Водорастворимые производные декстрана для снижения средства внеэритроцитного гемоглобина к кислороду при сохранении кооперативности связывания кислорода и способ их получения

 

1. Водорастворимые производные декстрана общей формулы где п 110-223; п 6-57; R . -KHCF, FO( -ОН 1 -CHjCCOH для снижения сродства внеэритроцитного гемоглобина к кислороду при сохранении кооперативности связывания кислорода. 2. Способ получения водорастворимых производных декстрана обработкой -диальдегиддекстрана аминоалкилпроизвoдны .1И фосфорсодержащих кислот с последующим диализом и лиофильной сушкой целевого продукта, отличающийся тем,, что, с целью С получения производных декстрана для снижения сродства внеэрнтроцитного (Л гемоглобина к кислороду при сохранении кооперативности связывания кислорода , в качестве аминоалкилпроизводных фосфорсодержащих кислот используют 1-аминоэтилиденили 1-амино-2-карбоксизтилиден-1 ,1-дифосфоновую кислоту,, а обработку проводят при рН 8,9-9,1 в течение 1-3 сут при комнатной темиературе при соотношении диальдегиддекстрана и кислоты 1:2-2,5, и полученные соединения.обрабатывают 2-4 ч при рН 6,9-7,1 трехкратным мольным избытком боргидО СО рида натрия при комнатной температуре .

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

„„SU„„1047909 А

3<511 С 08 В 37/02; A 61 IC 31/73

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ!

) Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕПЬСТВУ сн, а 1

СН2

R, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21 ) 3460027/23-05 (22) 29.04.82 (46) 15.10.83. Бюл. Р 38 (72) Г.Н. Кольцова, Г.М. Морозова, В.В. Чупин, Г.A. Серебренникова и Г.Я. Розенберг (71) Центральный ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови и

Московский ордена Трудового Красного Знамени институт тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова ,(53) 547.458.5(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

Р 833985, кл. С 08 В 37/02, 1979 (прототип). (54) ВОДОРАСТВОР1?МЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ

ДЕКСТРАНА ДЛЯ СНИ>(ЕНИЯ СРОДСТВА

ВНЕЭРИТРОЦИТНОГО ГЕМОГЛОБИНА К КИСЛОРОДУ IIP?t СОХРАНЕНИИ КООПЕРАТИВНОС ТИ СВЯЗЫВАН?1Я КИСЛОРОДА И СПОСОБ ИХ

ПОЛУЧЕНИЯ (57 ) 1. Водорастворимые производные декстрана обшей формулы где и = 110-223;

6-57; — 1:".С.=.„P -! .":-; ) — — 1: 0 для снижения сродства внеэритроцитного гемоглобина к кислороду при сохранении кооперативности связывания кислорода.

2. Способ получения водорастворимых производных декстрана обработкой .диальдегиддекстрана аминоалкилпроизводными фосфорсодержащих кислот с последующим диализом и лиофильной сушкой целевого продукта, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью получения производных декстрана для снижения сродства внеэритроцитного гемоглобина к кислороду при сохранении кооперативности связывания кислорода, в качестве аминоалкилпроизводных фосфорсодержащих кислот используют 1-аминоэтилиден- или 1-амино-2-карбоксиэтилиден-1,1-дифосфоновую кислоту, а обработку проводят при pH = 8,9-9,1 в течение 1-3 сут при комнатной температуре при соотно иении диальдегиддекстрана и кислоты

1:2-2,5, и полученные соединения.обрабатывают 2-4 ч при рН 6,9-7,1 трехкратным мольным избытком боргидрида натрия при комнатной температуре.

1047909

Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений декстрана, содержащих аминоаякильные производные фосфорсодержащей кислоты, представляющих собой новую„ группу водорастворимых декстранов, которые мо- 5 гут быть использованы в качестве .регуляторов обратимой оксигенации внеэритроцитарного гемоглобина для снижения сродства гемоглобина к кислороду в растворах, что необходимо для 30 эффективной отдачи кислорода этим уникальным белком, и к способу их получения.

