Рекомбинатные плазмиды- @ - @ ,кодирующие синтез лейкоцитарного интерферона типа @ - @ человека, и штаммы @ @ / @ - @ - @ -продуценты лейкоцитарного интерферона типа @ -f человека

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„SU;„, 1144376

151) 4 С 12 N 15/00, А 61 К 45/02

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

fl0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCKOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

АТА CTC GTQ QCA CAA ATQ QQA A»

AAQ 8АС A&A САТ 6АС. ТТТ GGA ТТС

UCQ CAG GAG GAG TTT GAT GGC

ATG ТСТ ОС CTC CAT QAQ ATC

АЯ. ACA AAG GAG TGA TGT QCT

ААА ТТТ TGC АСТМА GTT AAG

CAQ CAQ"CTQ ААТ GAG CTQ .QAA QCG TQC QTQ АТА GAS ЮАНЕ ©ТТ QQ

&TQ САА АА АСТ ССС CTQ AT@ AAT И9 9AC TCC ATG CTS QGTGTQ.

AAG ААА ТАС ТТС САА А(ь AlC ACT СТТ TAT СТ& ACA SAQ. AAQ AAA

ТАС А6С ССТ ТИ QCC Т6(0А9 GTT QTG АЗА ОСА QAA АЩ ATC AgA

ТСС ТТС ТСТ ТТА СА ААА 4ТТ ТТТ GAA QAA A@A ТТА AQQ AQg АА@

GAA ТАА ИСТС, (21) 3656867/28-13. (22) 27.10.83 (46) 07. 02.86. Бюл. В 5 (71) Ордена Трудового Красного Знамени институт биоорганической химки им.. М.M.Øåìÿêèía,. Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского и Научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. почет.

; акад. Н.Ф. Гамалеи. (72) Ю.А. Овчинников, Е.Д. Свердлов, Г.С. Монастырская, С.А. Царев, Е.М. Зайцева, И.С. Саломатина, О.Г. Чахмахчева; В.А. Ефимов, В.П. Кузнецов, В.Д. Соловьев, А.С. Новохатский; P.Ä. Аспетов, В.М. Жданов, В.M. Кавсан (53) 663.18(088.8) (56) D. Goeddel et al. "Nature", 1980» 287» 411 416 ° .ТД CAT СТ& ССТ, СА(АСС САС Ав

ААС CAQ TTC CAG AAQ QCT CAA 9СС

ATQ CAU CAG АСС ТТС AAT CTG TTC

ACT TQQ GAA CAQ AGC CTG CTA МА

Овчинников 10.А. и др. Доклады

АН СССР, 1982, 265, 238-242. (54) .РЕКОМБИНАТНЫЕ ПЛАЗМИДЫ рIFN-К-Гагр, КОДИРУЮЩИЕ СИНТЕЗ ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА .ТИПА с(-F ЧЕЛО

ВЕКА, И ШТАММЫ Escherichia coli/pIFN- (-Ftrp — ПРОДУЦЕНТЫ ЛЕЙКОЦИТАРНОГО

ИНТЕРФЕРОНА ТИПА б.-.F ЧЕЛОВЕКА., (57 ) !. Рекомбинантная плазмида

pIFN-ol-F trp1, кодирующая синтез лейкоцитарного интерферона типа . К-У человека,.характеризуется следующими признаками: имеет длину 5660 п.о.; содержит EcoRI - Hind Ш большой- фрагмент векторной плазмиды рВВ

322, ген лейкоцитарного интерферона типаЫ-F человека; локализованный ( с 1 по 505 нуклеотид и имеющий по следовательность:

И

CTG С(Т ААТ AQG А(В QGC ТТЫф

АТС ТСТ ССТ TTC ТСС TGC CTQ

1144376 регуляторную область триптофано вого оперона,содержащую промотор оператор и участок, кодирующий начало лидерной РНК без инициирующего кодона, локализованную между 4838 и 5636 нуклеотидами и присоединенную к

EcoRI сайту pBR 322, участок ДНК, соединяющий регуля торную область триптофанового оперона с геном о1,-Р и имеющий последова тельность:

AAAAAGGGTATCGC GGAATTC.ATG, участки расщепления эндонуклеаза ,ми рестрикции со следующими коорди:натами: Pvu II — 276 нуклеотид и

2543 нуклеотид Ваш I. 851 нуклеотид, Hind. III - 504 нуклеотид, Яа2Х1125 нуклеотид a PstI- - 4088 нуклеотид, генетические маркеры: tet-ген, локализованный между 506 и 1000 нуклеотидайи, ген g -лактамазы, локализованный между 3500 и 4600 нуклеотидами.

2. Рекомбинантная плазмида

pIFN- .0l-F trp2, кодирующая синтез лейкоцитарного интерферона типа

et,-F человека, характеризуется сле- дующими призчаками: имеет длину 5664 п.о.; содержит EcoR1 — Hind III боль шой фрагмент плазмиды рВВ 322, ген лейкоцитарного интерферона типа с1„-F человека, локализованный с 1 по 505 нуклеотид и имеющий последовательность:

TGT САТ CTG ССТ CAQ АСС САС АИ CT6 QQT ААТ AQQ АЬ QCC TTQ

ATA СТС CTQ QCA САА ATG QGA АЫ АТС ТСТ ССТ ТТС TQC TCCCTQ

AAS SAC АОА САТ QAC TTT ЩА TTC ССС CAP QAQ QAQ ТТТ QAT QQC

ССС ATC TCT СТС CTC CAT САС АТС

ТТС AQC АСА AAQ QAC ТСА ТСТ ЯСТ йй ААА TTT ТСС АСТ SAA СТТ ААС

АА8. САС ТТС САС ААС ССТ САА

АТС СА6 CAQ АСС ТТС AAT CTC

АСТ TQQ QAA СА6 АОС СТС СТА

GAG. СА& GTQ ААТ МС CT9 QAA

QC(TQC CTS АТА CAQ QAQ CTT 806

AAT 8ТЯ (ЙС TCC АЖ СТ9 и Т QTG

GTG- ОАА (А6. AGT ССС GTQ ATQ

АА& ААА TAG ТТС САА АСА АТС ACT CTT TAT CTQ АСА QAU AAQ ААА

TAC АЯС CGT TQT QCC TGG 9AQ STT QTG AQA ЬСА QAA AT& ATQ AQA

TCC TTC. ТСТ ТТА ТСА ААА АТТ ТТТ САА 9АА А&А ТТА АИИ АьЫ AAG

3. Рекомбинантная плазмида р?РИ-д-F trp3, кодирующая синтез лейкоцитарного интерферона типа

