Способ разделения дезоксинуклеозидов

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскнх

Соцналнстнческнх

Республик (i() 3004403 (6! ) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 04.01.81 (2} ) 3250462/23 04 с присоединением заявкн М— (23) Приоритет (5t)IN. Кд.

С 07 Н 19/00

A 61 K 31/70

}}}судаРствевв 4 кююхтвт

CCCP ее млаю юевретвев я втхрмтяй

Опубликовано 15.03.83. Бюллетень JO 10 (53) УДК 547,963..07 (088.8 ) Дата опубликования описания 15.03.83

И, 3. Киршбаумс, Э. В. Приданс, . А. Кайнд„

В.,Ж. Озолиньш, У. Я. Микстайс, „-g.,Pa@Ha, М. А. Рууииа и А. А. ТвмауиМ

q." ° . м ° у в4 ° и (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ ДЕЗОКСИНУКЛЕОЗИДОВ

Изобретение относится к усовершенст- вованному способу разделения дезоксин-

;уклеоэидов, которые находят применение в медицине лля синтеза лекарственных препаратов.

Известен способ разделения деэоксннуклеозидов из гидролиэатов леэоксирибонукцеиновых кислот (ДНК) путем хроматографирования на ионообменном сорбенте . Дауэкс 2 8, включаюший элюирование

0,4 М буферным раствором формиата аммония при рН 8,6-9. Выход каждого дезоксинуклеоэнда 0,0001-0,0005% от. веса сухого исходного сырья $1$

Недостатком известного способа разделения дезоксинуклеоэидов является низкий выход целевого продукта.

Целью изобретения является повышение выхода целевых продуктов. го

Поставленная цель достигается описываемым способом разлеления деэоксинуклеоэидов из гидролизатов дезоксирибонуклеиновых кислот, заключаюшимся в том, что гидролизат дезоксирибонуклеиновых кислот хроматографнруют на сополимере оксиэтилметакрилата и этилендиметакрилата с размером частиц 10-40 мкм, а элюирование осуществляют 0,02-0,1 М буферным раствором формиата аммония при рН 2,5-4,9 и линейной скорости

1,6-3,2 см/мин.

Выход каждого деэоксинуклеозида

0,3-3,7% от веса сухого исходного сырья.

Увеличение выхода достигается в результате изменения механизма сорбционного взаимодействия дезоксннуклеоэидов и сорбента при использовании катионообменной хроматографии с гликольметакрилатной матрицей при рН 2,5-4,8. В этих условиях иэ-аа повышенной гмдрофильности гликольметакрнлатной матрицы происходит уменьшение роди гндрофобнога взаимодействия в процессе разлеления, из-эа наличия катионообменных функциональных групп сорбента и протонирования

Таблица 2

Та бли ца 1

0,021 81

Тимидин 28 43

44 0,028 42

Дезоксигуанозин 78 83

Тимидин 35

0,077 95

Дезоксигуанозин 47 еО

62 0,047 44

Дезоксиаденозин 114 134

0,028 45

Дезоксиаденозин 8 1

Дезоксицитидин 141 166

96 0,047 33

0,035 73

Дезоксицитидин 122

132 0,040 41

3 1004 при рН 2,5-4,8 амфотерных дезоксинуклеозидов происходит увеличение роли электростатического взаимодействия s процессе разделения.

Пример 1. Хроматографическую колонку размером 1,6 50 см наполняют катионообменным сорбентом сферон 51000 (диаметр зерен сорбента 10-25 мкм).

Через колсн у процускают поток. элюэнта с линейной скоростью $,6 см/мин (объ- 36 емная скорость О, 0031 n/ìèí). Состав элюэнта:0,1 н, буферный раствор формиата аммония с рН 4,8. Не прекращая потока элюэнта, в колонку вводят водный раствор (рН 4,8) гидролизата ДНК, со-.. З держащий 1,8 мг тимидина 3,1 мг дезоксигуанозина, 2,2 мг дезоксиаденозина и 2,0 мг дезоксицитидина (суммарное содержание дезоксинуклеоэидов 9,1 мг), Давление в колонке во время хроматогра- щ фирования 40-50 атм. Выход фракции из колонки регистрируется ультрафиолетовым детектором при 254 нм. Одновременно осуществляется отбор фракций в коллектор фракций. Общее время хроматографи- г рование 160 мин.

