Штамм @ @ 12/3а-продуцент аклациномицинов @ и @

 

Штамм Streptcimyces lavendofolial 12/ЗА, № 1670 (Коллекция культур микроорганизмов ВНИИА) - продуцент аклациномицинов А и В.

1 Щ

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

09) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTWI (21) 3459347/28-13 (22) 29.06.82 (46) 23.11.84. Бюл. И - 43 (72) Л.П.Иваницкая, Л.В.Егоров, С.Е.Есипов, С.И.Веселова, В.С.Сойфер, Э.M.Ñèíãàë, M.M.Òàéã, Л.Н.Останина, C.M.Навашин, Е.И.Крючкова, А.И.Чернышов, Т.Г.Терентьева, И.П.Фомина и Н.A,Êëþåâ (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков (53) 615.33(088.8) (56) 1. Патент Великобритании

N- 1.491266, кл. С 2 С, 197.7.

345D С 12 R 1/06 // С 12 R 1/06; С 12 R 1/56 (54) ШТАММ ЯТИЕРТОИУСЕ $ ЬАЧЕЮОРОЬТАЬ

12/ЗА-ПРОДУЦЕНТ АКЛАЦИНОМИЦИНОВ А И В. (57) Штамм Streptcimyces lavendafolial

12/ЗА, II 1670 (Коллекция культур мик роорганизмов ВНИИА ) — продуцент аклациномицинов А и В.

1069433

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частнос— ти к производству противоопухолевых антибиотиков аклациномицинов А и В.

Известен штамм Streptomyces

galilaeus МА 144MI продуцент аклациномицинов A и Б (1 3.

Однако известный штамм не обладает высокой активностью антибиоти— кообраэования (46 мг/л аклациномици- Io на А и 23 мг/л аклациномицина B3.

Целью изобретения является повышение активности антибиотикообразования.

Эта цель достигается с помощью штамма Streptomyces lavendofolial

12/ЗА.

Штамм выделен из почвенного образ— ца Средней Азии., !епонирован в коллекции культур

ВНИИА под !! - 1670.

Штамм Str.lavendofolial 12/ЗА характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Образует обильный воздушный мице— лий сиреневато-розового цвета. Спороносцы. спиральные, споры с гладкой поверхностью размером 0,7(XI-1,4 мкм.

Субстратный мицелий от бежево-розового до грязно-лилового цвета. В среду выделяется пигмент буро-коричневого до буро-розово-фиолетового.

Выращивание культуры проводили при 28 С в течение 28 дней.

Агар Чапека.

Воздушный мицелий — хорошо развит, сиреневато-розовый.

Субстратный мицелий — бежево-розо—

40 вато-лиловый. Растворимый пигмент буро-розоватый.

Агар Гаузе 1.

Воздушный мицелий — рост обильный, бледна-розоватый.

Субстратный мицелий — буро-гряз45 но-фиолетовый. Растворимый пигмент буро-розоватый.

Среда I Красильникова.

Субстратный мицелий — бежево-грязно-фиолетовый. Растворимый пигмент— буро-розово-фиолетовый.

Крахмальный агар.

Воздушный мицелий — рост умеренHbIH PO9OBhlH»

Субстратный мицелий бежево-розовый. Растворимый пигмент бежеворозовый.

Глюкозоаспарагиновый.

Субстратный мицелий — песочно †б роватый до коричневого. Растворимый пигмент песочно-коричневый.

Агар Ваксмана.

Воздушный мицелий — рост обильный, розово-серый.

Субстратный мицелий — от буро-каштанового-коричневого до грязно-фиолетового !. Растворимый пигмент коричнево-бурый /В2/.

Агар дрожжевой с растворимым крахмалом.

Воздушный мицелий — рост обильный, розово — серый.

Субстратный мицелий — коричневый.

Растворимый пигмент — пе сочно-бу рый до коричневого.

Агар глюкозодрожжевой.

Воздушный мицелий — рост обильный, белесый.

Субстратный мицелий — темно-коричневый. Растворимый пигмент коричневый.

Овсяный агар.

Воздушный мицелий — рост хороший, розово-серый.

Субстратный мицелий — буро †коричневый /В2/. Растворимый пигмент светло-коричневый /В7/.

Агар солодовый.

Воздушный мицелий — рост обильный, розово-серый.

Субстратный мицелий — коричнево— каштановый. Растворимый пигмент буро-коричневый.

Агар Гаузе 2.