9AA TAA AGTCå регуляторную область триптофанового оперона, содержащую промотор, оператор и участок, кодирующий начало лидерной РНК без инициирующего кодо на, локализованную между 4838 и

5640 нуклеотидами и присоединенную к EcoRI сайту pBR 322, участок ДНК, соединяющий регуляторную область триптофанового оперо на с геномс -F и имеющий последова-, тельность:,, AAAAAGGGTATCGC GGAATTAATTC ATG, участки расщепления эндонукле азами рестрикции со следующими координатами: Pvu II - 276 нуклеотид и 2543 нуклеотид Ваш I - 851 нукле отид, Hind III — 504 нуклеотид,,SaE C - 1125 нуклеотид, PSt i4088 нуклеотид, генетические маркеры: tet-ген, локализованный между 506 и 1000 нуклеотидами, ген р-лактамазы, локализованный между 3500 и 4600 нуклеоти дами °

1144376 .Ф ф-F человека, характеризуется следующими признаками: имеет длину 5556 п.о.; содержит ЕсоВТ-Hind III большой

Фрагмент векторнойплазмиды pBR 322

1 ген лейкоцитарного интерферона типа g-F человека, локализованный с 1 по 505 нуклеотид и имеющий последовательность:

T&T SAT CTG CCT CAG- АСС CAC AK CTG G6T AAT A86 AGO KC TT6ATA СТС CTQ и А САА ATS 98A ASA АТС TCT ССТ TTC ТСС TK CTt

AAG-6AC АИ. САТ ИС ТТТ QGA TTC СС(: CA9 &AQ GAP TTT SAX QGC

ААС CAG ТТС GAG AAG KT САА SGC АТС ТСТ 9TG CTC CAT QAQ ATGATC CAG CAG- АСС ТТС ААТ СТС ТТС АЗС АСА ААЬ ЬАС ТСА ТСТ и Т

ACT TGb ЬАА CAG- ABC CTC CTA ИА ААА TTT ТСС ACT QAA CTT ААС

CAB CAB CT& ААТ SAC СТ ЫА ЯСС TGC ЯТ& ATA CAG (rA9 QTT bBG

I TG tAA GAG АСТ CCC CTQ ATG- AAT GTS GAC ТСС АТС СТО. QCT QTC

ААЮ ААА ТАС ТТС САА АСА АТС АСТ СТТ ТАТ СТЬ АСА ЯАО АА(ААА

ТАС АЖ ССТ TST GCC T86 GAS CTT 9TC AGA 9СА ьАА AT9 ATS ASA

ТСС ТТС ТСТ ТТА ТСА AAA ATT ТТТ САА МА A&A TTA АЯЫ А4Я AAQQAA ТАА АСТС, TGTQAT СТС CCT CAQ АЗС GAG ASC CTL KT AAT А66 AGO GCC TTgATA СТС СТЬ KA САА АТ& ИЙ.А&А АТС TGT GGT TTC TCC TGC CTg

AAG- &AC АИА САТ МС ТТТ 8ЬА TTC ССС САЯ йй-GAG TTT И,Т gg{; регуляторную область триптофанового оперона; содержащую промотор, оператор и участок, кодирующий начало лидерной PHK без инициирующего ,.кодона, локализованную между 4838 и 5636 нуклеотидами и присоединен ную к Есор сайту рВВ 322, участок ДНК, соединяющий регуляторную область триптофанового опе рона с генома-F и имеющий последо»вательность:

AAAAAGGGTATCGCCAC ATG, участки расщепления эндонуклеазами рестрикции со следующими координатами: Pvu II - 276 нуклеотид и 2543 нуклеотид, Ham I — 851 нук леотид, Hind Ш - 504 нуклеотид, Sal4. — 1125 нуклеотид, РЯМ - 4088 нуклеотид, генетические маркеры: tet-ген, . локализованный между 506 и 1000 нук леотидами, ген Р -лактамазы, локализованный между 3500 и 4600 нуклеоти дами.

4. Рекомбинантная плазмида

pIFN-<-F trp4, кодирующая синтез лейкоцитарного интерферона типа

g-F человека, характеризуется следу ющими признаками: имеет длину 5655 п.о.; содержит KcoRI — Hind III боль" шой фрагмент векторной плазмиды р11В 322, ген лейкоцитарного интерферона типад F человека, локализованный с 1 по 505 нуклеотид и имеющий по следовательность:

1144376.ААС CA& ТТС CA& ААС. OCT САА ЬСС ATC TCT 6ТС СТС CAT ЬАС- А76

АТС СА9 СА1 АСС ТТС ААТ СТС ТТС AGC АСА AAQ- GAC ТСА TCT 6CT

АСТ TGQ GAA СА& AGC СТС СТА GAA ААА ТТТ ТСС АСТ GAA CTT ААС

CAQ. CAt CTG-AAT 6АС СТ6- GAA GCC TQG ITQ- АТА CAG-GAG QTT йй

GTG- ЬАА GAG-ACT CCC СТО АТ6- ААТ СИ- GAC ТСС АТС CTO6CT CTG ААС ААА TAC ТТС. САА АСА АТС АСТ UTT ТАТ СТ(» АСА цА(AAG AAA TAC А6С ССТ TQT 6СС Т66 МИ 9ТТ 9TC AGA 9,A 6АА АТС

ATG AGA ТСС TTC ТСТ ТТА ТСА AAA ATT ТТТ САА QAA А6А,ТТА А66

AGCY AAG- ИА TAA АСТС, генетические маркеры: tet-ген, локализованный между 506 и 1000нуклеотидами, ген Р -лактамазы, локализованный между 3500 и 4600 нуклеотидами.