Известны наиболее близкие к предлагаемым водорастворимые аминоалкиль-15 .ные производные декстрана, которые получают обработкой диальдегиддекстрана аминоалкильными производными тиофосфорной кислоты (1 с последующим диализом и лиофильной сушкой 20 целевого продукта. Эти соединения являются регуляторами обратимой оксигенации гемоглобина, но обладают небольшой эффективностью дейстния в отношении снижения сродства гемоглобина к кислороду, так Р ф =

6,5 мм рт.ст., получаюцееся при йрименении известного регулятора обратимой оксигенации гемоглобина — пиридоксаль-5-фосфата, в случае использования известного соединения мОжет быть достигнуто лишь при наличии 30-кратного количества м-экв. фосфатных групп на моль гемоглобина, а это в свою очередь обусловливает необходимость использовать значительные количества декстраноных производных, что нежелательно.

Целью изобретения является получение водорастноримых производных декстрана для снижения сродстна 40 внезритроцитного гемоглобина к кислороду при сохранении кооперативности связывания кислорода.

Указанные свойства производных декстрана определяются новой химической структурой нодорастворимых прОиэводных декстрана следующей общей формулы:

50

55 где m = 110-223 п = 6-57

-нг сн (; О(он) 1; Он;

Н r!t, СН СООП. 60

Получение указайных производных декстрана достигается тем,что согласно сгособу получения нодорастноримых производных декстрана обработкой диальдегиддекстрана аминоалкилпроиз- 65 водными фосфорсодержащих кислот с последующим диализом и лиофильной сушкой целевого продукта, в качестве аминоалкилпроиэводных фосфорсодержащих кислот используют 1-аминоэтилиден- или 1-амино-2-карбоксиэтилиден-1,1-дифосфоновую кислоту, а обработку проводят при рН = 8,9-9,1 в течение 1-3 сут при комнатной температуре при соотношении диальдегиддекстрана и кислоты 1:2-2,5 и полученные соединения обрабатывают 2-.4 ч при рН = 6,9-7,1 трехкратным мольным избытком боргидрида натрия при комнатной температуре.

Диальдегиддекстраны (ДАД) полУчают иэ отечественных клинических декстранов "Реополиглюкин" (средняя молекулярная масса 35000) и "Полиглюкин" (средняя молекулярная масса 60000) при окислении перйодатом натрия и содержит 40 альдегидных групп на 100 ангидроглюкозных единиц (АГЕ) полимера. Количество альдегидных групп в ДАД определяют реакцией с гидроксиламином.

1-Аминоэтилиден-1,1-дифосфоновую кислоту (АЭДФ) и 1-амино-2-карбоксиэтилиден-1,1(дифосфононую кислоту (АКЭДФ) синтезируют из CH 3CN и

СЙСН СООН с применением РВг и Н ЗРО

Строение полученных соединений йод3 3 тверждено данными Тп, элементного анализа на азот и фосфор и Р-ЯМР пл

l спектроскопии: для АЭДФ Т 283285 С..Найдено Р 30,14Ъ. Вычислено P 29,35Ъ. ИК-спектр (ваэелиновое масло): 1250 сгл " (P=O), 1060 сгл " (P-О), 800 см "(Р-С). >""Р-ЯМР-спектр: о = 1 3, 4 м.д. Для АКЭДФ: Т и„22823 0 С (с разложением) . Найдейо

Р 25 40-îo, Вычислено P 26,13Ъ. P-ЯМРспектр: о "= -12,8 м.д. Спектры

31

Р-ЯМР сняты на импульсном фурьеспектрометре "Bruker VP-60" при широкополосной разрядке от протонов.

Внешний стандарт — 85Ъ Н 1 О з

Реакцию ДАД и АЭДФ или АКЭДФ проводят при комнатной температуре (18-25eC) в водно-щелочных растворах (рН 9)> содержащих примерно днухпроцентные растворы исходных веществ и течение 1-3 сут. При увеличении вреглени реакции увеличивается количество присоединенных к декстрану дифосфонатных группировок: так при выдержке в течение 1 сут степень замещения (г) составляет 5-10, а при выдержке н течение 3-х сут = 30, то есть на 100 АГЕ полимера присоединяется 30 дифосфонатных групп. После восстановления боргидридом натрия продукт очищают диализом против воды до отрицательной реакции на нингидрин. После лиофильной сушки очиценных растворов получают декстроноалкил-1,1-дифосфоновые кислоты, анализируют на азот и фосфор. Дан1047909 ные элементного анализа и расчета коэффициентов m и п для синтезированных соединений представлены в табл. 1. Коэффициенты в и и округлены при расчете до целых чисел.

