Способ получения липазы

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПАЗЫ из семян хлопчатника, включаюпщй их прорапрвание, измельчение проростков, обработку ацетоном, экстракцию белков из ацетонового порошка, осаждение липазы сульфатсм аммония, отличающийся тем, что, с целью увеличения каталитической активноети и выхода липазы, семена перед проращиванием вьщерживают в течение одних суток в 0,001-Oj03%-HOM растворе пирофосфата натрия, а затем проращивают в тех же условиях в течение 4-6 сут.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

«91 аг1

ЭС5гг С 12 гг 9 20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР пО ДЕЛАМ ИЗОБ ЧТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЭОБРЕ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕ ГЕЛЬСТВУ (21) 3318269128-13 (22) 17.07.81 (46) 07.11.84. Бюл. -Ф 41 (72) М..Н. Валиханов, М.N. Абдуллаева и М.М. Рахимов (71) Ташкентский ордена Трудового

Красного Знамени государственный университет им. В.И. Ленина (53) 577.15(088.8) (5á). 1. Авторское свидетельство СССР

У 560888, кл. С 12 И 9/20, 1976.

2. Рахимов N.N., Ьлдашев H.X.

Липолитические ферменты в прорастающих семенах хлопчатника. -"Химия природных соединений", 1970, и 6, с. 782. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПАЗЫ из семян хлопчатника, включающий их проращивание, измельчение проростков, обработку ацетоном, экстракцию белков из ацетонового порошка, осаждение липазы сульфатом аммония, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью увеличения каталнтической активнос- . ти и выхода липазы, семена перед проращиванием выдерживают в течение одних суток в 0,001-0,037-ном растворе пирофосфата натрия, а затем проращнвают в тех же условиях в течение 4-6 сут.

40

1 I 1226

Изобретение относится к способам получения ферментов из растительных источников и может найти применение в пищевой и фармакологической промышпенностях и медицине, 5

Известен способ получения липазы из поджелудочной железы методом аффинной хроматографии P1) .

Недостатком данного способа является необходимость использования !О дефицитного сырья.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получения липазы из семян хлопчатника, включающий. их. проращивание, измельчение проростков, обработку ацетоном,.экстракцию белков из ацетонового порошка и осаждение липазы сульфитом аммония (2) .

Недостатками известного способа являются низкий выход и невысокая каталитическая активность целевого продукта.

Цель изобретения . — увеличение 25 каталитической активности и выхода липазы.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения липазы из семян хлопчатника, включающему их проращивание, измельчение проростков, обработку ацетоном> экстракцию белков из ацетонового порошка и осаждение липазы сульфатом аммония, семена перед проращиванием выдерживают в течение суток

35 в 0,001-0,03Х-ном растворе пирофосфата натрия, а затем проращивают в тех же условиях в течение 4-.6 сут.

Способ осуществляют следующим образом.

Семена замачивают и проращивают в 0,001-0,03Х-ном растворе пирофосфата натрия. Время замачивания опреде. ляют но времени до начала прорастания семян (семена прорастают через сутки), затем семена отделяют друг от друга и помещают иа фильтровальную бумагу, смоченную пирофосФатом натрия. Через 2 сут их опять помещают в сосуд с раствором пирофосфа50 та натрия и через каждые сутки берут пробы и измеряют активность.

В табл. 1 представлена зависимость активности липазы от времени выдерживания семян в пирофосфате, 94 2 в табл. 2 — активность и выход липазы в зависимости от условий проращивания семян, в табл. 3 — активность очищенной липазы после сульфатного осаждения, в табл. 4 — влияние различйых фосфатов на активность липазы.

Данные табл.. 4 свидетельствуют, что использование вместо пирофосфата натрия других фосфатов не приводит к достижению максимального положительного эффекта.

Пример 1. 100 r семян хлопчатника сорта 108-Ф замачивают в

35 мл 0,003Х-ного раствора пирофосфата натрия в течение 24 ч остав о ляют в термостате при 25-27 С. Через

\ сутки наклюнувшиеся семена раскладывают между листами фильтровальной бумаги, увлажненной пирофосфатом натрия, и выдерживают еще 2 сут при 250

27 С. Затеи проростки помещают в сосуд с О,ООЗХ-ным раствором пирофосфата натрия. Через 6 сут семена раэмельчают в среде холодного ацетона, промывают ацетоном и высушивают на воздухе. Порцию приготовленного таким способом порошка суспендируют в 0,.1 И фосфатном буферном растворе в соотношении 1:10 при перемешивании в течение 1 ч при 0-5 С. Раство о римые белки отделяют центрифугированием в течение 15 мин.

Осадок отбрасывают, а к получен- . ному супернатанту добавляют сульфат аммония до концентрации 55Х от насыщения. Осадок липазы отделяют центрифугированием, растворяют в том же буфере и высушивают, активность 325,76 ед/мг, выход 172,3Х.

Полученная липаза белая, nopomковидная, без запаха. Состав: белок 93Х, вода 7Х.

Пример 2. Проводят по примеру 1, но берут .0,001Х-ньиве раствор пирофосфата и вццержнвают семена 4 сут.

При концентрациях ниже 0,001Х и выше О,ОЗХ стимулирующее действие пирофосфата незначительно.

Использование предлагаемого способа позволяет увеличить выход липазы в 1,2-2,2 раза, а удельную каталитическую активность в 1,63,4 раза.

1122694

Продолжение табл !

Таблица 1

Активность липазы, ед/шт

325,76

1237,6

286,7

97,47

125,5

18Î, 10

Та блица 2 онцентрлция ирофосфата натрия, Ж

1 1

Известный способ

Показатели.

0,001 0,003 0,01 0,03

32,0 40,72

19, 56

18,46

14,88

Общая активность, ед/мг

672

- 480

480

896

416

161, 5 215, 3

115,3

115,3

100

Таблица 3

Известный способ

Показатели

Каталитическая активность, ед/мг

95,04

256,0

332,0

Выход по отношению к исходной активности (416 ед/мг), .X., .172 3 93,3

129,0

92,3

Время нахождения семян в пирофосфате натрия концентрации О,ООЗХ, сут

Каталитическая активность, ед/мг белка

Выход по отношению к исходной активности, Я

Общая активность, ед/мг

Предлагаемый способ

Предлагаемый способ

Концентрация пирофосфата натрия, Ж

0,001 0,003 0,01 О,ОЗ

325э 76 156 72 147 68

357,6 716,8 384,0 384,0

1122694

Продолжение табл.4

Таблица 4

Триполифосфат натрия

0,0037

280,2

Полифосфат натрия

О, 001Х

Без фосфатов

241, 1

Ортофосфат натрия

О,ОООЗЖ

132

114,2

Пирофосфат натрия

О,ООЗЙ

386,2

Составитель В. Муронец

Техред 3.Палий Корректор А. Тяско

Редактор И. Николайчук

Филиал ППП "Патент", г. Уагород, ул . Проектная, 4

Заказ 8100/23 Тираж 521 Подписное

ВЯИИЙИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35,. Раушская наб., д. 4/5