1028
Изобретение относится к биологии, а именно к области репарации дезокси. риЬонуклеиновых кислот.
Для определения потенциально воз- можных мутаций в организме большое значение имеет анализ целостности re. нома, в частности определение в ДНК клеток количества одноцепочечных разрывов, образовавшихся в результате действия различных внешних Факто- 10 ров.
Известен способ определения од" ноцепочечных разрывов в геноме клеток, включающий седиментационный анализ ( в щелочном градиенте сахароэы, щелочное элюирование ДНК с миллипоровых фильтров и т.д. Г1j и (2).
Недостатком данного способа являются неприменимость для анализа ДНК с неЬольиим количеством повреждений, низкая чувствительность.
Наиболее близким к предлагаемому является спосоЬ определения числа одноцепочечных разрывов в геноме клеток эукариот с помощью щелочного рас- 25 кручивания ДНК и последующей хроматографии на гидроксилапатите. Соглас" но способу клетки млекопитающих лизируют в течение 30 мин в растворе
0,03 í 1аОН, при этом раскручивается в местах разрывов ДНК,,которую затем обрабатывают ультразвуком, и пробы подвергают хроматографии на колонках с гидроксилапатитом при, +60 С, причем ДНК элюируется 0,13 и О,?5 И К-Фосфатными буферами. Коли"
35 чество,jtHK в пробах рассчитывается с. помощью радиоактивной метки. Исходя из полученных результатов определяется фактор двуцепочечности и количество повреждений в ДНК(3).
Недостатком этого метода является непригодность для определения количества разрывов в ДНК .клеток микроорганизмов, имеющих значительно меньшую молекулярную массу генома, чем клет"
45 ки млекопитающих (10 д по сравне" нию с 10 д, соответственно).
42.
Цель изобретения - повышение точ" ности и чувствительности способа.
Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения ко. личества одноцепочечных разрывов в геноме клеток, включающем лизис клеток, раскручивание ДНК раствором едкого натра, обработку ДНК ультразвуком, хроматографию полученного продукта на гидроксилапатите, индикацию количества ДНК. во фракциях q расчет коли-, 716 чества разрывов в геноме,.раскручива-, ние ДНК проводят в течение 10-20 мин, после обработки ультразвуком дополнительно проводят окрашивание ДНК этидийЬромидом, а индикацию количества ДНК во фракциях проводят с помощью флуориметрии. . Пример 1. Фактор двуцепочечности ДНК вычисляют по формуле:
CA@
pL>, 0U, где С - концентрация двуцепочечной
ДНК во Фракции мкг/мл;
С. — одноцепочечной ДНК во фрак оц ции мкг/мл.
После стрессовых воздействий на клетки количество одноцепочечных раз. рывов (и ) на единицу ДНК, раскручиваемую щелочью, определяют как (3 ) по формуле: @х и= — -Т, 8q, фр где Ф - фактор двуцепочечности ДНК клеток опытной культуры; ф - контрольной культуры.
Определяют величины факторов дву- . цепочечности штаммов микроорганизмов F.. Coll u Serr ° marcescens. Клетки микробов подвергают обработке по методике описанной выше. Полученные результаты приведены в табл. l, где показаны результаты определения чис- . па разрывов в геноме клеток.
J1 р и м e p . 2. Для оценки величины повреждающего воздействия на микроорганизмы центрифугирования проводят опыты по определению числа одно" цепочечных разрывов ДНК клеток Е.Со11 „ подвергнутых следующим перегрузкам
1500ф 60 мин, при 0-4 С. Кроме того, измеряют репарацию разрывов при после-. дующей инкубации отцентрифугираванных клеток в растворе 0,111 И NaCi npu
125 С. С этой целью образцы культуры клеток E. Coli обрабатывают по методике, приведенной выше, сразу после центрифугирования и через 30 и 60 мин после инкубации. Результаты опытов приведены в табл. 2.
Пример 3, Проводят опыты по определению фактора двуцепочечности и числа одноцепочечных разрывов в ДНК клеток Е. Со11 по методике (3 /.
Полученные результаты приведены в табл. 3.