АТЬ СТС GT9 GCA CAA АТ6. и А

AAG- GAC АИ CAT 6AC ТТТ GGA TTC СИ CAG. ЫАь 6A9 TTT ЫАТ йС

AAC CAQ- TTC CA6- АА(Ж Т САА ЯСС АТС ТСТ GTC СТС САТ GAL ATG

АТС GAG- CAt АСС ТТС ААТ СТС TTC AQÑ АСА АА4 ЬАС ТСА ТСТ ЯСТ

AGT Т66- 6АА GAG. АИ; СТС CTA ЙИ ААА ТТТ ТСС ACT ЮА СТТ ААС

GAG- GAG- CTO AAT GAC CT6. GAA GUG TbG GT& АТА САЬ (Ab 4ТТ ЫИ3

&TO- САА GAG AGT ССС СТ6 ATG. AAT ST@ SAC ТСс НТС СТ(6СТ ЫТСAAG ЬАА TAC ТТС CAA АСА АТС ACT СТТ TAT СТ& АСА 0АС ААЫ-ААА

ТАС AK ССТ TbT ИЖ T80. MG- ИТ CTG АИ МА UAA АТЫ-AT(АSA

TCC TTC TGT TTA TGA AAA ATT i Т САН ОЙН АЫ ТТА Айт АЖ AAC

GAA ТАА АСТС, регуляторную область триптофанового оперона, содержащую промотор, оператор и участок, кодирующий начало лидерной PHK без инициирующего кодона, локализованную между 4838 и 5636 нуклеотидами и присоединенную к EcoRI сайту pBR 322, участок ДНК, соединяющий регуляторную область триптофанового оперона с генома -F и имеющий последовательность:

AAAAAGGGTATCGCCA ATG, участки расщепления эндонуклеазами рестрикции со следующими координатами: Pvu II — 276 нуклеотид и

2543 нуклеотид, Вагй — 851 нуклео тид, Hind III — 504 нуклеотид, Safi - 1125 нуклеотид, PStf. - 4088 ZQT GAT СТ& ССТ GAG. АСС САС

5. Рекомбинантная плазмида р?РЯ-о(-F trp5, кодирующая синтез лейкоцитарного интерферона типао(-F человека, характеризуется следующими признаками: имеет длину 5652 п.о.; содержит ЕсоМ вЂ” Hind III большой фрагмент векторной плазмиды

pBR 322, ген лейкоцитарного интерферона типао(-F человека, локализованный с 1 по 505 нуклеотид и имеющий по» слЬдовательность:

Ай GTG и Т ААТ А(М. AC(И"С TTC

Ф

А&А АТС ТСТ ССТ ТТС ТСС ТМ, СТ8

1144376

15 регуляторнув область триптофанового оперона, содержащую промотор, оператор и участок, кодирующий начало лидерной PHK без инициирующего кодона, локализованную между 4838 и

5636 нуклеотидами и присоединенную к EcoRI .сайту рВВ 322, участок ДНК, соединяющий регуляторную область триптофанового оперона с геном@-F и имеющий последовательность:

АААААСССААТТС ATG> участки расщепления эндонуклеаза-.ми рестрикции со следующими коордз натами: Pvu II - 276 нуклеотид, 2543 нуклеотид, Вагй — 851 нуклеотид,.

Hind III - 504 нуклеотид, Ба1 .1—

1125 нуклеотид, PSti — 4088 нуклеотид, генетические маркеры: tet-ген, локализованный между 506 и. 1000 нуклеотидами, гено(-лактамазы, локали зованный между 3500 и 4600 нукле отид.

6. Штамм Escherichia cali/ pIFN-o(-F Ьгр1 ЦМПМ В-2885 (коллекция

Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов "ВНИИ

Изобретение относится к микро» биологической промышленности, моле кулярной биологии и генетической инженерии и представляет собой серию сконструированных in vitro рекомби нантных плаэмид,обуславливающих син. тез одного из интерферонов челове ка - лейкоцитарного интерферона типа

aL У в клетках кишечной, палочки

Е.coli., и штаммы Е.coli — проду центы данного интерферона.

Известна рекомбинантная плаз,мида, кодирующая синтез лейкоцитар ного интерферона типао -А человека и штаммы E ° coli, содержащие эту плазмиду - продуценты интерферона типао(-А человека.

Ф

Указанная рекомбинантная плазмида состоит из гена интерферонаЫ-А и триптофанового промотора, котоГенетика" ) - продуцент лейкоцитарного интерферона типас(-Р человека.

7. Штамм Escherichia coli/pIFN-с(-F trp2 ЦМПМ B-2886 (коллекция

Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции про" мьппленных микроорганизмов "ВНИИ Генетика") - продуцент лейкоцитарно

ro интерферона типао(-F-человека.

8. Штамм Escherichia coli/рТРЧ-ф-F trp3 gNIIN В- 2887 (коллекция

Всесоюзного научно-исследовательского-института генетики и селекции промьппленных микроорганизмов "ВНИИ

Генетика" ) - продуцент лейкоцитар ного интерферона типас -Р человека.

9. Штамм Escherichia coli/ pIFN-с(-F trp4 ЦМПМ В-2888 (коллекция

Всесоюзного научно исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов "ВНИИ Ге нетика") - продуцент лейкоцитарного интерферона. типас1 -F человека.

10. Штамм Escherichia coli/ pIFN-с(-Р t rp5 ЦМПМ . В-2889 (коллекция

Всесоюзного научно-исследовательско го института генетики и селекции промьппленных микроорганизмов "ВНИИ

Генетика" ) - продуцент лейкоцитарного интерферона типас(-F человека, 2 рые встроены в векторную плазмиду

pBR - 322.

Однако уровень синтеза интерфе" . рона в штамме Е.coli, содержащем эту рекомбинантную плазмиду, недо статочно высок - 2,5 10 единиц ак» тивности с 1 л ба .териальной сус» пензии.

Наиболее близким к предлагаемому. изобретению по технической сущнос ти и достигаемому результату явля» ется рекомбинантная плазмида

pTMKS — .jPN — F - 71, кодирующая синтез интерферона типао -У чело века, и штамм Е.coli, содержащий эту плазмиду — продуцент интерферо на типа ot,-Г человека

Рекомбинантная плазмнда рТМК$-1РИ-Р-71 состоит иэ следующих эле» ментов: EcoR1.-Hind III - большого фрагмента векторной плазмиды pBR-322, 44376

