Способ получения тилактона и штамм @ @ @ 12188 для его получения

 

1. Способ получения тилактон формулы Q эаключакяцийся в том, что штакм Streptomyces fradiae NRRL 12188 выращивают в питательной среде, содержащей источник углерода, азота и (Л неорганические соли, в аэробных тлубинных условиях ферментации с последующим выделением целевого продукта и при необходимости этерификацией его. 2. Штамм Streptomyces fradiae NRRL 12188 (Agricultural Research Culture Collectin NFRL), используемый для получения тилактона. со О) 00

(19) ()!) союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

fl0 ДЕЛАМ HSOEiPbÒEHÈÉ И ОТКРЫТИЙ (21) 3302650/28-13 (22) 30.06.81 (31) 162977 (32) 02.07.80 (33) США (46) 23.0i.84. Бюл.Р 3 (72) Ричард Генри Балтз и Рджин Томас Сено (США) (71) Эли Лилли энд Компани (США) (53) 615.779.931(088.8) у5)) С 12 N l/06// (С 12 P 1/06;

С 12 R 1/54) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ тИЛАКТОНА И штАмм ятнеРТОмусея ГВА0тАе ИНВА

12188 ДЛЯ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ. .(57) 1. Способ получения тилактон формулы 0

00 заключающийся в том, что штамм

Streytomyces fradiae NRRL 12188 выращивают в питательной среде, содержащей источник углерода, азота и неорганические соли, в аэробных глубинных условиях ферментации с последующим выделением целевог продукта и при необходимости этерификацией его.

2. Штамм Streptomyces fradiae

NRRL 12188 (Agricultural Research

Culture Collectin NNRL), используемый для получения тилактона.

1069631

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения антибиотиков.

Целью изобретения является получение антибиотика тилактона.

Для получения тилактона используют штамм Streptomyces fradi.aå NRRL

12188 (Agricultural Research Culture

Collectin NRRL).

Способ получения тилактона формулы О

>3 НГ 4

К эфирам, имеющим практическое значение, относятся эфиры органических кислот, в том числе алифатических циклоалифатических,ариловых, аралки- 60 ловых, гетероциклических карбоновых, сульфоновых и алкоксикарбоновых с

1-18 углеродными атомами, и неорганических кислот, например серной и фосфорной. 65 заключается в том, что штамм Streptomyces fradiae NRRL 12188 выращивают в питательной среде, содержащей источник углерода, азота и неорганические соли, в аэробных условиях ферментапии с последующим выделением целевого продукта и при необходимости этерификацией его.

В качестве ацилирующих средств при получении тилактона применяют ангидриды, хлорангидриды (в сочетании с основанием или другим соедине- Зр нием, связывающим кислоту и активные эфиры органических кислот). Ацилирование может быть также осуществлено применением смеси органической кислоты и обезвоживающего средства, 35 например N,N -дициклогексилкарбодиимида. Ацилирование может быть также осуществлено энзиматически. Полученные ацильные производные могут быть разделены и очищены известными 40 способами.

Эти производные могут быть получены известными методами этерификации, например обработкой соединения стехиометрическим количеством (или небольшим избытком) ацилирующего средства, например ангидридом органической кислоты в органическом растворителе, например пиридине, при

0-24 С в течение 1-24 ч до полного завершения этерификаиии. 50

Полученные эфиры могут быть выделены иэ реакционной смеси известными способами, например экстракцией, хроматографией и,кристаллизацией. 55 (К числу применяемых эфиров агносятся эфиры, полученные на основе таких кислот, как муравьиная, уксусная, хлоруксусная, пропионовая, масляная, изовалериановая, глюкуроновая, алкоксикарбоновая, стеариновая, циклопропанкарбоновая, циклогексанкарбоновая, ф -циклогексилпропионовая, 1-адамантанкарбоновая, бензойная, фенилуксусная, феноксиуксусная, миндальная, 2-тиенилуксусная и алкил-, арил- и аралкилсульфокислоты, которые могут быть замещены в ароматической части галоидом, нитрогруппой, низшей алкоксигруппой, а также эфиры, полученные на основе таких дикарбоновых кислот, как янтарная, малиновая, фумаровая, малоновая и фталевая.

Тилактон получают культивированием штамма ЯСгер1ошусев Ггай ае..

Штамм Streptomyces fradiae получен химическим мутагенозом штамма

Streptcmyces fradiae, продуцирующего тилозин. Штамм хранится в коллекции штаммов микроорганизмов Северного регионального исследовательного центра

Agricultural Research. North Central

Region 1815 North University Strecht

Peoria Illionis 61604 под регистрационным номером NRRL 12188.

Штамм Streptomyces fradiае растет при 10-40 С. Оптимальное продупирование тилактона происходит при

28 С.