Воздушный мицелий — рост удовлетворительный, светло †сер, Субстратный мицелий — коричневый. Растворимый пигмент — коричневый, MIIA .

Воздушный мицелий — рост слабый.

Субстрат мицелий — бежево-песочный. Растворимый пигмент отсутствует.

Агар с тирозином.

Воздушный мицелий — рост обильный, сиренево-розовый.

Субстратный мицелий — сливино-чер,ный. Растворимый пигмент-умбровый.

Агар Треснера с лимонно-кислым железом.

Воздушный мицелий — рост хороший, сиренево-розовый.

Субстратный мицелий — темноумбровый. Растворимый пигмент темноумбровый..

Ломтики картофеля.

3 1069433

Воздушный мицелий — рост хороший, от белого до розового.

Субстратный мицелий — бурый. Растворимый пигмент бурый.

Физиологические признаки.

Аэроб, оптимум роста 24 — 30 С.

При 50 С не растет. Желатину разжижает умеренно, молоко пептонизирует с побурением, крахмал гидролиэует умеренно. Меланоиды образует (среда Треснера с лимоннокислым железом, агар с тироэином 1.

Культура Str lavendofolial штамм

12/ЗА хорошо использует следующие источники углерода: D -глюкозу, Р-ксилозу, с -арабинозу, D-ôðóêòoэу, 2 -галактозу, Э вЂ” инозит. Слабо использует или не использует о1-рамнозу, не использует сахарозу, раффинозу и 13 -маннит.

Культура Str.lavendofolial штамм

12/3-А сохраняется на скошенных агаризованных средах под слоем вазелинового масла при +5 С в течение 6 месяцев. 25 Виоларину

Антагонистические признаки.

Культура Str lavendofîlial штамм

12/3 — А при культивировании в жидкой питательной среде в колбах на качалках на третьи сутки образует акла30 циномицин А в количестве 56-60 мг/л. который обладает антимикробным действием. Данные по антимикробной активности приведены в таблице.

Антимикробный спектр аклациноми— цина А, выделенного из культуры

Str.lavendofolial штамм 12/3-А, в Е.coli 675 сравнении с прототипом.

Продолжение таблицы

ИПК, мкг/мп

Тест-оргаииэ5 аклацин миции А выделен иэ культ ры Str.

vendof o

al аклациноции А фирмы

aidan, Hoj in

iseibu tsu

Kagakukenkuu

Ка вТо1 Уор арап

15,56

15,56

15 пенициллину

15,56 15,56 гент амицину

11,6

11,6 канамицину

15,56!

1,6 олеандомицину

23,3

15, 56 линкомицину

23,3

19,0

23,2

31,2 эритромицину

70,0

31,2 дактиномицину

>250, 0

>250,0 новобиоцину

125,0 125,0 рифампицину

125,0

> 250,0

125, 0

>250,0 ванкамицину

P s eud omona s

>250,0 >250,0

МПК, мк г /мл

Тест-организмы

aerugenosa

40 акл ацино— мицин А, выделеннь из культу ры Str.la

vendof o1 i

al аклациномицин А фирмы

Z a id an, Ho j in 45

Biseibutsu

Kagakukenkuu

Kai,To1:уо, Japan

Staph.aureus

209Р

1556.78

Staph.aureus

209Р, устойчивые к стрептомицину 15,56 15,56 чувствительность определяли методом двухкратных серийных разведений в мясо-пептонном агаре рН 7,0 при микробной нагрузке 10 кл/мп с помощью штамма-репликатора через 20 ч инкубации при 37 С..

Аклациномицин А обладает также ци« тотоксической активностью и противоопухолевым действием.

55, Биохимические свойства.

Молоко пептониэирует с побурением крахмал гидролизует умеренно. Желатину разжижает умеренно. Усваивает

10694

3, Я-глюкозу, 2.-ксилоэу, L-арабинозу, 3- галактозу, 3 -инозит; не усваивает сахарозу, L-рамнозу, 3 -фруктов-у, раффинозу, 37 -маннит.

