Способ получения фосфопротеинфосфатазы

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОПРОТЕИНФОСФАТАЗЫ , включающий экстракцию солевыми растворами тканей животного происхождения, диализ и фракционирование , отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и сокращения времени его получения,экстракцию проводят 0,4 М натрий-ацетатным буфером, ,рН 5,8,а фракционирование осуществля1ют на фосфоцеллюлозе и конкакавалинА-сефарозе 4В. СоОержанив белка ме/мл f,O М

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPGHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (56) Комкова А.И., Иежеевский Т.А., Федорова Н.А. Фосфопротеинфосфатаза из селезенки Lâèíbè. Биохимия, 28, вып.3, 1963, 482-485.

Антидиоать, % а, 50

0,2

04 0,6 0,8 f,0 М (21) 3689854/28-14 (22) 06.01.84 (46) 30.09.85, Бюл. Ф 36 (72) А.И. Комкова, Л. Е.Леонова и В.И.Резяпкин (71) ЛГУ им. А.А.Жданова (53) 612.398.145.4(088 ° 8) „„Я0„„1182078 A (St14 С 12 N 9/00 // А 61 К 37/54 (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОПРОТЕИНФОСФАТАЗЫ, включающий экстракцию солевыми растворами тканей животного происхождения, диализ и фракционирование, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и сокращения времени его получения,экстракцию проводят

0,4 M натрий-ацетатным буфером, ;рН 5,8,а фракционирование осуществля ют на фосфоцеллюлозе и конкакавалинА-сефарозе 4В.

1 118

Изобретение относится к биохимии, в частности к способам извлечения ферментов (энзимов),и может быть использовано для получения препаративного средства в клинической и экспе-, 5 риментальной медицине,а также в фармакологической промьппленности.

Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта и сокращение времени его получения. 10

Способ осуществляют следующим образом.

Выделяют ядра клеток, фосфопротеинфосфатазу экстрагируют солевыми растворами, диализуют и фракционируют15 на различных носителях. В качестве экстрагирующего агента используют

0,4 M Na-ацетатный буфер рН 5,8.

На чертеже отражена зависимость величины экстракции фосфопротеинфосфатазы и балластных белков от ионной силы и солевого состава экстрагирующего раствора.

На левой оси ординат отложены величины фосфопротеинфосфатазной актив25 ности (.), на правой — содержание белка (мг/мл); по оси абсцисс — молярность используемых экстрагирующих растворов. Кроме того, представлены данные об экстракции из ядер клеток селезенки фосфопротеинфосфатазы

30 (кривые I,III) и белка (кривые II, 1У) при использовании Na-ацетатного буфера разной молярности (кривые, I>

II) или 0,2 M Na-ацетатного буфера с добавлением хлористого натрия (кри-35 вые III,1Ó).

Использование 0,4 M Na-ацетатного буфера рН 5,8 позволяет избирательно экстрагировать узкую фракцию 40 белков, в том,числе и фосфопротеинфосфатазу и одновременно снижает выход балластных белков, извлечение которых значительно возрастает при добавлении хлористого. натрия ° Кро- 45 ме того, исключение NaCI из экстрагирующего раствора позволяет далее проводить работу с экстрактом без дополнительного удаления соли длительным диализом. Для очистки фосфо- 50 протеинфосфатаэы используют афинные сорбенты — фосфоцеллюлоза и конканавалин-А-сефароза 4В.

Пример. Свежеэамороженная селезенка быка (2,5 кг), сохраняемая 55 при -20 С, размораживалась при комнатной температуре. Выделяли ядра клеток. Осадок ядер (600 мл) промы2О78 2 вали перед экстракцией 0,2 M Na-ацетатным буфером рН 5,8, Все процедуры выделения ядер и фосфопротеинфосфатазы проводили при

0-4 С. Осадок ядер гомо генизировали в растворе 0,4 M. Na-ацетатного буфера рН 5,8 в размельчителе тканей

PT-1 в течение 15 мин при 8000 об/мин; соотношение осадка ядер и раствора

1:5. Гомогенат ядер оставляли на

12-14 ч в холодильнике и затем центрифугировали в течение 30 мин при

2500 С. Для полного извлечения фермента из ядер экстракцию проводили 3-5 раз. Экстракты объединяли и разводили дистиллированной во-. дой до конечной концентрации Na-ацетатного буфера рН 5,8 — 0,3 М. К раз— веденному экстракту добавляли фосфоцеллюлозу (200 мл) в Н вЂ” форме.

Смесь тщательно перемешивали и оставляли на 30 мин. После отстаивания насадочная жидкость сливалась, фосфоцеллюлозу промывали 3 раза 5 л 0,3 M

Na-ацетатного буфера рН 5,8 и поме-

1 щали в хроматографическую колочку (4х17 см). Колонку промывали 0,3 М

Na-ацетатным буфером рН 5,8 (2л) до полного удаления несвязавшегося белка. Фосфопротеинфосфатазу элюировали 1 М Na-ацетатным буфером рН 5,8.

