Способ исследования осмотической резистентности эритроцитов

 

СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ОСМОТИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕ.НТНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ путем измерения степени гемолиза эритроцитов, отличающийс я тем, что, с целью обеспечения возможности наблюдения кинетики процесса, взвесь эритроцитов смешивают с гипотоническим раствором непосредственно в кювете спектрофотометра , инкубируют смесь, одновременно регистрируют оптическую плотность при длине волны 650 нм и по изменению оптической плотности в зависимости от времени инкубации определяют осмотическую резистивность эритроцитов.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

09) . (111

315Р G 01 N 33 48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21 ) 3236749/28-13 (22) 09. 01. 81 (46 ) 15. 06. 84. Бюл. 9 22 (72} О.В.Липина, М.И.Шраго и Т. Ф. Морозова (71) Институт проблем криобиологии и криомедицины AH УССР (53 ) 616. 07 (088.8) (56 ) 1. Авторское свидетельство СССР по заявке 9 2766905, 27 ° 03.81, "приоритет 1974 °

2. Предтеченский В.Е. Руководство, по клиническим и лабораторным исследованиям. M. 1960, с.96 (прототип). (54) (57) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ОСМОТНЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ путем измерения степени гемолиза эритроцитов, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью обеспечения возможности наблюдения кинетики процесса, взвесь эритроцитов смешивают с гипотоническим раствором непосредствеHHo в кювете спектрофотометра, инкубируют смесь, одновременно регистрируют оптическую плотность при длине волны 650 нм и по изменению оптической плотности s зависимости от времени инкубации определяют осмотическую резистивность эритроцитов. O

1097949

Изобретение относится к биологии и медицине, в частности гематологии, и может найти применение для изучения состояния консервированных эритроцитов, .используемых для трансфузий, а также для диагностики мно- 5 гих заболеваний.

Определение осмотической резистентности эритроцитов служит мерой овреждающего воздействия на клетки различных внешних факторов, например,30 фармакологических средств, различных консерватов, обеспечивающих сох ранность клеток вне организма, лучевых воздействий, низких температур и т;и. 15

Известен способ исследования амоти ческой резистентности эритроцитов (1 ..

Недостатком данного способа является отсутствие возможности оценить динамику разрушения клетки.

Известен также способ исследования амотической резистентности эритроцитов путем измерения степени.гемолиза эритроцитов (2 .

Оцнако известный способ характеризуется невозможностью наблюдения

25 кинетики процесса осмотического гем..элиз а.

4ель изобретения - обеспечение во.можности наблюдения кинетики проц< оса. 30

Поставленная цель достигается

" зм, что согласно способу исследова.1ия осмотической резистентности эритроцитов путем измерения степени гемолиза эритроцитов, взвесь эритро итов смешивают с гипотоническим раствором непосредственно в .кювете спектрофотометра, инкубируют смесь, одновременно регистрируют оптическую плотность при длине волны 650 нм и по, 40 изменению оптической плотности в зависимости от времени инкубации определяют осмотическую резистивность эритроцитов.

Способ осуществляют следующим 45 образом.

Готовят основной раствор NaC0 с рН 7,4, который по своей осмотической концентрации соответствует 10<<;NaCC. . Из этого основного раствора готовят ряд гипотонических растворов NaCE .

Измерения проводят в кювете с длиной. оптического хода лучей 1 .см, которая термостатируется при 20 С. азвесь эритроцитов непосредственно в кювете спектрофотомЕтра смешивают с гипотоническим раствором таким образом, чтобы исходная оптическая плотность клеточной взвеси составляла 1,0-1,2 при длине волны 650 нм.<сразу же регистрируют кривую зависимости "опти- 60 ческая плотность-время", по которой судят о кинетике и длительности осмотического гемолиза. Степень гемолиза эритроцитов для каждого гипотоничес- кого раствора определяют по обычному 65

Оптическая плотность, ед.опт. плотности! ММ Концентпп рация

МаС(, Ъ

Гемолиз,Ъ

1 0,9

2 0,7

1,0

2,9

62,7

0,4

3 0,5

-- 92 -, 8 —.О, 0.ивЂ

0,060

4 0,3

5 0,1

100, 0

Пример 2. Для определения осмотической резистентности эритроцитов готовят основной раствор,NaB с рН 74, гг

NaCl 180,00

Яз НРО, 27, 31

Na HZ РО 4 2Н 0 4, 86

Н 0 дист., 2000,00

Осмотическая концентрация этого раствора соответствует 10%.8аСС

Разведением готовят гипотоннчеокие растворы ИаИ, <<<

За 100%-ный гемолиз принимают показание оптической плотности взвеси эритроцитов с 0,1Ъ-ным раствором

ИмИ, а за 03 гемолиза - с 0,93HdGt

Пример. Для определения осмотической резистентности эритроцитов готовят основной раствор.N@CC рН

7,4 r:

NaCl 180, 00

Ба 2 НР04 27, 31

NaHzP04 2Н О 4 86

Н20 дист.