Меланоиды образует. 5

Пример 1. Споровый материал культуры Str. lavendofolial штамм

12/3-А выращивают на овсяном агаре при 28 С в течение 12 дней до появления обильного воздушного мицелия. !О

Для получения маточного посевного агаровый блок засевают в колбы Эрленмейера емкостью 750 мл в жидкую среду В-2 без сернокислой меди и пеногасителя. Выращивание проводят на ка- 15 чалке (250 об/мин ) в течение 2 суток при 28 С. В посевной инокулятор (10 л) вносится маточная культура в количестве 5Х. Выращивание проводят на среде В-2 без сернокислой меди при щ

28 С 200 об/мин и аэрации 0 л/мин в течение 24 ч. Вегетативный иноку-. лят используют в количестве 57 от объема ферментационной среды.

Биосинтез проводят в 100 л ферментере, содержащем 60 л среды В-2, в течение 3 суток при температуре

27 С, 200 об/мин и аэрации 60 л/мин.

Содержание аклациномицина А и ак- >О лациномицина В в ферментационной жидкости определяют по следующей методике:

1. Определение аклациномицина А и аклациномицина В в мицелии. 35

После окончания ферментации получают мицелий из 5,0 мл, культуральной жидкости центрифугированием при .2000 об/мин в течение IO мин. Из полученного мицелия антибиотики экстра-40 гируют в течение 2 ч 4,0 мл ацетона при перемешивании через 15-20 мин.

Из 1,0 мл экстракта выпаривают ацетон в вакууме при температуре ниже

40 С и проводят реэк тракцию 1,0 хло 45 роформа. Сконцентрированный хлороформный экстракт используют для хрома, тографического разделения антибиотического комплекса. С этой целью на пластинку с незакрепленным слбем 50 сорбента.капилляром, отступив слева и от нижнего края пластинки 2 см, наносят весь хлороформный экстракт в виде линии, длиною 1-1,5 см. На эту же пластинку наносят раствор стан- 5s дартного образца аклациномицина А и .раствор аклациномицина В. Пластинку помещают в хроматографическую каме33 ру, содержащую хлороформ-этилацетатметанол — 7; 2 . 1. Когда фронт растворителя достигает края пластинки, ее вынимают и подсушивают на воздухе

20 мин. Желтые зоны, соответствующие по подвижности аклациномицину А и аклациномицину В, элюируют раздельно 4 мл метанола при рН = 6 для спектрофотометрии на волне

430 нм. Количество аклациномицинов

А и В определяют исходя из удельной экстинкции антибиотиков (E " для

1см аклациномицинов А и В равна 158,6 и

159,2 соответственно ) в мг на 1 л культуральной жидкости по формуле: для аклациномицина А С =202Д

МГ./A для аклациномицина В С =201Д ллr/л

2. Определение аклациномицина A и аклациномицина В в нативном растворе.

Нативный раствор получают центрифугированием из 5,0 мл культуральной жидкости. Экстрагирование проводят этилацетатом при рН=6 из .расчета на 5 мп нативного раствора

5 мл этилацетата. Этилацетатный экстракт в количестве 2 мл выпаривают в вакууме, реэкстрагирование проводят 2 мл хлороформа. Дальнейшие процедуры такие же, как в случае определенйя аклациномицинов А и В в мицелии.

Количество аклациномицинов А и В определяют, исходя из удельной экстинкции антибиотиков по формуле: для аклациномицина АС(мг/л )=126,6д для аклаци номи цина ВС (мг /л! =1 26, ОД

На 3 сутки ферментации на среде

 — 2 культура 12/3-А образует около

56 мг/л аклациномицина А и 4-8 мг/л аклациномицина В.

Для выделения аклациномицина А и аклациномицина В культуральную жидкость (60 л ) фильтруют на нутчфильтре при рН = 4,5-5,0. Из нативного раствора антибиотики экстрагируют этилацетатом в соотношении 10:l.

Органический слой отделяют и выпаривают до.водного остатка в вакууме циркуляционного испарителя при температуре не выпе 40 С. Влажный мицелий (5 KI ) дважды экстрагируют ацетоном порциями по 10 л . Мицелий отделяют фильтрованием и отбрасы- вают. Ацетоновые экстракты объединяют и выпаривают. Водные остатки, по -

1069433 лученные после отгонки этипацетата и ацетона, объединяют и из полученно.

ro концентрата (5 л 1 после падщелачивания IOX-ным КаОН до рН=6,8, антибиотики экстрагируют трижды двойным объемом толуола (10х3 л! . Толуольные вытяжки объединяют, а водный остаток отбрасывают, Толуольный экстракт (30 л) упаривают в вакууме при температуре не выше 40 С до 0,1 >р исходного объема (3,0 л). Из полученного концентрата антибиотики экстрагируют 0,5-кратным объемом 0,01 í.HCI.