I . TST SAT СТ& 6СТ САЬ AGC CA(AC(СТС- ССТ ААТ

AQG ASS SCG TTG ATA CTC STG. QCA CAA АТО- GGA AQA ATC TGT

CCT TTC ТСС TSC CTQ- АА6 GAC ASA CAT SAC ТТТ GbA TTC GCC

CAG-. GAG &А6 ТТТ SAT SGC ААС GAG ТТС СА6 AAG- GCT САА 9СС

АТС TCT GTG CTG САТ GAG- ATG ATG CAS САЯ АСС TTC AAT CTG

ТТС,AQC ACA AAS- SAC TCA ТСТ QGT ACT TK ИА СА6 АЗС CTG

СТА 8АА ААА ТТТ TGG АСТ GAA СТТ ААС CAG CAQ. CTS ААТ GAG

CTG. SAA GCG T6C GTS АТА СА6 SAG GTT ИВ ST9 МА GAG ACT

ССС СТ8 АТ9 ААТ CTS SAC TGC АТС CTG ЬСТ GTQ AAG ААА ТАС

TTC САА АСА ATC АСТ STT ТАТ СТВ АИ И6 ААС ААА TAG AGC

ССТ TQT SGG TS9 6А8 STT QTC АМ 8СА MA АТС АТБ. АМ ТСС

TTG ТСТ ТТА TGA ААА ATT TTT САА ИА AM ТТА AGQ АЮ ААС.

ИА TAA АСТС

3 11 регуляторного участка триптофаново»

ro оперона Е.coli,содержащего промотор, оператор и участок, кодирующий начало лидернбй PHK без инициирующего кодона, и присоединенного к ЕсоИ..сайту ðBR-322; гена лейкоцитарного интерферона типац -F человека, реконструированного для прямой экспрессии в клетках Е.coli, - участка ДНК, соединяющего регуля торный участок триптофанового оперона с геном d-F и имеющего следующую последовательность:.

ААААА666ТАТСОССА66ААТТС ATG .

Уровень синтеза интерферона в штамме Е.coli, содержащем рекомби нантную плазмиду рТИК$-ЛГИ Р71, со ставляет 10 - 10 ед. активности в интерферона с 1 л бактериальной сус" пензии при ее плотности А =, 1.

Недостатком рекомбинантной плазмиды pTMKS-IFN-F-71 является недо статочно высокий выход интерферона с -F, регуляториую область 1риптофано, вого оперона, содержащую промотор, оператор и участок, кодирующий на чало лидерной PHK без инициирую .щего кодона, локализованную между

4838 и 5636 нуклеотидами и присоеди ненную к EcoRI сайту pBR 322, Целью описываемой группы изобретений являются новые рекомбинантные плазмиды, кодирующие синтез лейкоцитарного интерферона типа о, -F чело века, и штаммы Е.cali содержащие эти плазмиды - продуценты лейкоци тарного интерферона типаЖ-F челове ка, обеспечивающие более высокий вью" ход интерферона.

Поставленная цель достигается новой рекомбинантной плазмидой

pIFN-6-Ftrp 1, кодирующей синтез лейкоцитарного интерферона типа с -Е человека, которая характеризуется следующими признаками: имеет длину 5660 п.о.; содержит: EcoR1 - Hind III большой фрагмент векторной плазмиды

pBR 322, ген лейкоцитарного интерферона типаol-F человека, локализованный с 1 по 505 нуклеотид и имеющий последовательность: участок ДНК, соединяющий регуля торную область триптофанового опе . рона с геиомс -У и имеющий последова"

55 тельность:

AAAAAGGGTATCGCGGAATTC ATG, участки расщепления эндонуклеазами рестрикции со следующими коор

1144376

Поставленная цель достигается также новой рекомбинантной плазми дой pIFN-c(-F-trp, кодирующей син- .. тез лейкоцйтарного интерферона типа (-Р человека, которая характеризуется теми же признаками,. что и рекомбинантная плазмида pIFN-(-F-Ъгр 1

S но имеет длину 5652 п.о. и следующую последовательность участка

ДНК, соединяющего регуляторную об пасть с геномat,-F:

АААААСОСААТТС ATG, динатами: Pvu II - 276 нуклеотид и 2543 нуклеотид, Bam I - 851 нуклеотид, Hind III. - 504 нуклеотид, Sall - 1125 нуклеотид и Pstf .- 4088 нуклеотид.

Генетические маркеры: tet-ген

1чокализован между 506 и 1000 нуклеотидами, ген р-лактамазы локализован между 3500 и 4600 нуклеотидами.

Поставленная цель достигается так- же новой рекомбинантной плазмидой

nIFN-ô-Ftrp2, кодирующей синтез лей." коцитарного интерферона типа 4.-Р человека, которая характеризуется теми же признаками, что и рекомбинант ная плазмида pIFN-ol-Ftrpl, но имеет длину 5660 п.о. и иную последова тельность участка ДНК, соединяющую 20 регуляторную область с геномо(-Р

ААйАА666ТАТСОСССААТТААТТС ATG, Поставленная цель достигается так" же новой рекомбинантной плазмидой рХРИ -Ftrp 3, кодирующей синтез . 25 лейкоцитарного интерферона типа о1=Р человека, которая характеризуется теми же признаками, что и рекомбинантная плазмида pIFN-C-Ftrp 1, но имеет длину 5656 п.о. и следующую по следовательность участка ДНК, со» единяющего регуляторную область с г еномб -F:

ААААА(rGGTATCGCCAC ATG, Поставленная цель достигается также новой рекомбинантной плазмидой

pIFN-at-F-trp4, кодирующей синтез лейкоцитарного интерферона типа -F человека, которая характеризуется теми же признаками, что и рекомби нантная плазмида рТРЯ-<-Ftrpl, но имеет длину 5655 п.о. и следующую последовательность участка ДНК, соединяющего регуляторную область с генома-Р:

AAAAAGGGTATCGCCA ATG, Новые рекомбинантные плазмиды

pLFN-d.-Ftrp отличаются от извест ной плазмиды pTMKS-IFN-F-71.последовательностью участка ДНК, соединяющего регуляторную область триптофанового оперона с геномо(-F.

Поставленная цель достигается так же mxam«aMv Escherichia coli/pIFN— g-Ftrn3. ПМПМ В 2885, Escherichia

coli/рХРИ-с -Ftrp2 ЦМНМ В 2886, Esche richia coli/pIÐN 4-F trp 3 ЦМПМ

В 2887, Escherichia coli/pIFN-g-F trp 4 11МПМ В 2888, Escherichia

coli/р?РИ-<-F trp 5 ЦМПМ В 2889.. (коллекция Всесоюзного научно ис следовательского института генетики и селекции промышленных микро организмов "ВНИИ Генетика" ), кото» рые являются продуцентами лейкоцитарного интерферона типа с(-Р чело века.