2000. 00

Осмотическая концентрация этого раствора соответствует 105 NaCt . Разведением готовят гипотонические растворы МСФ,Ъ: 0,85; 0,7) 0,5g 0,3 и 0,1%. Для анализа берут консервированную донорскую кровь с,двухднев-. ным сроком заготовки. 0,01 мл крови смешивают с 3 мл 0,9%-ного раствора

Р<мИ (контроль ). Смешившие проводят быстро и непосредственно в кювете спектрофотометра "Vnicam Sp 8000" и сразу спектрофотометрируют, записывая кривую зависимости "оптическая плотность-время". Аналогично проводят измерения в приготовленных гипотонических растворах. По характеру этой зависимости судят о кинетике

1 и длительности гемолиза, степень. гемолиза определяют по обычному тройному правилу (см. таблицу).

1097949

1,2 - 0,93

NaC1 -- — — — — — ° 100%=33, 3%

1,2 — 0,06

1,2 — 0,15

NaCl: — — — — --- ° 100%=92, 1%

1,2 — 0,06 в 0,5% в 0,3%

Составитель Н.Хрусталева

Редактор Н.Горват Техред С.Мигунова Корректор A.Tÿñêo

Заказ 4200/32 Тираж 823 Подписное

ВНИИПИ Государствеиного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г.Улагород, ул.Проектная, 4 вированную донорскую кровь с двухдневным сроком заготовки. 0,1 мп крови смешивают с 3 мл 0,9%-ного раствора Ne(CE (контроль) . Смешивание . проводят быстра и непосредственно в кювете спектрофотометра "UQLcam

Вр 8000" (длина волны )(= 650 мм J.

Сразу же спектрофотометрируют, записывая кривую зависимости "оптическая плотность - время". То же делают, помещая по 0,01 мл крови 10 в гипотонические растворыйаС,%:

0 7, 0,5, О, 3 и 0,1. 0 длительности процесса гемолиза судят по времени выхода кривой "оптическая плотностьвремя" на плато. В физиологическом растворе((аС((0,9%) —.гемолиз отсутствует, в 0,7% М С гемолиз завершается за 20 с в 0,5%8aM - за.

30 с, в 0,3% МОЙСЮ - за 30 с, в 0,1% .Мс С — за 25 с.

Для определения степени гемолиза в каждом из гипотонических растворов используют исходную оптическую плотность и конечную. Исходная оптическая плотность для исследуемых образцов крови во всех приготовленных растворах,МЫМИ равна 1,05. Конечная оптическая плотность для 0,9

ЙмИ 1,05 для 0,7%МаС — 1,00, для

0,5%МаИ вЂ” 0,82, для 0,3%МЫС - 0,13, для 0,1%NaCt- 0,05. Поскольку оптиче-З0 ская плотность (1, 05) в О, 9% Na03 соответствует 0% гемолиза, а оптическая плотность (0,05р в 0,1% МаСС соответствует 100%-ному гемолизу, гемолиз в промежуточных гипотоничес- 35 ких растворах определяют по обычной .пропорции: (1, 05 — 1,00

;для 0,7% NaC1: — — --------100%=5%

1,05 — 0,05 40

I 1,05 - 0,82 для 0,5% НаС1 — — — -- — — ° 100%=23%

1,05 - 0,05

1,05 — 0 13 для О, 3% ИаС1 - — — — — — ° 100%=92% д5

1,05 — 0,05

О характере кинетики гемолиза судят по виду кривых "оптическая плот ность - время".

Пример 3. Для определения соматической резистентности эритроци,тбв донорской консервированной крови после ее контакта с криопротектором

ПЭ0-1500 берут 0,1мл этой крови и смешивают с 3 мл 0,9% Май, приготовленного 5 из основногораствора.Смешивают быстро непосредственно в кювете спектрофотометра "Unicam Sp 8000". Сразу же записывают кривую зависимости "оптическая плотность — время". То же делают, помещая по 0,01 мл исследу"Moro образца в гипотонические растворы

Na_#_ %: О 7, О 5, О 3, О 1. Длительность гемолиза определяют по времени выходы кривой "оптическая плотностьвремя" на плато. В физиологическом растворе Na CE (О, 9% МаСЮ ) гемолиз отсутствует (оптическая плотность во времени не изменяется ). В О, 7% NaCP гемолиз завершается за 20 с,в 0 5%

NaCK- за 40 с, в 0,3%NaCt — за 50 с, в 0,1% NaC1 - за 50 с.

Уровень гемолиза в каждом из гипотонических растворов определяют, зная исходную и конечную оптическую плотность исследуемых образцов в каждом из гипотонических растворов.

Поскольку .оптическая плотность исследуемого образца крови в физиологическом растворе (0,9%ймс0) — соответствует 0% гемолиза, а оптическая плотность в 0,1% NaN .(.=0,06.) соответствует 100%-ному гемолиэу, вычисляют гемолиз эритроцитов в каждом гипотоническом растворе:

1,2 — 1,14 в О, 7% NaC1 — — -- — — -- ° 100%=10, 0% 1,2 — 0,06

0 кинетике гемолиза судят по виду кривых "оптическая плотность - время".

Предлагаемый способ. позволяет, кроме степени гемолиза, определять

его кинетику и длительность, а это дает возможность получить даполнителЪную информацию об особенностях осмотической резистентности эритроцитов при воздействии различных факторов и различных патологиях, а также при подборе оптимальных консервантоВ крови.

Кроме этого, способ требует мень(" их затрат труда и времени (на 3540 мин ) эа счет исключения процессов экспозиции и центрифугирования.