Способ определения антиокислительной активности вещества

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВА путем исследования хемилюминесценции модельной системы, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и ускорения способа , раствор исследуемого вещества вводят в 21,3 ММ этанол-буферный . раствор олеиновой кислоты рН 7,5 и добавляют инициатор - ионы двухвалентного железа, после чего регистрируют быструю вспышку хемилюминесценции и по снижению величины ее светосуммы посде добавления исследуемого вещества определяют антиокислительную активность вещества ,i

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕ(НИХ

РЕСПУБЛИК (!9) ((!) э(5!)G 01 N 3 4

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И ABT0PCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3369746/13-28 (22) 25,12.81 (46) 30,09.83. Бюл. 9 36 (72) В.В.Мирончнк, С.Н.Черенкевич и A.Ê.Ãoâîðóí (71) Белорусский научно-исследовательский институт кардиологии .(53) 612.015.32(088.8) (56) 1.Авторское свидетельство СССР (Ф 656614, кл. А 61 В 10/00, 1979.

2.Владимиров IO.A. Арчаков A.È.

Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М,, 1972, с, 246 (прототип) (54) (57 ) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОИ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВА путем исследования хемилюминесценции модельной системы, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения точности и ускорения способа, раствор. исследуемого вещества вводят в 21,3 мМ этанол-буферный . раствор олеиновой кислоты рН 7,5 и добавляют инициатор — ионы двухвалентного желеэа, после чего регистрируют быструю вспышку хемилюминесценции и по снижению величины .ее светосумчы после добавления исследуемого вещества определяют антиокислительную активность вещества. (О

1045127

Изобретение относится к фармако логии, и может быть использовано как н практической фармакологии,так и в научных медицинских и биохимических исследованиях.

Известен способ определения антиокислительной активности веществ путем спектрофотометрического измерения продуктов реакции взаимодействия липидов с субстратом, включающий приготовление реакти- 10 нон, поочередное .приготовление опытных и контрольных проб, их термостатирование и инкубацию, построение калибровочной кривой (lj .

Однако указанный способ не обес- 15 печинает быстроту осуществления, а от сутствие химической стойкости ряда реактивов (этанольные растворы перекиси водорода и иодата калия) существенно снижает точность определения антиокислительной активности.

Известен способ определения анти-. окислительной активности веществ путем исследования хемилюминесценции .модельной системы, включающей митохондрии н изучаемое вещество н присутствии ионов двухвалентного железа f2) .

Известный способ не является достаточно точным и быстрым по выполнению. Неточность способа обусловлена, с одной стороны, трудностью определения истинного значения угла наклона условной прямой начальной стадии медленной нспьхаки хемилюминесценции в сняэи с тем, что зависимость интен- З5 синноcTH хемилюминесценции оТ време, ни не является линейной, а. с другой стороны, нестабильностью используемой модели суспенэии митОхондрий, приготовление. которой связано с Д(} методическими трудностями их выделения. При этом приготовление суспензии митохондрий занимает не менее 40-50 мин,а регистрация медленной вспышки хемилюминесценции в эави-45 симости от концентрации антиоксидантов осуществляется от 30 до 60 мин.

Цель изобретения — повышение точности и ускорение способа измерений антиокислительной активности вещества.

Указанная цель достигается тем, что, согласно способу определения антиокислительной активности вещества путем исследования хемилюминесценции модельной системы, раствор исследуемого нещества вводят в 21,3 мИ этанол-буферный раствор олеиновой кислоты РН 7.,5 и добавляют инициатор — ионы днухвалентного железа, после чего регистрируют быструю Ю вспышку хемилюминесценции и по сни-. жению величины ее светосуммы после добавления исследуемого вещества определяют антиокислительную активность вещества.