В результате получают 1-декстраноами- 5 ноэтилиден-1,1-дифосфоновые кислоты (ДАЭДФ, ДАЭЦФ -I ЛАЭ4Ф-II) и 1-декстраноамино-2-карбоксиэтилиден-1,1. -лмфосфоновые кислоты (ДАКЭДФ-1, ДАКЭДФ-11) содержащие 5 — 30 дифосфонатных групп на 100 АГЕ полимера или 0,3 1 5 м-экв. дифосфонатных групп (ДФ) на 1 г полимера.

Пример 1. К 5%-ному водному раствору полиглюкина (16 г,декстрана з 320 мл воды) в течение 15 мин при энергичном перемешивании прибавляют водный раствор перйодата натрия (7 „98 r NaJO+a 300 мл воды) и

12,8 мл 1 н.NaOH так, чтобы рН смеси составляло 7,1. Затем реакционную массу диализувт через целлофан против воды в течение 4 сут. Окончание диализа контролируют реакцией на ионы JO3. После лиофильной сушки получают 14,6 г (91%) диальдегиддекстрана, содержащего 40 альдегидных групп на 100 ангидроглюкозных единиц полимера (у= 40). Определение коли- 3() чества альдегидных групп осуществляют реакцией с гидроксиламином.

1". 2%-ному водному. раствору диальдегиддекстрана (5 r ДАД в 250 мл воды) прибавляют 11%-ный водный раствор АЭДФ, имеющий рН 8,5 (6,4 г

АЭДФ в 10 мл воды и 40 мл 1н.NaOH) и затем в течение 15 мин еще 1 мл

1н.NaOH при энергичном перемешива- 40 нии так, чтобы рН смеси составляло

9,0. Реакционную массу перемешивают в течение 64 ч при рН 9,0 и 20 С,, а затем добавляют 2,36 г NaBH и

40 мл 1н.HCl так, чтобы рН смеси составляло 7,0. Раствор выдерживают еще 1 ч и диализуют в режиме ультрафильтрации (2 атм И2, 8 С, фильтр

PSAC фирмы "t4illipore") в течение

5 сут. После лиофильной сушки полУчают 6,14 r ДАЭДФ в виде аморфного порошка.,При элементном анализе найдено 9,9% Р и 2,24% N, что соответствует 30 дифосфонатным группам на

100% АГЕ полимера.

Пример 2. 70 мг ДАЭДФ растворяют в 1,5 мл воды, нейтрализуют щелочью до рН 7,6-7,8 и прибавляют 5 мл 20%-ного водного раствора внеэритроцитарного гемоглобина (В-НЬ) рН смеси составляет 7,4. Полученный 60

15%-ный раствор В-Hb разбавляют в

100 раз 0,1h1 трис-буфером, содержа-" щим 0,1 И О и имеющим рН 7,35, и измеряют поглощения деокси- и окси формы Hb его 0,15%-ном растворе на спектрофотометре "Перкин-Эльмер" модель 402 (1 1веция). Раствор содержит 70 мг ДАЭДФ на 1 r В-НЬ. После вычислений получают е. Р = 0 70

-so (РΠ— ь,01), и — 3,0 при рн

7,35.

Пример 3. Получают ДАЭДФ-I и ДАЭДФ-11 как в примере 1, но реакционную массу перемешивают при рН = 9,0 при 18-25 С в течение 24 ч.

Пример 4. Голучение

ДАКЭДФ вЂ” I.

Получение диальдегидцекстрана из,полиглюкина осуществляют аналогично описанному в примере 1. 1: 70 мл водного раствора диальдегиддекстрана, содержащего 2 г ДАД,, прибавляют 20 мл водного раствора АКЭдф, содержащего

4 r АКЭДФ и имеющего рН 8,5 и 1,7мл

2М NaGH для получения в реакционной смеси рН 9. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2-х сут. К полученному раствору добавляют порциями в течение 4-х ч 1,5 г

NaBH< 31 1h, HCl так, чтобы в растворе было рН 7. Очистку и выделение осуществляют подобно примеру 1.

При элементном анализе найдено

0,83% и Р 3,69%, что соответствует

11 дифосфонатным группам на 100 АГЕ полимера.

Пример 5. Получение

ДЭАКЭДФ-II.

Получение диальдегиддекстрана из реополиглюкина осуществляют аналогично описанному в примере 1.Синтез

ДАКЭДФ-II осуществляют аналогично синтезу ДАКЭДФ-I, описанному в при- . мере 4, но смесь перемешивают при комнатной температуре в течение

1 сут. Очистку и выделение полимера проводят так же, как в примере 1. При элементном анализе найдено 11 0,42% и Р 1,87%, чтс соОтветствует 5 дифосфонатным группам на 100 АГЕ полимера.