В качестве питательной среды для выращивания Streptomyces fradiae используют различные питательные среды, содержащие в качестве источника углерода такие углеводы, как декстрин, глюкоза, крахмал, зерновую муку и масла, например соевое.

В качестве источника азота используют зерновую муку, соевую муку, рыбью муку, аминокислоты.

В питательную среду могут быть введены растворимые соли, сйособные образовывать ионы железа, калия, натрия, магния, кальция аммония, хлор-, карбонат-, сульфат- и нитратионы.

Питательная среда может также содержать микроэлементы, необходимые для роста и развития организма.Эти микроэлементы входят в виде примесей в состав других компонентов среды в количестве, необходимом для роста организма. При необходимости добавляют противопенное средство, например полипропиленгликоль с молекулярным весом около 2000.

Для получения значительных количеств тилактона проводят аэробное глубинное брожение в цистернах. В небольших количествах тилактон получают в сосуде для выращивания микроорганизмов со встряхиванием.

Для выращивания применяют вегетативный инокулят. Вегетативный инькулят

1069631 получают засевом небольшого объема питательной среды споровой Формой организма или мицелием с получением свежей, активно растущей культуры организма. Вегетативный инокулят затем переносят в резервуар большегб размера.

Для вегетативного инокулята применяют ту же среду и при ферментации в больших масштабах, но могут быть использованы и другие питательные 10 среды.

При аэробном глубинном выращивании пропускают стерильный воздух.Для эффективного продуцирования антибио-тика процент насыщения воздухом дол- 15 жен быть около 30% или выше при 28 "C и давлении 1 атм.

Полученный тилактон может быть выделен из среды известными способами (экстрагированием или фильтрованием ферментативного бульона).

При экстрагировании могут быть использованы различные способы. Для очистки отфильтрованного бульона используют способ, согласно которому бульон экстрагируют без установления определенного рН подходящим растворителем, например, амилацетатом, или петролейным эфиром, концентрированием под вакуумом органической фазы с получением кристаллов или масла. В случае получения масла,оно

Может быть очищено адсорбционной хроматографией.

Пример 1. Лиофилизованную таблетку Streptomyces fradiae диспер. 35 гируют в 1-2 мл стерилизованной воды.

Часть этого раствора (0,5 мл) используют для инокуляции вегетативной среды (150 мл), имеющей следующий состав, вес.%: настой пропитанного 40 водой зерна 1,0) экстракт дрожжей

0,5 соевая крупа 0,5 i CACO 0,3;

1 соевое масло 0,45 и деионизированная вода 97,25.

Или же вегетативную культуру

Streptomyces fradiae NRRL 12188, хранящуюся по 1 мл в жидком азоте, быстро оттаивают и применяют для инокуляции вегетативной среды, Инокулированную вегетативную среду инкубируют в колбе Эрленмейера на 500 мл при 29 С 48 ч в качалке со скоростью . вращения 300 об/мин.

1.

Полученную инкубированную вегетативную среду в количестве 0,5 мл применяют для инокулирования 7 мл питательной среды следующего состава, вес..%: свекольная меласса 2,0 1 зерновая мука 1,51 рыбья мука 0,9; клейковина зерна 0,9; Nacl 0,1> (Nii ) НРО 0,04 СаСО 0,2, соевое 60 масло 3,0 и деионизированная вода 91,36.

Инокулированную питательную сре- ду инкубируют в сосуде на 50 мл прй 8"С 6 дней в качалке при 300 об/мин, g5 ля получения инокулята в больном объеме 60 мл инкубированной вегетативной среды, приготовленной описанным способом, применяют для инокулирования 38 л векетативной среды роста второй стадии, имеющей следующий состав, вес.%: настой пропитанного водой зерна 2,0 соевая мука 0,5; экстракт дрожжей

0,5 СаСО 0,3(соевое масло 0,5 лецитин 0,015 и вода 97,185.

Добавлением 50%-ного раствора

NaOH рН приводят к значению 8,5.

Вегетативную среду второй стадии инкубируют в цистерне на 68 л 47 ч при 29 С. 4 л полученной инкубиропри 29 С .4л полученной инкубированной среды второй стадии применяют для инокулирования 40 л стерильной среды следующего состава, вес.%: рыбья мука 0,92 зерновая мука 1,57 клейковина зерна 0,92(СаСО 0,21, ИаС1 0,1 (NH ) H(О 0,04 свеКольная меласса

2,1 соевое масло 3,15 лецитин

0,09 и вода 90,9.

Добавлением 50%-ного раствора

NaOH рН доводят до 7,2. Инокулированную питательную среду помещают для брожения в цистерну на 68 л на

5 дней при 284С. Питательную среду. аэрируют воздухом таким образом, что уровень растворенного воздуха составлял 30-50%, перемеиивание осуществляют мешалками со скоростью

300 об/мин.