Способ осуществляют следующим образом, Готовят модельную систему с конечной концентрацией олеиноной кислоты

21,3 мМ и РН 7,5. Олеиноную кислоту в количестне 319,3 мМ растноряют н 4 мл этанола и прибавляют 7 мл

20 мМ РаствоРа КН Р04 . Затеи тщательно перемешивают, доводят РН модельнОй системы до 7,5 ° 10 н,раствором КОН. К 0,8 мл Приготовленной модельной системы добавляют 0,2 мл раствора исследуемого- антиоксиданта (н этаноле или фосфатном буфере) и переносят кювету и. Устанонку для измерения снерхслабых свечений. В данную кювету быстро вводят 1 мл

2 ° 10 " раствора FeSO4 ° 7 Н О и регистрируют на самописце или с помощью интенсиметра н течение 3-5 с быструю вспышку хемилюминесценции.3атем проводят контроль аналогично опыту, только вместо раствора антиоксиданта добавляют 0,2 мл его растнорителя. Определяют снетосум" му быстрой вспышки, вычисляют процент снижения ее по сравнению с контролем и данные заносят н протокол исследования. Измерение хемилюминесценции проводят с помощью установок для измерения сверхслабых снетовых пото ков, работающих в режиме счета фотонов.

Расчет. При комнатной температуре в течение 5 с регистрируют быструю вспышку хемилюминесценции при добавлении инициатора — ионов днухналентного железа — в кювету с модельной системой, содержащей исследуемый антиоксидант., и Производят измерение ее интенсивности (число импульсов No), затем измеряют интенсивность хемилюминесценции в контроле (число импульсов NI„ ) ° Если, например, N>=5000,-à N< =7500, то величину антиокислительной активности (A0A) определяют по формуле

"о 1 (50001

АОА 4 — (00, (00, 4

Ик1 ZSO01

Если шумовой фон хемилюминесцен тной установки относительно высок, то с целью повышения точности измерения AOA веществ проводят учет вклада шумовых импульсон фотоумножителя в измеряемую величину ° Если для хемилюминесцентной установки за 5 с зарегистрировано число шумовых импульсов Кю-300, то AOA вычисляется по формуле

Ъ

Н, - й„<000-Чао

МОД )- (001о= 4 ) (00 /О =34,870

"к- Ng 7500-300

10451 27

Пример . Проведено определе ние антиокислительной активности ряда антиоксидантов. Липидорастворимый антиоксидан — 4 -токоферол— растворяют в этанояе перед введением в модельную систему, а водораст" воримые антиоксиданты - аскорбиновая кислота, никотиновая кислота н НАДФ в фосфатном буфере.

Антиокислительная активность некоторых антиоксидантов, определяемая предлагаемым способом,прн убывании их

5 концентрации в модельной системе представлена в таблице.

Антиоксиданты

Антиокислительная активность антиоксидантов при конечной концентрации, r

1-10.5 5 10 Ь 1 0-6 5 10 7

90„5 48,6 20,6

79,1 60,0 33,3 24,3

9, 8,2

13,6

15,2 7,4

56,1 24,1

23,4

32,8

98,0

Глютатион

Ход работы по предлагаемому способу занимает 6-8 мин, что дает выигрыш во времени по сравнению с известными способами в 5-.7 раз.

Минимальные концентрации антиокси-30 дантов, определяемые предлагаемым способом, составляют в среднем 5 ° 10 r вещества. Так, для К -токосферола определяемая по предлагаемому спосоСоставитель С. Котелевцев

Редактор A,Âëàñåíêo Техред М. Костик Корректор A,Ïoâõ

Заказ 7543/46 Тираж 873

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

of -Токоферол

Аскорбат

Никотинат бу концентрация 1,2 ° 10 М, а по способу — прототипу 0,5 ° 10 М.

Предлагаемый способ позволяет определить антиокислительную активность не только липидорастворимых но и зодорастворимых антиоксидантов, а также обеспечивает высокую чувствительность, хорошую воспроизводимость., быстр и прост в исполнении.