Уровень синтеза интерферона при этом достигает 5".10 — 2 "1О ед. активности с 1 л бактериальной суспензии, что в 5-200 раз вышее, чем при использовании известного штамма, содержащего плазмиду рТМКЯ— П Ы-F-71.

Способ конструирования рекомбинантных плазмид для экспрессии состоит в следующем. В качестве ис» точника гена интерферона at.-Р служит плазмида р2РЯ-а(-Р pre, представляющая собой плазмиду рВВ-322 в Hind III сайт которой вставлен ген интерферона at.-Р (IFN-F), после. довательность которого приведена на фиг. 1. Этот ген вырезают из плазмиды с помощью рестрикционной эндонуклеазы Hind III и реконстру ируют для прямой экспрессии в соответствии со схемой, приведенной на фиг. 2 ° Для этого ген неполностью расщепляют рестрикционной эндонуклеазой ЯаиЗА1 и путем электрофореза в полиакриламидном геле выделяют его С-концевую часть "А".

Эта часть лишена триплета TGT, кодирующего первую аминокислоту зрелого интерферона — цистеин. Для того, чтобы сконструировать полный ген, синтезируют химическим путем фраг» мент ДНК (как изображено на фиг. 2), в структуре которого содержится кодон TGT, предшествующий ему инициаторный кодон ATG, а также два выступающих липких" конца, соответст,вующих концам, образующимся при рас1144376 щеплении ДНК рестрикционными эндонуклеазами Есо81 (слева) и ВаиЗА1 (справа). Присоединение этого фрагмента к части "А" гена интерферо5 на, осуществляемое с помощью ДНКлигаэы фага Т4, дает полный ген с отсеченным фрагментом; кодирующим сиг нальный пептид. Ген снабжен иници аторным триплетом ATG и "липкими" 10 концами, соответствующими рестрикци онным эндонуклеазам EcoRI (слева) и Нкпс? III (справа). Для стабиль ного хранения и воспроизводства гена в клетках Е.coli конструируют плаз миду рХГМ-0(-Р-0 (фиг. 3), в которой ген не экспрессируется. С этой це лью плазмиду pBR-322 расщепляют рест рикционными эндонуклеазами EcoRI и Hind III è лишенный промотора вы деленный большой фрагмент соединяют с помощьв ДНК-лигазы с полным геном., Штаммы Е. coli, содержащие эту плаз миду, стабильно воспроизводят ее.

Они устойчивы к антибиотику ампицию . 25 лину и чувствительны к антибиотику тетрациклину. Ген 1ГИ-МГ:может быть .вырезан из плазмиды pfFN -Г- 0 с помощьв расщепления рестрикционными эндонуклеазами EcoR? и Hind ХХХ.

В качестве первичного вектора для встраивания гена ХРБ-ОИ под контроль триптофанового промотора исполь" зуют плаэмиду ptrp Eco, генетическая и рестрикционная карта которой, а также первичная структура участка, окружающего место расщепления рестрикционной эндонуклеазой ЕсоМ и включающего часть регуляториой области триптофанового оперона, приведена 4п на фиг. 4.

Способ конструирования рекомбинант ной плаэмнды рХГМ-4-РФгр1 заключает

1 ся в том, что плазмиду p3FNM Р"О, содержащую реконструированный ген ин-45 . терферона,К-Р, и плазмиду ptrp Eco расщепляют рестрикционными эндонуклеазами Есо81 и ЯаРГ, образующие фрагменты лигируют с помощью ДНК ли газы, полученной смесью рекомбинант 5О ных молекул трансформируют клетки . штамма EcoIiK802 или Ecoli HBl01 или Ecoli 294, и из клонов, устойчи вых к тетрациклину, отбирают целе вую нлазмиду (cM. фиг. 5).

Для получения рекомбинантной плазмиды p3FN -Ftrp2 плазмиду

p3FN -Р 1гр1 расщепляют рестрик ционной. эндонуклеазой EcoR1 лип кие концы заполняют ДНК-полимеразой и лигируют с помощью ДНК-лига зы фага T4 °

Для получения рекомбинантных плазмид pjFN - ГСгр3 .и р1ГИ-К-F

trp4 плазмиду p.lFN -F trpl. рас» щепляют эндонуклеазой рестрикции

ЕсоВХ, обрабатывают эндонуклеаэой

S а затем лигируют с помощью ДНК» пигаэы фага Т4.

Рекомбинантную плазмиду pfFNф-F trp5 конструируют из большого фрагмента, полученного расщеплением плазмнды р1гр Есо рестрикционными эндонуклеазами EcoR1 и ЯаЕ1 с последующим удалением ÅñoR1-липкого кон ца обработкой Б„ нуклеазой, и мало го фрагмента, полученного при рас щеплении плазмиды p3FN -F Ьгр1, рестрикционньми эндонуклеазами EcoRk и БаГ1 с последующим заполнением

EcoR1-липкого конца ДНК-полимеразой фага Т4 в присутствии четырех дезок" синуклеоэидтрифосфатов, путем лигирования этих фрагментов с.помощью

ДНК-лигазы фага Т4.

Анализ полученных рекомбинантны

ДНК проводят с помощью рестрикционных эндонуклеаз EcoR1, Pauli, Hind

III BamHf Sale.

Для получения нтаммов-продуцен тор интерферона с(-F человека реком бннантные плазмиды рХГН -F trp трансформируют в штамм Е.coli К802 (gal К, lac У, met, hsr, hsm+ }.

Для получения штамма-продуцента

Е.coli/pZFN - F trp1 ЦМПИ В 2885 рекомбинантнув плазмнду р1ГИ-с -Ftrpl трансформируют в штамм Е.coli К802.

Для получения штамма продуцента

Е.coli/pIFN-g-F trp 2 ЦИПМ В 2886 рекомбинантнув плазмиду рiFNW-F trp2 трансформируют в штамм Е.coli К802.

Для получения штамма-продуцента

Е.coli/plFN -Г 1 р 3 ЦМПИ В 2887 рекомбинантнув плазмиду рХГИ" &-F

1грЗ трансформируют в штамм Е.coli

К802.

Для получения штамма»продуцента

Е.coli/pjFNW-F trp4 ЦМПМ В 2888 рекомбинантнув плазмиду р1ГНМ-. F

trp 4 трансформируют в штамм Е.coli

К802.

