Способ выделения лизоцима из молозива

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН,.SU„;,1041934

« .

3(5D 01 М 33 48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ. СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСН0МУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3395786/28-13 исходного сырья с последующим центриг (22) 11,02 ° 82 фугированием, а целевой продукт очи(46) 15.09.83. Бюл.934, .- щают с помощью аффинной хроматогра(72) E.A. Емельяненко и J..Ã.Ñàòþêîâà фии на дезаминированном хитине, о т; (71) Иосковская орден", Трудового ..л и ч а ю шийся тем, что, с цеКрасного Знамени ветеринарная акаде- лью повышения выхода и активности мия им. К.И. Скрябина . целевого продукта с сохранением (53) 616.07(088 ° 8),=антигенной структуры, перед выделе(56) 1. Авторское свидетельство СССР нием целевого продукта к обезжирен-

Р 178771, кл. G 07 G 7/02, 1966. номУ молозивУ добавлиют 0,1-0,2%-:

2. Weawer I.L. Kroder М. Deamina- -ный раствор сычужного фермейта с акted, chitin Affinity cromatography . тивностью 100.000+500. условных едиа Method for Isolation Purification . НИЦ В 1 r сухого вещества в соотand concentration of lysozyme.-J,Food ношении соответственно (3-4)(1-2), Science, 42, 1084(1977). .::.далее инкубируют полученную смесь (54)(57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИЗОЦИМА . в течение 2-3 ч при 36-38 С, а центИЗ МОЛОЗИВА, включающий обезжиривание . рифугирование проводят при 1000-2000д.g

1041934

Изобретение относится к биохимии, а именно к получению ферментных препаратов, и может быть использовано в иммунологии, гинекологии и акушерстве, терапии..

Известен способ выделения лиэсцима с использованием аффинной хроматографии (1 1.

Недостатком этого способа является невозможность сохранения специфической активности фермента в процес- <О ñå обработки исходного сырья.

Наиболее близким к предлагаемому является способ, включающий обезжири. вание исходного сырья, створоживание с последующими центрифугированием и аффинной хроматографией супернатанта (2 1.

Согласно известному. способу к обезжиренному молоку добавляют 7%-ную уксусную кислоту до рН 4,5, центрифугируют, фильтруют, доводят щелочью рН до значения 6,5 и наносят на хроматографическую колонку с дезаминированным хитином. По результатам хроматографии выход фермента со специфической активностью около

25 ,225 ед/мл составляет 95%.

Недостатком известного способа является низкий выход лизоцима, что снижает специфическую активность фермента еще до хроглатографии. Малоактив30ный лизоцим слабо сорбируется на дезаминированном хитине, в результате чего не удается получить нативный ферментный препарат с высокой специфической активностью. 3S

Цель изобретения — повышение выхода и активности целевого продукта с сохранением антигенной структуры.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения лицо- 40 зима из молозива, включающему обеэжиривание исходного сырья с послецующим центрифугированием и очистку целевого продукта аффинной хроматографией на деэаминированном хитине, перед выделением целевого продукта к обезжиренному молозиву добавляют 0,1-0,2%-,ный раствор сычужного фермента с активностью 100.000+500 усл.ед. в 1 r cyхого вещества в соотношении соответственно (3-4 ):(1-2 ); далее инкубируют полученную смесь в течение 2-3 ч при 36-38 С, а центрифугирование проо водят при 1000-2000 д.

Способ осуществляют следующим образом.

К 3-4 частям обезжиренного молозива добавляют 1-2 части 0,1-0,2Ъ-ного раствора сычу><ного фермента с активностью не них<е 100.000 ед. с последуюцими термостатированием при 36-38 С

2-3 ч и центрифугированием 15-20 мин при 2000-3000 об/мин. Далее выделяют лиэоцим на колонке с дезаминированным хитином, для чего сыворотку молозива наносят на колОнку, наполненную 65 деэаминированным хитином крабов с размером частиц 175-250 мк и уравнове» шенную фосфатным буфером рН 8,0.

В этих условиях лизоцим полностью сорбируется из хитина и задерживается в колонке, в то время как примеси вымываются. Затем через колонку пропускают фосфатный буфер рН 8,0, отмывая от оставшихся примесей, лизоцим при этом остается на дезаминированном хитине.. Затем через колонку пропускают 0,1-0,2 N раствор уксусной кислоты, который смывает отмытый от посторонних веществ лиэоцим с хитина. Скорость протекания раствора через колонку — 1 капля/с.

Собранный раствор лизоцима подвергают глубокому заглораживанию.

