Способ дифференциации вирулентных и авирулентных шигелл

 

СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВИРУЛЕНТНЫХ И АВИРУЛЕНТНЫХ ОШГЕЛЛ путем перорального заражения животных с последующем учетом полученных результатов , отличаю 01 ийся тем, что, с целью ускорения способа и выявления uiTaNWOB с пониженной вирулентностью , из селезенки зараженных животных выделяют цитоплазматическую и лизосомальную фракцию силеноцитов, определяют в них активность катепсина i) и при повышении его активности по сравнению с нормой и цитоплазмической фракции дифференцируют вирулентный штамм, а при повыиенин его активности в лизосомальной фракции авирулентгеяй .S

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) 3(Д) 4 01 К 33 48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСХОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ Г (211 3432171/28-13 (221 03.05 ° 82 (46) 23.02 .84. Бкл. М 7 (,72) Ю.A.Håëàÿ, Э,Л.Хасман, Л.Ю.Попова и С.N.Быстрова (71} Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. Н.Ф.Гамалеи (531 616.07 (088. 8) (56) 1. Mell А. J., Volent lm J. À., "! пХесй1оп of the developing chl ck

embryo,with dysentery Ьас1111"

P roc. So l ° Exp. В ro I ..,,Hed., 1940, 44, )) 1, р. 160-161.

2, Белая Ю.А,, Брауде A.È., Щербакова Э.Г., Соловьев Н.Н ° Фагоцитоз вирулентных и авирулентных шигелл в культуре мазанных перитоксальных макрофагов. — ЖИЭИ, 1968, Р 8, с. 26-31 (прототип). (54) (57) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВИРУЛЕНТНЫХ И АВИРУЛЕНТННХ ШИГЕЛЛ путем перорального заражения животных с последующим учетом полученных результатов, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа и выявления штаммов с пониженной вирулентностью, из селезенки зараженных животных выделяют цитоплазматическую и лизосомальную фракцию силеноцитов, определяют в них активность катепсина 3 и при повышении его активности по сравнению с нормой и цитоплазми- . ческой фракции дифференцируют вирулентный штамм, а при повыаении его активности в лизосомальной фракции авирулентный. Ж

1075163

Изобретение относится к медицине, н частности к микробиологии и иммунологии.

Известен способ дифференциации нирулентных и анирулентных штаммов г шигелл путем заражения испытуемыми штаммами развивающихся куриных эмбгионов (1) .

Однако данный способ не позволяет дифференцирОБать штамьх с Ослабленной нярулентностью. . |О

Известен также способ дифференциации вирулентных и анирулентных шигелл путем заражения in vitro перитониальных макрофагон j23 .

Недостатками CIIocchB являются точнОсть FocRKIBR) способ отражает условия естественного тече-, ния дизентерийной инфекцяи, а также длительность проведения анализа.

Целью изобретения является ускоре- .

rQ ние способа и в|ыявленяе штаьжов с по- няженной вирулентностью.

Поставленная цель достигается тем, что согласно сгособу .дифференциации нирулентных и анирулентных шигелл

25 путем перорального заражения животных с последующим учетом полученных результатов, иэ селезеяки зараженных животных выделяют цитоплазматическую я лиэОСОмальнуя фракции силе ноци тон, Ъ определяют н них активность катeIIcHна Р и при повышении его активно| ти по сравнению с нормой в цитоплазмиче ской фракции дифференцируют нирулентный штамм,. а при повышении его актиннОсти н лиэосомальнОй фракции "- 35 авирулентный.

Способ Осуществляется следующим образом. штаммы шигеля ныращявают на Обычном мясопептонном агаре B течение 40

18 ч при 37 С. Бактерии смынают стерильным физиологическим раствором. йыаей линии CBA в количестве 7 шт заражают интрагастрально в дозе

2х10 микр клеток по оптическому стандарту. Через 18-24 ч .после заражения мышей забивают, Обезглавливая. извлеченные селезенки помещают в холодный 0,25 м раствор сахарозы в соотношении 1:10 по весу (на 2 r ткани селезенки добавляют 20 мл раствора сахарозы). Клетки селезенки гомогениэируют н стеклянном гомогенизаторе. цитоплаэматическую и лизосомальиую фракции выделяют методом дифференциального центрифугирования. 55

