Способ выделения парапротеинов из ткани почек животных при заболеваниях легких

 

О П И С А H И Е ()987525

ИЗО6РЕТЕН Ия

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскнн

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22)Заявлено 25.08.80 (21) 3217979/30-15 (51)йт. Кд. с присоединением заявки МG 01. N 33/50. Гееударстеенный кемнтет (23) Приоритет

СССР

Опубликовано 07. 01. 83. Бюллетень №!

Дата опубликования описания 07.01.83

ei делам нэаеретеннй н етнрытнй (53) УДK 599 ° 322. .2(088.8) (72) Автор изобретения

A.Ï.ÈëüèHûõ (7!) Заявитель а . ( (54) -СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПАРАПРОТЕИНОВ ИЗ ТКАНИ

ПОЧЕК ЖИВОТНЫХ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ЛЕГКИХ

Изобретение относится к биохимии белков, в частности к выделению белков, и может быть применено для опре" деления и выделения паропротеинов и белков с основными свойствами из тканей организма для биохимических исследований.

Известен способ получения денатурированных белков путем осаждения их солями тяжелых металлов, таких как серебра, меди, железа, свинца, цинка, ртути и других $13.

Однако по известному способу .невозможно получить парапротеины с нативными свойствами. Парапротеинй полностью выпадают в нерастворимый осадок, так как образуют металлоорганические соединения.

Целью изобретения является сохранение,. нативных парапротеинов и увеличения их выхода.

Для достижения цели согласно способу выделения аарапротеинов из ткани почек животных при заболеваниях

2 легких, включающему гомогенизацию ткани. почек, осаждение парапротеинов солями металлов, экстрагирование их при подкислении и диализ, осаждение парапротеинов проводят при рН 4,85,0 раствором мертиолата, а экстра-. гирование проводят из осадка последовательно при рН 3,8-4 „0 и 2,6-3,0 растворами соляной кислоты.

fl р и м е р . Почки от животных, зараженных туберкулезом, силикотуберкулезом, силикозом, и секционный материал больных туберкулезом легких перфузируют охлажденным до 0 С физиологическим растврром. Корковый слой почек (10г ) измельчают и растирают в фарфоровой ступке до гомо.-. генной массы с физиологическим раствором в отношении 1:1,5.

Полученную массу переносят в теф.лоновый (фторопластовый ) гомогенизатор и проводят гомогенизацию в течение 3 мин при 1000 об/мин. Затем гомогенат переносят в фарфоровую ступ987525 4

1О

35

3 ку, замораживают жидким азотом и оставляют в холодильнике на сетке. На следующий день гомогенату дают оттаять, переносят в пробирку и добавляют равный объем Охлажденного эфира.

Гомогенат, с эфиром встряхивают 2 мин, центрифугируют при охлаждении в течение 30 мин при 4000 об/мин. Полу-. ченный прозрачный экстракт содержит .около 30-35 г/л белка.

Для выделения парапротеинов с ос-. новными свойствами из экстракта ткани почек последний подкисляют 13-ным раствором соляной кислоты до рН 4.55,0, оставляют на 30 мин, после чего центрифугируют. Благодаря подкисленной среде из. экстракта осаждается значительная часть сопутствующих белков, нуклеопротеидов, нерастворимых частиц. Получается прозрачный белко-.вый раствор, который подвергают диализу против 0,005 -ного. раствора соляной кислоты в течение суток в холодильнике при 4 С. Затем в белковый раствор вносят 53-ный раствор мертиолата.(сулемы ) в таком количестве, чтобы довести до )i-ного раствора конечной концентрации и оставляют в холодильнике на сутки.

Такой способ обработки обеспечивает выпадение в осадок большинства белков(в том числе парапротеинов). Осадок белков отделяют центрифугированием, промывают его 6, 5/-.íûì раствором мертиолата1сулемы1 при рН 3,0.

Эту процедуру повторяют дважды. Из осадка экстрагируют парарротеины при рН 4,0, доведя его раствором соляной кислоты. Для полного извлечения парапротеинов при этом значении рН осадок оставляют на сутки в холодильнике. Осадок промывают 0,5l-ным раствором мертиолата (сулемы ) в соля; ной кислоте с рН 4,0.

Для дальнейшего извлечения napa— протеинов из осадка. белковый раствор доводят до рН 3,0 раствором соляной кислоты. В осадке остаются сопутствующие белки, не извлекаемые при рН

4,0 и 3,0. Из белковых растворов су-, лему удаляют путем диализа против

0,01-ного раствора соляной кислоты.

Белковый раствор замораживают и затем подвергают лиофилизации. Хранится препарат в сухом состоянии.

Парапротеины с основными свойствами, полученные предлагаемым способом, обладают нативными свойствами. Выход белка 0,004 r.

После осаждения белков (парапротеинов ) раствором мертиолата или сулемы осадок промывают 0,54-ным раствором мертиолата или сулемы, а затем из осадка последовательно при рН 4,0 и 2,0 извлекают паропротеины растворами, содержащими соляную кислоту. Белковый раствор подвергают диализу для удаления мертиолата или сулемы.

Растворимость белкового осадка после осаждения раствором мертиолата или сулемы и последующего диализа указывает на сохранение одного из признаков нативности белка.

Йзучают некоторые физико-химические и химические свойства выделенных белков. Определяют количество белка биуретовой реакцией, обнаруживающей пептидную связь,и по методу Лоури.Сохранение электрофоретических свойств подтверждают путем проведения электрофо реза в полиакриламидном геле. Предлагаемым методом определяется одна белковая зона.

Молекулярный вес парапротеинов определяют методом фильтрации через тонкий слой сефадекса Г-100" (размеры гранул 40-120 мк) и методомфильтрации через колонку с сефадексом

"Г-100". Для построения калибровочной кривой используют чистые белки с известным молекулярным весом (сыворо точный альбумин человека, пепсин, трипсин,. рибонуклеаза, цитохром "С", мурамидаза (лизоцин ); алыча-лактальбумин, бета-лактоглобулин.

Согласно исследованиям молекуляр4 ный вес исследуемых парапротеинов почек кроликов составляет 12400, парапротеинов почек крыс и морских свинок - 9500. формула изобретения

Способ выделения парапротеинов из ткани почек животных при заболеваниях легких, включающий гомогенизацию ткани почек, осаждение парапро--. теинов солями металлов, экстрагирование их при подкислении и диализ„ о т л и ч а ю щ и й. с я тем, что, с целью сохранения нативных парапротеинов и увеличения их выхода, осаждение парапротеинов проводят при.рН

4,8-5,0 раствором мертиолата,а. экстрагирование проводят из осадка

5 987525 последовательно.при рН 3,8-4,0 и

2,6-3,0 растворами соляной кислоты.

Источники информации, принятые ао внимание при экспертизе

1. Асатиани B.С.Методы удаления белков.из.содержащих их жидкостей.В кн.: Руководство по биохимической методике. Тбилиси, 1939,.с. 112..

Заказ 10286/32 Тираж 871 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений. и открытий

113035, Москва, 3-35, Раушская наб, д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Составитель A.Ìàêàðoâ

Редактор Н. Джуган Техред С.Мигунова. Корректор В. Прохненко