Пример 1. Берут 120 мл нативного молозива, центрифугируют 15 мин при 2000. об/мин. Верхний слой жира удаляют. К обезжиренному молозиву добавляют 25 мл 0,1%-ного раствора сычужного фермента с активностью

100.000 ед. Смесь помещают в термостат при 36 С на 2 ч. Створоженное

О молозиво центрифугируют 15 мин при

2000 об/мин. Осадок удаляют, а 25 мл надосадочной х<идкости (сыворотка молозива ) с литической активностью лизоцима 155,6 ед/мл пропускают через колонку размером 2х40 ем, наполненную дезаминированным хитином и уравновешенную предварительно фосфатным буфером рН 8,0. После этого колонку промывают тем же фосфатным буфером рН 8,0, контрОлируя отмывку посторонних веществ измерением оптической плотности раствора при длине волны

280 ммк на приборе Сф-16 (спектрофотометр ), a . отсутствие лизоцима в отмывном растворе — по измерению литической активности. фермента. Через .300 мл оптическая плотность выходящего из колонки раствора становится равнои нулю. Затем через колонку пропускают 0,2 N раствор уксусной кислоты, смывая лиэоцим. Контроль за выходом лизоцима ведут так же, как контроль за отмывкой. Выход лизоцима наблюдают после пропускания

50 мл уксусной кислоты через колонку и заканчивают на 65 мл. Скорость протекания растворов в колонке

1 капля/с. Контроль эа полнотой извлечения лизоцима из сыворотки молозива проводят путем измерения литической активности лиэоцима методом диффузии в агар, используя в качестве субстрата суспензию бактериальных клеток М1сгососс s

1iscdеictiсив. Весь лизоцим,содержацийся в исходном сырье, извлекают при промывании колонг<и 0,2 М раствором уксусной кислоты в объеме

15 мл с литической активностью

195,4 ед. акт/мл.

1041934

Составитель A. Яковлев.

Редактор A. Маковская Техред H.Метелева КорРекторА.Дзятко

Заказ 7119/45 Тираж 873 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, )Х-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Пример 2. Берут 120 мл нативного молозива, центрифугируют 20 мин при 3000 об/мин.. Верхний слой жира удаляют. К обезжиренному молозиву добавляют 25 мл 0,2%-ного раствора сычужного фермента с активностью .

100.000 ед. Смесь помещают в термо о стат при 37 С на 2 ч. Створоженное молозиво центрифугируют 20 мин при

3000 об/мин. Осадок удаляют, а 25 мл сыворотки молозива с литической ак- 10 тивностью лиэоцима 138,32 ед. акт/мп пропускают через колонку размером 2х х40 см, наполненную дезаминированным хитином и предварительно уравновешенную фосфатным буфером РН 8,0. После этого колонку промывают тем же буфером, контролируя отмывку посторонних веществ измерением оптической плотности раствора при длине волны 280 ммк на приборе СФ-16, а отсутствие лизоцй- О ма в отмывном растворе — по измерению

20 литической активности фермента. Через

200 мл оптическая плотность выходящего из, колонки Раствора становится равной нУлю. Затем через колонку про" 25 пускают 0,2 M раствор уксусной кислоты, смывая лизоцим. Контроль за вы- . ходом лизоцима ведут так же, как контроль за отмывкой. Выход лизоцима на-. блюдают с 30 мл пропускания уксусной кислоты и заканчивают на 45 мл. Ско-. рость протекания растворов в колонке равна 1 капле в секунду. Контроль эа полнотой извлечения лизоцима из сыворотки проводят путем измерения литической активности лиэоцима мето- З5 дом диффузии в агар. Весь лизоцим, содержащийся в исходном сырье, извлекают при промывании колонки 0,2 М . раствором уксусной кислоты в объеме

15 мл с литической активностью 40

319,9 ед. акт/мл.

Пример 3. Берут 1-20 мл натив- ного молозива, центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин. Верхний слой жира

4 удаляют. К обезжиренному молозиву добавляют 25 мл 0,1%-ного раствора сычу>кного фермента с активностью

100.500 ед. Смесь помещают в термостат при 38 С на 3 ч. Створо>кенное молозиво центрифугируют 15 .мин при

3000 об/мин. Осадок удаляют, а 25 мл надосадочной жидкости с литической активностью лизоцима 432625 ед.акт/мл пропускают через колонку размером

2х4 х40 см, наполненную дезаминирован ным хитином и предварительно уравновешенную фосфатным буфером РН 8,0. После этого колонку промывают тем же буфером, контролируя отмывку посторонних веществ измерением оптической плотности раствора при длине волны 280 ммк на СФ-,16, а отсутствие лизоцима в отмывном растворе — по измерению литической активности фермента. Через

50 мл оптическая плотность выходящего из колонки раствора становится равной нулю. Затем через колонку пропускают 0,1 М раствор уксусной кислоты, смывая лизоцим. Контроль за выходом лиэоцима ведут так же, как контроль эа отмывкой. Выход лизоцима наблюдается с 45 мл пропускания уксусной кислоты и заканчивается на 63 мл.

Скорость протекания растворов в колонке — 1 капля/с. Контроль эа полнотой извлечения лиэоцима иэ сыворотки проводят путем измерения литической активности лизоцима методом диффузии и агар. Весь лизоцим, содержащийся в исходном сырье, извлекают при промывании колонки О," М раствором уксусной кислоты в объеме 18 мл с литической активностью 432,37 ед. акт/мл.

Предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет увеличить удельную активность лиэоцима в 250 раз с сохранение>л его антигенной структуры при 100%-ном от исходного выхода целевого продукта.