Гомогенаты центрифугируют при

800 об/мин в течение 10 мин, освобождая от ядер, митохондрий и других относительно тяжелых клеточных элементов. Надосадочную жидкость пов-6О торно центрифугируют при 15000 об/мин в течение 15 мин. При этом надосадочная жидкость представляет собой цитоплаэматическую фракцию. Осадок, содержащий лиэосомы, обрабатывают бидистиллированной водой (1."10) н течение 30 мин, Обломки лизосом уда. ляют центрифугированием при

15000 Об/мин в течение 30 мин. Полученная таким образом надосадочная жидкость содержит лиэосомальные энэимно

AKTHaHocTI катепсина П н цитоплазматическои и лизосомальной фракциях клеток селезенки определяют по методу Anson (1936), используя н качестве буфера 2,5Ъ-ный раствор денатурированного гемоглобина в кислой среде, Результаты выражают в мкг тирозина на 1 мл белк- определяемом по методу Zoury (1951) .

При активности катепсинаД) н цитоплаэматической фракции кЛеток

ceëåçåHKè через 18-24 ч после заражения бактериями на 25% и более я неизменной активности катепсина в лиэосомальной фракции Iio сравнению с активностью этогс фермента у нормальных незараженных мышей исследуемый штамм Относят к нирулентным и, наоборот, при отсутствии изменения активности катепсина в цитоплаэматической фракции и резком (более чем на 25%) усилении его активности в лизосомальной фракции по сравнению с нормой исследуемяй штамм относят к авирулентным..

Пример 1. Итамм всеge!1а

Г Iexnerl 2а i9 516 выращивают, вводят

ЖИВОТНЫМ И ОПРЕДЕЛЯЮТ аКТИВНОСТЬ KB т|=IIcRH 33 „

Активность катепсина z лизосомальной фракции клеток селезенки в данном случае равняется 139%, в цитоплазматической — О. Следовательно, этот штамм следует отнести к авирулентным.

Пример 2. Штамм всЬ!geltа

g ex«r(9 516 выращивают, вводят ° животным и затем определяют активность ка.тепсина З .

Активность катепсина Q в лизосомальной фракции состанляет О, в цитоплазматической фракции — 49% го сравнению с нормой. Следовательно, этот штамм следует. отнести к вирулентным.

Пример 3. Необходимо определить вирулентность штамма шигеля

Ньюкасл Р 1221.

Гсли активность катепсина 3 н цитоплазматической и лизосомальной фракциях равняется 70 и 0% соответственно, штамм следует отнести к авирулентным.

Пример 4. Определяется нирулентность штамма шигеля Ньюкасл

Р 39. Его выращивают, вводят животным и в лиэосомальной и цитоплазматической фракциях селезенки мышей определяют активность катепсина. В лиэосомальной фракции активность катепсина составляет 45%, в цитоплаэматической — 0 по сравнению с конт1075163

Составитель И. Емельяненко

Редактор T. Кугрышева Техред С.Легеза Корректор И. Эрдейи

Заказ 490/37 Тираж 823

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по едлам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ролем. Следовательно, этот штамм следует отнести к авирулентным.

Пример 5. Имеется два штамма шигелл Зонне М 478 и 6S, которые необходимо дифференцировать по виру- лентности. Определяется активность катепсина в цитоплазматической и лиэосомальной фракциях селезенки маней после перорального введения живых бактерий. Активность катепсина для штаммов Р 478 М 6 в цитоплаэматиче- IO ской фракции 115 и 19, в лизосомальной - 20 и 36 соответственно. Следовательно, штамм Р 478 является вирулентным, штамм Р 65 - авирулентным., Таким образом, предлагаемый способ дифференциации вирулентных и авирулентных шигелл с помошью определения активности катепсина ц в спленоцитах зараженных перорально животных позволяет в более короткие сроки (в течение 24-30 ч) идентифици. ровать вирулентные и авирулентные штамма шигелл по их способности повышать активность катепсина 3 в спленоцитах животных.

Предложенный способ дает возможность дифференцировать штази шигелл с пониженной вирулентностьв