Для получения штамма продуцента

Е.coli/pfFNcI;F trp5 1961M В 2889 рекомбннантнув плазмиду РХГИ-Ф-F

1144376

trp5 трансформируют в штамм Е.coli

К802.

В качестве штаммов реципиентов могут быть использованы также штаммы Е.coli НВ и Е.coli 294.

При функционировании промотора триптофанового оперона (trp) в составе рекомбинантных плазмид рХРИ-д-F trp штаммы, содержащие эти рекомбинант- 1р ные плазмиды, имеют фенотип ApIc и синтезируют интерферон. Используе- мый промотор триптофанового оперона содержит триптофановый оператор и регулируется путем взаимодействия триптофанового репрессора с этим опе. ратором, которое меняется в зависимости от присутствия в среде трипто- . фана и индуктора - -индолилакриловой кислоты. В присутствии триптофа- 2п на репрессор связан с оператором и экспрессия гена интерферона незначительна, что позволяет исключить возможную роль интерферона как инги битора роста и деления клеток. При 25 пониженной концентрации триптофана или добавлении индуктора репрессор теряет сродство к оператору и промотор начинает функционировать вследствие чего инициируется синтез 30 интерферона. В качестве метода ин дукции используют снижение концент рации триптофана в среде. Для этой цели клетки растят вначале в богатой триптофансодержащей среде LB, à затем разбавляют в 25 раз синтетической средой М9 с добавлением казами новых кислот.

Штаммы, содержащие рекомбинант» ные плазмиды pIFN-д(-F trpb, pfFN-с1-7 trp2, pfFN -F 1гр3, pIFN -7

trp4 и рХРЯ-й-F trp5, отличаются от штамма-реципиента E.coli К802 только по признакам, придаваемым плаэмидой т.е. являются ампнциллин» 45 и тетрациклин устойчивыми и синте зируют интерферон. Штаммы Е.coli/

/pIFN-@-Г trp характеризуются сле" дующими признаками:

1. Морфологические признаки

Клетки прямые, палочковидной формы, 1,2-1, бх2, Ох6,0 мк, подвижные, с перитрихиальными жгутиками, rp отрицательные, неспороносные..

2. Культуральные признаки

Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на питательных агарах LB колонии глад кие, круглые, блестящие, край ров ный, при одинаковых условиях более мелкие, по сравнению с колониями изогенных штаммов Е.coli содержаЮ

1 щих плазмиду pBR-322. При росте в жидких средах - LB и M9 - с добавлением казаминовых кислот образуют равномерную муть.

3. Физиолого-биохимические признаки

Клетки растут в пределах от 4 до 42 при рН 6,8-7,5. В качестве источника углерода используют углеводы и аминокислоты. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические. соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот.

4. Устойчивость к антибиотикам .

Штаммы, содержащие рекомбинантные плазмиды р?РБ"о(-Р игр в условиях репрессии триптофанового промотора, т.е. на богатых средах, устойчивы к ампициллину (до 100 мкг/мл при росте на твердой среде) и в незначительной степени к тетрациклину (10 мкг/мл). В условиях индукции промотора устойчивость к ампициллину сохраняется на прежнем уровне, устойчивость к тетрациклину возрастает до 80.мкг/мл в среде М9.

-5. Стабильность плазмиды в штаммах

При поддержании штаммов в течение одного года в присутствии ампицилли" на не наблюдается перестройки или утери плазмид.

Изобретение иллюстрируется сле дующими фигурами графических изобра жений.

Фиг. 1. Нуклеотидная последовательность клонированного гена человеческого лейкоцитарного интерферо на и его амннокислотная последовательность. Приведена последовательность комплементарной цепи ДНК, адекватная последовательность мРНК.

Амннокислотная последовательность зрелого интерферона дана прописны мн буквами, а части, соответствующей предшественнику, - строчными.

Фиг. 2. Схема реконструкции гена интерферонас1.-У для его прямой экспрессии в клетках Е.coli.

Фиг. 3. Схема получения и рестриктная карта неэкспрессирующей

1144376

12. плазмиды р1УН-А-F-О, содержащей ген интерферона с(-У.

Фиг. 4. Генетическая и рестрикт ная карта исходнои экспрессирующей плазмиды ytrpEco и последовательность промоторно-операторного участка trp оперона Е.coli используемого в качестве сигнального эле мента. Стрелка указывает начало и направление транскрипции. Подчеркну" та последовательность названная в тексте собственно промоторной. Предполагаемый участок Шайи-Дальгарно обведен, !5

Фиг. 5. Схема конструкции экспрес" сирующей плазмиды р1РИ-сi-F trpl u ее физико-генетическая карта. Зачернен участок, кодирующий интерферон o(.-F.

Пример 1. Получение рекомбинантной плазмиды рН 1-с(-Fti.pl.

Для получения плазмиды рIF> -Fjrp1

1 мкг сконструированной плазмиды р1Рм-с(.-F-О, содержащей полный ген

4FN -F, расщепляют 2 ед. рестрикци онной эндонуклеазы Есор и 2 ед.

Sall.,1 Мкг плазмиды ptrp .Есо расщеплявт 2 ед. EcoHI и 2 ед. Sall.

Смесь расщепленных плазмид прогре вают при 74 С в течение 10 мин. Затем добавляют IО мМ АТФ до концентрации 200 И, лигазный буфер (66 мМ трис-НСI, рН 7,5, 5 мМ М С1, 5 мМ

ДТТ), 1 ед. лигазы и инкубируют при

15 С в течение 18 ч. Полученной смесью ДНК трансформируют клетки

Е.coli.

1. Получение компетентных клеток.

10 клеток со свежего ночного ко9 сика суспендируют в 5 мл LB среды.

К 100 мл /.В среды, содержащей

50 мкг/мл тимидина, добавляют 1 мл смыва с косяка и подращивают на качалке при 37 С до плотности А о 0,6.

Суспензив охлаждают 15-20 мин во льду и клетки собирают центрифуги» рованием при 4 С (4000 об/мин, 5 мин центрифуга К-23, planets Ку). Затем клетки суспендируют в 50 мл холодно- 5О го раствора, содержащего 60 мМ CaCI, 10 мИ МОРЯ, рН 7,1, .0,5Х глюкозы и

50 мкг/мл тимидина, инкубируют в этом растворе 5 мин при О С, центрифугируют в указанном выше режиме и суспендируют в 5 мп того же раствора. Выдерживают 1 ч при О С.

