Способ определения бактерицидной активности сыворотки крови

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТКИ КРОВИ, включающий инкубацию разведенной сыворотки с тест-культурой микробных клеток, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и сокращения времени исследования, инкубацию тесткультуры микроорганизмов проводят одновременно с цельной сывороткой и определяют бактерицидную активность по отношению количества радиоактивного нуклеозида , поглощенного микроорганизмами в разведенной сыворотке, к количеству радиоактивного нуклеозида, поглощенного микроорганизмами в цельной сыворотке .

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

g g А 61 В 10/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

llO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3491317/28-13 (22) 10.09.82 (46) 30.10.84. Бюл. № 40 (72) А. В. Данильцева, В. Г. Кузнецова, В. И. Шовтута, Н. В. Князева и Д. С. Сексенбаев (71) Донецкий государственный медицинский институт им. А. М. Горького (53) 615.375 (088.8) (56) 1. Смирнова О. В., Кузьмина Т. А.

Определение бактерицидной активности сыворотки крови методом нефелометрии.

ЖМЭИ, 1966, № 4, 8 — 11,.SU„„1120968 A (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЦИДНОИ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТКИ КРОВИ, включающий инкубацию разведенной сыворотки с тест-культурой микробных клеток, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и сокращения времени исследования, инкубацию тесткультуры микроорганизмов проводят одновременно с цельной сывороткой и определяют бактерицидную активность по отношению количества радиоактивного нуклеозида, поглощенного микроорганизмами в разведенной сыворотке, к количеству радиоактивного нуклеозида, поглощенного микроорганизмами в цельной сыворотке.

1120968

- тимидина — Н в объеме 0,1 мл среды 199. з

В 1 — 5 пробирки вносят по 5Х10о микробных клеток суточной культуры Ко 209 в объеме 0,2 мл физиологического раствора. В б-ю пробирку, которая служит контролем спонтанного связывания метки, микробную взвесь не добавляют. В нее приливают 0,2 мл стерильного физиологического раствора. Все манипуляции производят с использованием скоростных полуавтоматических пипеток. Затем смесь в пробирках встряхивают, перекрывают над пламенем горелки в стерильном боксе пробками и помещают на 2 ч в термостат при 37 С. После инкубации бактерии осаждают на фильтре

1 «Сынпор» или «Миллипор» и под вакуумом отмывают от невключившейся метки 10 мл физиологического раствора и фиксируют

5 мл метанола. Фильтры помещают во флаконы для счета, заливают 20 мл сцинтилляционной жидкости и подвергают радио2О метрии.

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной технике, и может быть использовано в качестве об ьективного теста для характеристики естественной иммунологической реактивности организма.

Известен способ определения бактерицидной активности сыворотки крови, включающий инкубацию разведенной сыворотки с тест-культурой микробных клеток. Определение бактерицидной активности сыворотки осуществляют методом нефелометрии до и после инкубирования смеси (1).

Однако этот способ недостаточно точен, .поскольку проведение исследования бактерицидности осуществляется не в цельной (100о/0) сыворотке, а в ее относительно низкой (18о/0) концентрации, без учета того, что рост микробов в системе «жидкая средасыворотка крови» зависит от конкретных взаимоотношений трофических и бактерицидных факторов. При слабой концентрации сыворотки вследствие преобладания трофического эффекта, возникает ситуация, когда могут нивелироваться индивидуальные различия в бактерицидной OHJ!c испытуемых сывороток. Кроме того, регистрируются только простые количественные изменения оптической плотности микробной взвеси. При этом учитывая серийность исследования, время, затраченное на настройку прибора, на манипуляции измерения оптической плотности и расчет показателей, результат может быть получен не ранее, чем через 4 — 5 -.

Цель изобретения — повышение точности и сокращение времени исследования.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения бактерицидной активности сыворотки крови, включающему инкубацию разведенной сыворотки с тест-культурой микробных клеток, инкубацию тест-культуры микроорганизмов проводят одновременно с цельной сывороткой и определяют бактериальную активность по отношению количества радиоактивного нуклеозида, поглощенного микроорганизмами в разведенной сыворотке, к количеству радиоактивного нуклеозида, поглощенного в цельной сыворотке.

Способ осуществляется следующим образом.

Для каждой испытуемой сь1воротки используют 6 пробирок. В l þ пробирку наливают 1 мл цельной сыворотки, a n остальные, кроме 5-й и б-й пробирки, Во 1 мл разбавленной среды 199 стандартная среда

199 на растворе Хенкса, pH = 7,2) сыворотки в нисходящих концентрациях -- 50,0 /о

25,0 — 12,5о/о. Кратность разведения .оставляет соответственно 2, 4, 8 раз. В 5-Io пробирку и 6-ю пипетируют по 1 мл среды

199. Во все пробирки вносят по 2 мк КИ

-с р

5С

Рассчитывают бактерицидную активность по формуле А = Б XK. где А — бактерицидная активность; Б — радиоактивность микробной массы, ипкубированной при концентрации сыворотки, не вызывающей торможения захвата метки; С вЂ” радиоактивность микробов, инкублрсванных в цельной сыворотке; К -- кратность разведения сыворотки.