Результаты хроматографирования приведены в табл. 1. !

Г! р и м е р 2. Хроматографическую колонку размером 0,8 27 см наполняют катионообменным сорбентом сферон

1000 (диаметр зерен сорбента 2540 мкм). Через колонку пропускают поток элюэнта с линейной скоростью2,7 см/мин (объемная скорость 0,0014 л/мин), Состав элюэнта: 0,025- н. буферный раст»ор формиата аммония с рН 2,5. Не прекращая потока элюэнта, в колонку вво

403 4 дят водный раствор (рН 2,5) гидрализата LIHK, содержащий 2,3 мг тимидина, 0,9 мг дезоксигуанозина 1,9 мг дезоксиаденозина, 3,7 мг дезоксицитидина (суммарное содержание дезоксинуклеозидов

8,8 мг).

В течение 20 мин после ввода гидролизата llH К продолжают элюирование

0,025 н. буферным раствором формиата аммония с рН 2,5. Затем в течение

40 мин линейно повышают концентрацию ионов аммония в элюэнте до 0,1 н. и рН до 4,8 и продолжают элюирование при этих значениях концентрации и рН до кон. ца хроматографирования. Скорость элюирования сохраняется постоянной. в течение всего процесса хроматографирования, при этом давление в колонке 6-9 атм. Выход фракций из колонки регистрируется ультрафиолетовым детектором при 254 нм.

Одновременно осуществляется отбор фрак» ций в коллектор фракций. Общее время хроматографирования 180 мин.

Результаты хроматографироваиия приведены в табл. 2.

Пример 3. Хроматографическую колонку размером 1,6 50 см наполняют катионообменным сорбентом сферон 5

1000 (диаметр зерен 25-40 мкм), Через колонку пропускают поток элюэнта с линейной скоростью 3,2 cM/мин (объ,емная скорость 0,0065 л/мин ). Состав элюэнта:0,1 н. буферный раствор формиата аммония с рН 4,8. Не прекращая по-., тока элюента, в колонку вводят водный раствор (рН 4,8 ) гидролизата ДНК, содержащий 130 мг тимидина, 37 мг деэСпособ разделения дезоксинуклеозидов из гидролизатов дезоксирибонуклеиновых

S кислот путем хроматографирования на ионообменном сорбенте, вклкяаюший элюирование буферным раствором формиата аммония, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью повышения выхода целевых

О продуктов, в качестве ионообменного сорбента используют сополимер оксиэтклметакрилата и этилендиметакрилатаГ с раз,.мером частиц 10-40 мкм, а элюнрование проводят при концентрации буферного раствора 0,02-0,1 М, рН 2:5-4,9 и линейной скорости 1,6-3,2 см/мин. аблица 3

Дезоксиаденозин

Дезокси40 55 0,094 1300

67 80 0,085 1100 ци тидин

Составитель Л. Никулина

Редактор О. Персиянцева Техред Т.Маточка Корректор М. Шарощи

Заказ 1793/32 Тираж 385 Подписн ое

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., a. 4/5

Филиал ППП "Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 1004 оксигуанозина, 204 мг дезоксиадено - зина и 138 мг дезоксицитиднна {суммарное содержание дезоксинулеозидов 509 мг)

Давление в колонке во время хроматографирования 8 10 атм. Выход фракций из колонки регистрируется ультрафиолетовым детектором при 254 нм, Осуществляется отбор только фракций дезоксиаденозина и дезоксицитиднна. Общее время хроматографирования 100 мин.

Результаты хроматографирования приведены в табл. 3

403 6

Ф ормула изобретения

Источни ки информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССГ

N 540874, кл. С 07 Н 19/00, 03.03.7 5 (прототип).