Элюат (500 мл) диализовали против дистиллированной воды до конечной концентрации Иа-ацетатного буфера рН 5,80,2 M.Диализат центрифугировали в течение 30 мин при 2500 G,îñàäîê отбрасывали. Затем проводили повторную хроматографию фосфопротеинфосфатазы на фосфоцеллюлозной колонке (1,6х25 см) ° Условия сорбции, промывки и элюции фермента аналогичны первой хроматографии на.фосфоцеллюлозе.

Элюат (40 мл) после пов орной хроматографии на фосфоцеллюлозе фракционировали на сефадексе G -75 (размер колонки 3,5х 80 cM), уравновешенном 0,3 M Na-ацетатным буфером рН 5,8, Фосфопротеинфосфатазу выделяли с объемом элюции 365 мл. Фермент после гель-хроматографии подвергали дальнейшей очистке методом аффинной хроматографии на конканавалин-А-сефарозе 4В (размер колонки 1,5 х 4 см), уравновешенной 0,3 M Na-ацетатным буфером рН 5,8. Колонку промывали этим же буфером (300 мл), фосфопротеинфосфатазу элюировали раствором

0,5 М маннозида в 0,3 M Na-ацетатном буфере рН 5,8 (15 мл конечного продук182078 4 ампулах при -20 C. Постадийная характеристика спо< оба сведена н табл. 1.

Таблица 1 г

Удельная Степень актив" очистки

Выход, Х

Этапы очист—

Общая активКоличество белка мг

I ки ность, ед./мг ность, ед.

100

0,8

11250

11000,0

345,0

Экстракт

18,0

6225

Фосфоцеллюлоза1

74

59,0

3150

53,0

Фосфоцеллюлоза

214

2400 171, 0

14,0

Сефадекс

G -75

Конканавалин-А-сефароза 4В

1596 1330, О 1663

1,2

Из табл, 1 видно, что из 2,5 кг селезенки быка удается выделить

1,2 мг очищенного продукта. Выделенный препарат фосфопротеинфосфатазы очищен в 1663 раза и обладает щ удельной активностью 1330 ед.

Выход фермента после конечного этапа очистки составлял 14Х. Электрофорез проводят в трубках 0,6х10,5 см35 в течение 3 ч при силе тока 5 мА на трубку. Местоположение фосфопротеинфосфатазы выявляют по образованию окрашенного комплекса а -нафтола с прочным синим Б. Для этого гели 40 инкубируют в 0,1 М цитратном буфере рН 5,8, содержащем 0,15 мг/мл прочного синего Б и 0,5 мг/мл — нафl

Источник фермента

Характеристика

Ядра селезенки бы- Ядра печвни быка ка (предлагаемый (12) способ) Количество этапов очистки

1,7

Выход конечного продукта (О) 3 1 та) . Препарат сохраняет активность более 2 лет при хранении в запаянных тилфосфата в течение 30 мин при

37 С. Белки в гелях окрашивают раствором, содержащим О, 1Х Кумасси бриллиантового голубого G — 250, 7Х уксусной кислоты и 25Х изопропанола, в течение 1-4 ч.Гомогенность конечного продукта выявляют методом двойной иммунодиффузии.

Мол. масса фосфопротеинфосфатазы> определенная методом диск-электро-,,фореза в нативных условиях и .методом гель-хроматографии на сефадексе, G -75, составляет 33500 дальтон.

Для наглядности эффективности предлагаемого метода по сравнению с известным (12) в табл. 2 представ лены некоторые характеристики конечного продукта.

1 Таблица 2

1182078

Продолжение табл.2

Источник фермента

Характеристика

Ядра печени быка

Ядра селезенки быка (предлагаемый способ) 112) 1663

Степень очистки

845

Гомогенность

Индивидуальный белок

Индивидуальный белок

0,090 (субстрат фосфоказеин) Активность мМ/мг"" мин

0,121 (субстрат Р-ги .тон Н ) 32

33500

1"1ол. масса, дальтон

34000

Содержание углеводов, 7.

Не определяли

5,8-6,0 (субстрат фосфоказеина) рН-оптимум

7,0 (субстрат фосфофорилааа а) Ингибиторы

N — Э т ил мале и нимид

I и-Хлормеркурибензоат фторид йатрия

Активаторы

Аскорбиновая кислота

2-Меркантоэтанол

Дитиотреитол

Составитель M.Íoýíÿê

Редактор Н.Швьщкая Техред Ж.Кастелевич Корректор M.Ñàìáîðñêàÿ

Заказ 6069/26 Тираж 524 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д, 4/5 филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Технико-экономическая эффективность способа получения фосфопротеин40 фосфатазы по сравнению с известным заключается в значительном увеличении выхода конечного продукта (3-4 раза), упрощение процесса за счет сокращения числа этапов с 11 до 4 (из процесса исключены фракционирование

45 осаждением сернокислым аммонием, этиловым спиртом н ряд стадий ионообменной хроматографии, многочасовые диализы перед этапами ионообменной хроматографии) и сокращения времени процедуры вьщеления, что особенно важно для вьщеления нативных биологически активных препаратов ферментов .