2 ° Процедура трансформации.

К 100 мкл раствора ДНК (0,010,1 мкг) добавляют 200 мкл полученных компетентных клеток и инкубируют вначале при 0 С в течение 5 мин, а затем при 42 С в течение 2 мин.

Смесь разбавляют 1 мл LB среды и подращивают на качалке при 37 С в течение 45 90 мин. Затем высевают на чашки Петри с 1,5Х агаром Hà LB среде и необходимым антибиотиком (ампициллин -. 50 мкг/мл, тетрациклин 20 мкг/мл) и инкубируют при

37 С в течение ночи.

3. Получение реплик.

Клеточную суспензию после транс формации высевавт непосредственно на фильтры HATF 29325 (Milli@ore, диаметром 10 см), которые помещают на . на чашку Петри с агаром и соответствующим антибиотиком, инкубирует ночь при 37 С. Для получения реплики на стекло помещают стерильный лист

Ватман ЗММ фильтр HATF с выращенными колониями, чистый фильтр HAT% лист

Ватман и покрывают еще одним стеклом. Сверху помещают груз весом 1 кг. выдерживают в течение 10 с. Нитроцеллвлозные фильтры разъединяют, и фильтр с реплицированными колониями переносят на чашку Петри с агаром.

Чашку инкубирувт при 37 С в течение

3-6 ч, после чего фильтр. переносят на чашку с агаром, содержащем 200 мкг/мл хлорамфеникола и инкубируют ночь при 37 С. 4. Обработка фильтров. . Лист Ватман ЗМИ пропитывают 0,5М

ga0H, помещают на него нитроцеллвлозные фильтры с реплицированными ко" лониями и выдерживают 10 мин. Фильтры снимают с листа Ватмана, под сушивают на воздухе и повторяют ука, занную процедуру. После сушки фильтры помещают на лист Ватмана ЗИМ, пропитанный IN ацетатом аммония, выдерживают 10 мин, сушат и повторяют указанную процедуру. По окончании обработки фильтры сушат в ваку умном шкафу при температуре 80 С в течении 4 ч.

5. Гибридизация.

Высушенные фильтры замачивают в 1 мл раствора, содержащего 0,75М

NaCI; 0,15М трис; рН 8,0; 0,5 мИ

ЭДТА; 0,02Х фикола; 0,02Х поливинил пироллидона; 0,02Х альбумина; О,IХ додецилсульфата натрия; 250 мк тРНК;

0,5- 2i10 имп/мин синтетического

13!! 44176

14 ки Е.coli и отбирают клоны, как описано в примере 1. Девяносто полученных клонов анализируют на интерфероновую активность. Из двух клонов, проявивших наиболее высокую противовирусную активность, выделяют плазмиды, в которых определявт последовательность участка между собственно промоторной областьв и началом гена.

Пример 4. Получение рекомбинантной плазмиды plFN -У1гр5. а) мкг плазмиды РСгрЕсо расщеп" ляют рестрикционной эндонуклеазой

Eco01 (! ед.) и инкубируют с ДНК-полимеразой (0,5 ед.), как описано в примере 2, но вместо смеси четырех дезоксинукзеозидтрифосфатов исполь зуют только один дезоксигуанозин трифосфат. ДНК осаждают спиртом и ин кубирувт с Я„ нуклеазой, как описано в примере 3 ° ДНК высаживают спиртом, растворяют в буфере для рестрикции S aE1 и рестрицирувт как в при мере 1. б) Плазмиду pIFNM-F--0 расщепляют рестрикционной эндонуклеазойEcoRl, и липкие концы заполняют ДНКполимеразой фага Т4, как описано в примере 2. Полученную ДНК расщепляют рестрикционной эндонуклеазой Б ай! в) Смесь расщепленных плаэмид (по 1 мкг каждой) лигирувт и трансформируют ев клетки Е.co!. i K802, высевая трансформанты на нитроцеллю лозные фильтры. Отбирают Ар" Тс" трансформанты, гибридизувщиеся с оли" гонуклеотидиым зондом, как описано в примере 1. Плазмиду р1 1 с1-F р5 из одного полученного клона анализируют по последовательности участка между регуляторной промоторной об» ластью и началом гена.

Пример 5. Получение штаммов продуцентов лейкоцитарного интерфе ронас1.-F человека.

Рекомбинантные плазмиды р1Р! !"4-B p вводят в штамм Е.coll K802, как описано в примере 1,,и получают штаммы-продуценты лейкоцитарного ин-, терферонас! - F человека с активностя ми, указанными в таблице.

30 гексадекануклеотида, комплементарного фрагменту гена 1Р%"с -F. Фильтры запаивавт в пол: этиленовый пакет, инкубирувт 30 мин при.температуре 55 Ñ, затем плавно опускают температуру до 37 С и инкубируют ночь при этой температуре. По окончании .инкубации фильтры четырежды отмывают в растворе, содержащем

0,2М трис РН 8,0; 0,5М NaC1 0,5Х додецилсульфат натрия при 37 С в те- чение 15 мин, используя по 10 мл раствора на каждый фильтр. Между от мывками фильтры сушат на воздухе. 15

Высушенные фильтры радиоавтографи руют при комнатной температуре в течение ночи, используя рентгеновскую пленку PT-1.

Гибридизующиеся клоны наращивают в 3 мл ЬВ среды, выделяют плазмидную ДНК щелочным способом и подвергают ее рестрикционному ана лизу. Выявленную таким образом плаз миду р1ГИ-М-F trpb нарабатывают в 25 количествах, достаточных для анализа первичной структуры, которую определяют по модифицированному методу Максама-Гилберта.

Пример 2. Получение ре» комбинантной плаэмиды р1FN-c!Ftrp2.

1 мкг плазмиды УРН-с(-7 trpl pac щепляют рестрикционной эндонуклеазой Ecol 1, (! ед.) липкие концы до ,страивавт ДНК-полимеразой фага Т4 в буфере, содержащем 20Мм трис, РН 7,6; 10мМ MSCl > 1 мМ ДТТ; по

501 М каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и 0 ° 5 ед. ДНК» полимеразы hara Т4. Обработку прово,щ дят.при 37 С в течение 15 мин. 3атем "добавляют ДНК-,пигазу (5 ед.), по. лученной смесью ДНК трансформируют клетки E.co1i и отбиравт клоны, как, описано в примеРе 1. В результате 45 получают плазмиду p1FN -Ftr 2 °

Пример 3. Получение рекомбинантных плазмид р1УИ-с -У1;грЗ и

РЪ"Я" -F trp4.