Образовавшуюся при экстракции эмульсию разбивают центрифугированием или сепарпрованием. Антибиотики из водного раствора экстрагируют 0,5-кратным объемом хлороформа. Время экстракции — 20-30 мин при постоянном пе-. ремешивании. Образующуюся эмульсию разбивают на сепараторе. Водный слой отбрасывают, слой хлороформа (1,5 л 1 сушат 4 ч — над безводным NazSO+ из расчета IO г соли на 100 мл экстракта. Хлороформный экстракт отделяют фильтрованием от сульфата натрия и упаривают в вакууме на роторном испарителе до О,1 объема, к остатку добавляют 10-12 объемов сухого гексана и для завершения процесса осаждения смесь оставляют на 30.мин.

ЗО

Выпавший в осадок антибиотик отделяют фильтрованием на воронке Бюхнера с пористым стеклянным фильтром В 4 и подсушивают. Фильтрат упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 С, остаток растируют гексаном, гексан отделяют от осадка фильтрованием.

Оба осадка объединяют и передают на хроматографическую очистку. Получают 2,5 r препарат-сырца.

Хроматографическое разделение аклациномицинов °

Колонку (8x95 см) заполняют 5,5 л суспензии, состоящей из 1,8 кг водной кремниевой кислоты (250-400 мкм) и 5,5 л хлороформа, в котором предварительно растворяют 0,5Х-ный триэтиламин в уксусной кислоте. После заполнения колонки суспензией ее промывают 3 л хлороформа.. На колонку наслаивают препарат-сырец (10 г), полученный на предыдущей стадии и растворенный в 100 мл хлороформа. Пос 5 ре сорбции антибиотиков колонку подключают к системе для элюации.

Для разделения антибиотиков проводят ступенчатое градиентное элюирование. С этой целью через колонку пропускают:

1! 4 л четыреххлористого углерода;

2) 8 л системы, состоящей из четыреххлорисч ого углерода (СС1 ) и изопропанола = 25:I; . 3) 8,5 л системы, состоящей из

CCI<-изопропанола = 20:1;

4) 20,5 л системы, состоящей из

СС1 -изопропанола = 10:1.

Лклациномицин В снимается с колонки системой СС1 -изопропанол = 20:1, а аклациномицин A — СС1 — изопропанол =. IО:1. Элюаты по 5-7 .л, содерI жащие аклациномицин А и аклациномицин В, раздельно экстрагируют 0,2кратным объемом 0,01 н, раствором

HCI. Из водного слоя антибиотики экстрагируют 0,2-кратным объемом хлороформа. Хлороформные экстракты аклациномицина А и аклациномицина В сушат раздельно безводным

NazS0 из расчета 2 r на 100 мл раствора, осушитель отделяют фильтрованием, а фильтрат упаривают в вакууме при 40 С до 0,1 объема. К этому остатку добавляют 10-кратный объем сухого гексана. Смесь выдерживают 30 мин, осадок отделяют на пористом стеклянном фильтре У 4 и сушат до воздушно-сухого состояния. Получают 0,7 .г аклациномицина А и О,I г аклациномицина В из 2,5 г-препарата-сырца.

Пример 2. Агаровым блоком 12 суточной культуры Str.lavendofolial штамма 12/3-А, выращенной на овсяном агаре, засевают посевные колбы со средой В-2 без сернокислой меди.

Выращивание проводят на качалке при 250 об/мин при 28 С в течение

48 ч. Выросший посевной материал используют в количестве 5-IOX от объема ферментационной среды. Ферментацию проводят в колбах Эрленмейера на среде В-3 следующего состава, Х: соевая мука 1,5, крахмал карто- фельный 3, мел 1,4, натрий хлористый 0,3, сернокислая медь 0,007.

Колбы с ферментационной средой культивируют в тех же условиях в течение 72 ч. Активность культуральной жидкости при этом составляют 60 мг/л для аклациномицина А и 10 мг/л для аклациномицина В.

Корректор Н.Король, Редактор П.Горькова

Техред Т.Дубинчак

Заказ 9)47/3 Тираж 52) Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

))3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r.ужгород, ул.Проектная,4

9 1069433

)0

Использование изобретения позво- циномицина В (с 23 мкг/мл до лит повысить активность антибио- 4-8 мкг/ми, упростить способ по.— .,тикообразования аклациномицнна ц лучения и очистки целевого пропонизить степень образования акла