Пример. Исслсдование сыворотки больного К. В 1 ю пробирку наливают 1 мл цельной сыворотки„а в остальные, кроме

5-й и б-й пробирки, вносят по 1 мл разбавленной средой 199, сыьоротки в нисходящих концентрациях — — 50 Gî/о, 25 Оо/о и 12,5 /о. Кратность разведения сосгавляет соответственно 2, 4, 8 раз. В 5- о и б-ю пробирки вносят по 2 мк КИ тимидина

И в обьеме О,l мл среды 199. В 1 — 5 пробирки вносят по 5 X 10" микробчь х клеток суточной культуры. В. Staphyloсос л..й 209 вобъеме 0,,2 мл физиологического раствора.

В 6-ю пробирку, которая служит контролем спонтанного связывания метки, микробную взвесь не добавлякт. В нее приливают

Но 0,2 мл стерильного физиологического раствора, все манипуляции производят с использованисм скоростных полуавтоматических плпеток. Затем смесь в пробирках встряхивают, перекрывают над пламенем горелки в стерильном боксе пробками и помещают на 2 ч в термостат при 37 С.

После инкубацли бактерии осаждают на фильтре «Сынпор» иллл «Миллипор» и под вакуумом отмывают от невключившейся метки 10 ь .л физиологического раствора и фиксируют в 5 мл метанола. Фильтры помещают во флаконы для счета, заливают

20 4JI onинтилляционной;H HooTH и подвергают радиометрли. 1" римср расчета индекса бактерицидности: при исследовании

1120968 в жидком сцинтилляторе радиоактивность микробной массы, инкубированной в порции цельной испытуемой сыворотки, составляет 29740 расп. мин., а максимальная активность (158413 расп. мин.) зарегистрирована при инкубации микробов в смеси, содержащей 25О/О сыворотки (кратность разведения — 4). При этом активность безмикробной среды 199 равняется 2415 расп. мин. В таком случае индекс бактерицидности равен 58413 — 2415 х 4 =22

Х4 = 228

29740 — 2415

Преимущество предлагаемого способа состоит в следующем. Захват тимидина — Н з микроорганизмами, отражающий синтез

ДНК, является наиболее адекватным показателем их жизнеспособности. Для разведения сыворотки используют стандартную жидкую питательную среду 199. При такой постановке опыта радиоактивность микробной массы, измеряемая в жидком сцинтиляторе, всегда ниже в цельной сыворотке (максимум концентрации бактерицидных агентов) и возрастает по мере разведения сыворотки (снижение концентрации бактерицидных веществ) . Степень угнетения цельной сывороткой включения тимидина—

Н в микроорганизме является в предлаз гаемом способе мерой ее бактерицидности.

Для ее количественной оценки используют то методическое обстоятельство, что при определенной низкой концентрации сыворотки в инкубационной среде создают наилучшие условия для жизнедеятельности микроорганизмов, что находит отражение в максимальном захвате метки. Такая индивидуальная модель инкубационной среды, лишенной бактерицидных свойств, позволяет использовать ее за точку отсчета для количественного определения степени угне тения цельной сывороткой синтеза ДНК в микроорганизмах.

Радиоактивность микробной массы, инкубированной только в среде 199 без добавления сыворотки, никогда не достигает максимальных значений. Показатель бактерицидной активности сыворотки (индекс бактерицидности) вычисляется путем де10 ления величины максимальной радиоактивности микробной массы на минимальную в ряду концентраций сыворотки и умножается на кратность ее разведения.

Сравнительные показатели оценки бактерицидной активности 6-ти испытуемых сывороток крови представлены в таблице.

Исследования включения тимидина — Н в микроорганизмы и изменений оптической плотности микробной взвеси обнаруживают

20 подавление цельной сывороткой метаболизма и роста микроорганизмов, а также полное совпадение концентраций сыворотки не оказывающей бактерицидного действия в каждом индивидуальном случае. Расчетный показатель бактерицидной активности сыворотки в предлагаемом способе выше в среднем в 1,39 раза по сравнению с прототипом. Учитывая, что разброс по радиометрическому методу составляет О,ЗО/о а по способу-прототипу 60О/р, можно сделать

30 вывод, что радиометрический способ определения бактерицидной активности сыворотки крови в 200 раз точнее.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить точность определения бактерицидной активности сыворотки крови и сократить время исследования на 2 ч.

1120968 сг с о л в со с 4 с ) G0 с 4 л л л л л

Ю .О сч Ю с сО

О ) Ю

Ю л л СО о — л

С 1 л с 1

Ю

Ю

Ю Ю сЧ л л л Ю Г ) г -г1 Р

С 4 м л с

О)

o e a а с. с 4 г сч .Г с 4 1 л

Е Ю Д Ю и сЧ сч и сн и с

Составитель Г. Крюкова

Редактор И. Касарда Техред И. Верес Корректор М. Леонтюк

Заказ 7602/3 Тираж 687 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, )К вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4