I мкг плазмиды pIFN -Ftry4 pac» . щеплявт рестрикционной эндонуклеазой ЕсоИ (! ед.) и инкубируют в те чение 30 мин при 22 С в присутствии

Sq-нуклеазы (1 ед.) в буфере, со держащем О,ЗМ ИаС1; 4,5 ИЕпС1 ;

30m M ацетата натрия, рН 4,6, а затем сшивают с помощьв ДНК-лигазы фага Т4 (5 ед.), трансформируют клет .

Активность определяют методом ин гибирования цитопатического действия вируса везикулярного стоматита на диплоидные фибробласты человека.

Таким образом, новые рекомбинант ные плазмиды РЛДН-4-Ипр и штаммы

1144376

l5.16

Е. со1t содержащие эти плазмипы продуценты лейкоцитарного интерферона типа01-F человека, позволяют значительно увеличить выход интерферона - до 5 10 — 2 10 ед. актив» ности с 1 л бактериальной суспензии.

Свойства штаммов-продуцентов лейкоцитарного интерферонас .- " человека, содержащих рекомбинантные плазмиды серии р1-74 -Ft> p

Е,coli/plFN -F trpl I96IM В 2885 АААААСССТАТСССССААТТС АТС

5 -10 ед/л

5 10 ед/л

2 -1О ед/л

Е.coli/plFN-ф-F 1грЗ ЦИПИ В 2887 AAAAAGGGTATCGCCAC ATG Е.coli/ðlFN-а(-Р trp4 ЦИПИ В 2888 AAAAAGGGTATCGCCA ATG

Е.co1i/plFN -F trp5 ЦИПИ В 2889 AAAAAGGGAATTC ATG ю

5 10 ед/л

323 I IO

ATC Т6Т ТСТ CN QQC ТОГ GAT CTQ CCT CAG АСС САС AGC CTQ CGT AAT ACG

LCe-eye-Ser-йи-jbj-CY8-АЗР-g0 PRO-САН THE-ÍÓ-SN-1.ЕОФУ-ЯН-ARC20 30

AGG GCC TTG АТА СТС CTG 6СА, САА ATG GGA AGA АТС ТСТ ССТ TTC TCC TGC CTG AAG GAC

ЯО ALA-LEU ILE-LEU-LEU-ALA-GIN-MET-GLY-ARG-ILE-SER-PRO-PHE-SER-CYS-LEU-ЬТВ-ASP55-IOS

I06-165

40 50

ЛЯА CAT GAC ТТТ GGA ТТС ССС CAG GAG GQG ТТТ GAT GGC ААС CAG ТТС CAG AAG 6СТ САА

ARG-HYS-АВР-PHE-GLY-PHE-PRO-GLN ВЬУ-GLU-РНЕ-ASI .GLY-ASN-GLN"PHE- GLN-LYS-ALA-GLN166-226

60 70

GCC AT : ТСТ 6ТС ".ТС САТ GAG ATG, .TC CAG CAG АСС ТТС ААТ СТС ТТС AGC АСА AAG GAC

ALA-ILi,"ЗБЗ-7АЬ- ЕД-НТ$-GLU MET ILE-GLN-GLN-THR-РНЕ-,АВИ-LEU PHE-SER-ТНМУВ-АВР227-286

80 -90

ТСА ТСТ СCT АСТ T(G GAA CAG AGC СТС CTA GAA AAA ТТТ TCC ACT GAA СТТ ААС CAG CAG

SER-SER- ILATHR-TRP-GLU«GLN-SER-LEU-LEU-GLU-LYS-PHE-SER-THR-GLU-LEU-ASN.-GLN-GLN287.-346

I00 II0

CTG ААТ GAC CTG САА GCC TGC GTG ATA CAG GAG GTT GGG GTG GAA GAG АСТ ССС CTG ATG

LEU-АВМ-ASP-LEU-GLU-ALA CYS-VAL-ILE-GLN-GLU-VAL-,GLY-VAL-GLU-GLU-THR-PRO-IEU-MET347-406

I20 130

AAT GTG САС .ТСС АТС CTG ССТ GTG AAG AAA ТАС TTC CAA ACA ATC АСТ СТТ ТАТ CTG АСА

ASN-VAL-ASP-SER-ILE-ЬЕ&АЫ-VAL-LYS-LYS-TYR-PHE-GLN-ARG-ILE"THR-LEU-ТИ-ЬЕУ-THR407-466

I40 I50

GAG AAG ААА ТАС AGC ССТ TGT GCC TGG GAG GTT GTC AGA GCA GAA АТС ATG AGA ТСС TTC

GLU-LYS-LYS-TYR-SER-PRO-CYS-ALA-TRP-GLU-VAL-VAL-ARG-ALA-GLU-ILE-MET-ARG-SER-PHE-!

I60 I66 .

ТСТ ТТА ТСА AAA АТТ ТТТ САА GAA AGA ТТА AGG AGG AAG GAA TAA АСТС

SER-LEU-SER-LYS-ILE-PHE-GLN-GLU-ARG-LEU-ARG-ARG-LYS-GLU ter

%us.1

467-526

527-575

Ж.coli/plFN-4-F trp2 ЦИПИ В 2886 AAAAAGGGTATCGCGGAATTAATTC ATG 5.10 ед/л

)144376 ныла абаи ЗА $аи ЗА

$аи И

ЕСОР! ф f«t CYS 4SP LEtf

AATTC ATG TGT GAT CTG

G ТАС ACACTAS АС

Sau3A

$ои3А

-Leu Giy CYS

- CTG GGC TGT

- GAC CCGACA

EcoRI ф Г Met CYS

ААТТС ATG T CfT

8 ТАС АСА

ЕО

CTG

АС

Sau ЗА

Е0

TG

АС

Il44376

1144376.

1144376

Есор бсо@

PstI

Hir1d Ц1

$аЦ

Barn I

Рчиц

Rl и 5al I

Тс", транарорииро3аеь i сН

TTTcTGCT

Есо Ri

П

Hind Ш

Фиг. 5

Составитель В. Кузьмичев

Редактор П. Горькова Техред Т.Дубннчак Корректор Л. Пилипенко

Заказ 10)5/1 Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий, 113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4