В табл. 2 представлены сравнительные данные по эффективности действия в качестве регуляторов обратимой оксигенации В-Hb декстрановых производных содержащих тиофосфорную кислоту (прототип) и новые дифосфонатные производные декстрана.

Нз табл. 2 видно, что изобретение обеспечивает 3-х кратное увеличение эффективности действия регулятора обратимой. оксигенации гемоглобина.

Табл. 3 представлены функциональные характеристики внеэритроцитарного гемоглобина в растворах, содержащих дифосфонатные производные декстрана, в сравнении с прототипом.

1047909

Т а б л и ц а 1

Средняя молекулярная масса

Найдено

Количество м-экв.ДФгрупп

Бецество фосфора азота на 100 íà 3r

AFE по- полилимера мера

В м-экв.

В м-экв.

СНЗ 134

CH 1 97

СН 223

CH COGH 197

СН2СООН 110

0,16 9,9 0,32

2,24

0,800

1,5

11

11

О,16

0,03

3, 7,2

1, 8 6

3, 6 9

1, 8 7

0,16

0,6

0,47

0,83

0,42

0,06

0,3

0 06

0,12

0,6

0,3

0,03

0,06

Табл ица 2

Шифр изученного раствора

"ДР ф при одинаковом количестве м-экв. фосфорсодержацих групп

Эффективность

В-НЬ+ДАДГФ (прототип, опыт 10,. табл.3) 1,83 200

6,39 70 (опыт 3. табл. 3) (опыт 4,табл.3) В- НЬ+ДАЭДФ

60 (опыт 5 табл.3) В-НЬ+ДАКЭДФ-I

Та блица 3

1 IJ

Кол ичест - во,м-экв., ДФ-групп . на 1 моль

НЬ

Функциональные характеристики внеэритроцитарного гемоглобина

Количест†во г полимера на

1 г НЬ

Шифр изученного раствора

1ыт

Р о 02 и РН йР р02

7,25

1 В-НЬ

2 В-НЬ+ДАЭДФ

3 В-НЬ+ДАЭДФ

7,34 10,66

100

6,39

7,35

0,25

1,54

0,07

4 В-НЬ+ДАЭДФ

2,25

0,25

4б В-НЬ+ДАЭДФ-II

0,52

0,06

0,03

5,В-НЬ+ДАКЭДФ" I

6 В- НЬ+ДАКЭДФ-I

7 В-НЬ+ДАКЭДФ-II

2,4

5,13 2,84

1,2

0,06

4,27 2,90

ДАЭДФ 40000

ДАЭДФ"Х 40000

ДАЭДФ-II 40000

ДАКЭДФ-? 40000

ДАКЭДФ-II 20000

4а В-НЬ+ДАЭДФ-I

57

12

Количество полимера, мг, на 1 г

НЬ, необходимое для достижения аналогичного эффекта

3,47 2,50

14,13 2,70

9,86 2,50

5,01 3,00

5,72 2,80

5,41 2,76

5,25 . 2,76

7,35

7,30

7,40

7,28

7,30

7,33

1,94

1,78

1,66

0,80

1047909

Функциональные характеристики внеэритроцитарного гемоглобина

Опыт

Шифр изученного раствора

iЪР50 02

Р О 02 п РН

4,17 2,54 7,33

0,03

0,70

0,6

3,09 2,56 7,40

0,03

10 В-НЬ+ДЛДГФ! прототип) 7,40 1,83

5,30

0,2

24.И р и м е ч а н и я. ДЛКЭДФ-I — ДЛКЭДФ; содержащие 11 дифосфонатньВ групп на 100 ЛГЕ полимера; ДЛКЭДФ-II - ДИ ЭДФ, содержащие

5 дифосфонатных групп на 100 ЛГЕ полимера; ДФ вЂ” коли чество дифосфонатных группировок в полимере; аР О О разница между Р р02 данного раствора и раствора, содержащего только B-НЬ (оп.1), мм рт.ст.

Составитель Т. Мартинская

Техред И.Метелева Корректор А. Зимокосов

Редактор Т. Колб

Заказ 7860/26 Тираж 494 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Л-35, Раущская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

8 . В-НЬ+ДЛКЭДФ-II

9 В-НЬ+ЛЭДФ

Количество,г,полимера на

1 rHb

Продолжение табл. 3

Количество м-экв

ДФ-групп на 1 моль