Пример 2. Ферментированный бульон (1600 л), полученный способом по примеру 1, фильтруют через

Фильтрующее устройство. рН Фильтрата доводят до 9 добавлением

2%-ного раствора едкого натра.

Фильтрат экстрагируют 400 л амилапетата. Амилацетатный экстракт, имеющий высокую оптическую плотность, Но не проявляющий противомикробной активности, концентрируют в вакууме с получением масла.

Масло растворяют в 5 л бензола, бензольный раствор хроматографируют на колонке, заполненной силикагелем и промытой бензолом. Элюирование контролируют тонкослойной хроматографией, применяя смесь бензол-этилацетат (3:2) в качестве системы растворителей и распыленную серную кислоту для проявления. Сначала колонку промывают бензолом для удаления метедных соединений, а затем смесью бензол-этилапетат (9:1)-для удаления и выделения тилактона.Фрак ции, содержащие тилактон, объединяют и испаряют под вакуумом. Тилактон кристаллизуют из смеси бензол-гексан или горячего гексана с выходом

2 г.

Тилактон представляет собой белое твердое вещество, кристаллизующееся из гексана или смеси гексана

1069631

Составитель С.Малютина

Редактор Г.Безвершенко ТехредМ,Тепер Корректор В.Бутяга

Заказ 11512/60 Тираж 525 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4 с этилапетатом, плавящееся при 162163 С.

Элементный состав, %; углерод 70; водород 9,7 и кислор д 20,3. Эмпирическая формула тилактона С Н Оз, молекулярный вес 394. 5

Инфракрасный спектр тилактона в хлороформе. Отмечены частоть, при которых обнаруживаются заметные абсорбционные максимумы: 3534 (сре дний) 2924 (сильнь1й), 2398 (слабый)„ 0

2353 (слабый), 1709 (очень сильный), 1678 (очень сильный): 1626 (небольшой), 1592 (очень сильный), 1458 (сильный), 1441 (плечо), 1379 (небольшой), 1404 (сильный), 1316 (сильный), 1284 (средний), 1181 (очень сильный), 1143 (сильный), 1103 (средний), 1078 (средний), 1049 (очень небольшой), 1025 (средний), 984 (очень сильный), 958 (сильный), 923 (средний), 911 (плечо), 859 (небольшой), 868 (средний), 840 (средний), 820 (очень небольшой) и

661 см " (небольшой).

Абсорбционный спектр в ультрафиолетовой области в нейтральном этаноле имеет абсорбпионный максимум при 282 нм (Е„", „ = 560).

Ссйр = -55,23 (Cl CHgOH).

Электрометрическое тйтрование тилактона в 66%-ном водном растворе 30 диметилформамида показывает, что в нем нет титруемых групп.

Тилактон почти не растворим в воде, но растворим в органических растворителях (ацетон, метанол, этанол 35 диметилформамид, хлороформ, диэтиловый эфир, беH3oJI и диметилсульфоксид) °

Тилактон может быть разделен с тилозином с пОмОщью тОнкОслОйнОЙ 4О хроматографии на силикагеле. Для проявления применяют распыленную серную кислоту, ко нцентрировачную или разбавленную (50%) . В этом случае тилактон .проявляется вначале в виде пятна с желтой, переходящей в коричневую окраской °

Пример 3. 3,5-Ди-О-аиетилтилактон.

200 мг тилактона, полученного по примеру 2, растворяют в 4 мл пиридина, добавляют 4 мл уксусного ангидрида, смесь оставляют на 16 ч при комнатной температуре, после чего упаривают досуха в вакууме. К полученному остатку прибавляют 5 мл метанола, раствор нагревают при 60 С

30 мин, после чего концентрируют в вакууме с получением 3,5-ди-О-ацетилтилактона, имеющего значение Ну в тонкослойной хроМатографии с системой растворителей бензол-этилацетат (4:1) на силикагеле 0,59.

Тилактон в той же системе растворителей имеет значение Rq О;3.

Пример ы 4-7. Получают

3,5-ди-О-пропионилтилактон согласно примену 3, но с применением протонового ангидрида.

Получают 3,5-ди-О-изовалерилтилактон согласно примеру 3, но с применением изова эрианового ангидрида.

Получают 3, 5-ди-О-н-бутирилтилактон согласно примеру 3, но.с применением масляного ангидрида.

Получают 3,5-ди-О-н-бутирилтилактон согласно способу, приведенному в примере 3, но с применением масляного ангидрида.

Следовательно, предлагаемый способ и штамм Streptomyces fradiae

NBHL 12188 позволяют получить новый антибиотик тилактон.