3 1 028716 Ц
Зри определении числа одноцепочеч- количества одноцепочечных разрывов у ных разрывов получают выражение -микроорганизмов. е>о Предлагаемый способ позволяет с не ннеодее достаточной точностьп определить коВ рознит -ада г I. личество одноцепочечных разрывов в гесмысла, что свидетельствует о непри-,номе микроорганизмов после стрессовых менимости метода (3) для определения воздействий. ь
Таблица 1
Примеры Иикроорганизм
С, мкг/мл оц
С., мкг/мл
0,477
0,770
0,702
Е. С011
0,688
0 505
0,702
0,820
Ор533
0,937
0,565
О 5"7
0,938
0,493
2,165
2,985
Serr. marcesceris 0,316
1,278
2,443
О, 542
0,587
9,532
0,094
6,949
0,723
В ФВ
0,722
2,230
1,230
0,708
0,198
0,182
:0,058 0,133
102S716
I! Сф">
1 I ((! . б
I !
l (0
r
I t
О о I!
С (! (D 1
=3 !
X I I !
l (O t
Ф 3
1- ) 1
1) Ф
I х
У(X
X ((3 о!
> е.!!. а
1
) 1 3
) ((О (((1 у
l,(1
1..
I
I ,1
jl
1 ,!
I !
C(0О
-=1 О
LA
00 О
Ю м
«Ф
° Ь
О1
LA
- Ф
° Ъ
l
1 3
< о м
3 «
0О
3««
О 1
О1 л
CO
СО 4 сч . м
Ф CV б
I Ã l
1 1 ! 3 !
I ! е
1 I
I
I I (О
1! D
II ! . .!
1
1
I
1
I М
1
I
1
МЭ
Ю
t ai
C(Ю
LA м и
« .л
Ю Ю О
С4
LA л
СО СО
Ф Ю со
° с °
СЧ Ю О
СЧ
-з.
Ф
С4 м л
t I I .
1 О l
Ю LfII м сГ\
° — СО л
С4
r»
ОЪ О М
Ф л
CV СМ ( (Q
1 (11 х
Ф
С
I. l
I I (Б
I 1
-Ф
М) ° !
С >
Ю!
« м
Ю л
LA
Я„"> м
° Ъ
C( м О1
° 4
° 4м
° \ ° !
Ю Ю
1V
Ю СЧ
lA т»
ФЬ °
Ю Ю
СО Ф
К
0О
LA cu
CV О1
0О
Ю Ю м сл
СО СО
° 4 О л
I
I
l
I
I !
t ! !
I
I
I
1 !
О.
0ь ( л
М
К ((3
X ( о а
IХ о
СЧ
С ) ?
LA . О л л
Ю с (м
С)Ъ
1 (СЪ
Ю ° Ь
Ю Ю м О
r«
Ю 1
I 1
1 1
;=(. 1 о о ! !
tA л
Ю
М О сО
00 СЧ
« л
C Ю
Щ
Ю О л
Ю.
СЧ
3« л
Ю
I I
0О О ас
00 «ф л Ю
Ю Ю сО
Ф О
СС\
° л
С: (!.
1
1
1,л а
Ф
X
1( о с.
1 ! a Il 1
1 ! X l «1 3
1 е. сас(i(!
3 3
1 1 ! ! I
l I 3
I =3 о
1 1 О
I 1 1
l !
I l
3 1 .1 1
1 I х
1 6 1
-4 1
Ю а
I (7l I
CV I
lA I л !
Ю 1
СМ 1
0О 1
Ю I в
СЧ l! (1
t.I
f сО. I
М I
Ю !
СЧ t
° . t
EA I л I
Ю I
C((м 1
СЧ 1 а
СЧ 1
1
I!!
СЧ !
СМ I а 1 е»
) I
I!
I
I
I:
3 !!
I
I
f
1 .
3 !
1
I
I ф
В 1
X !
Cf I
D1 1
CL !
1028716
Таблица 3
С, мкг/мл
А
C, мкг/мл
ОЦ
Примеры Иикроорганизм
Опыты
Контрольная культура
Е. CO1) 0,249
0 503
0 331
После центрифугирования 0 .
К. Со11
1,861
1,610
Составитель А. Иакаров
Редактор Н. Воловик Техрев М.Тепер Корректор 0- Билак
Заказ 4895/24 Тираж 523 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам -иэобретений и открытий
113035 Иосква Ж-Я Раушская наб., . 8 4/
Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4
